Name: growth and characterization of irradiated organoids from mammary glands
Uploaded: 2019-05-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands at JoVE.com

Vi takker Dr. Laura L. Bronsart for at levere GFP og dTomato-mærkede RAW 264,7 makrofager. Denne forskning blev støttet finansielt af NIH Grant #R00CA201304.

Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer og protokoller godkendt af Vanderbilt University institutionelle Animal Care og use udvalget.
1. forberedelse af mus og celle erhvervelse (tilpasset fra Nguyen-Ngoc et al.11)
<ol><li>Ofrer athymiske nu/nu-mus (8-10 uger gamle) ved hjælp af CO2 -kvælning efterfulgt af cervikal dislokation. Rengør huden med 70% ethanol.</li>
	<li>Reect mave-og lyske brystkirtler fra mus ved h...

<ol>
	<li>Lautner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disparities+in+the+Use+of+Breast-Conserving+Therapy+Among+Patients+With+Early-Stage+Breast+Cancer.">Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer.</a> Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).</li><li>Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregional+recurrence+after+breast+cancer+surgery+a+systematic+review+by+receptor+phenotype.">Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).</li><li>Kim, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Self-Seeding+by+Circulating+Cancer+Cells.">Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells.</a> Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).</li><li>Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Circulating+Breast+Cancer+Cells+Is+Stimulated+by+Radiotherapy.">Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy.</a> Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).</li><li>Rafat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Promote+Circulating+Tumor+Cell-Mediated+Local+Recurrence+following+Radiotherapy+in+Immunosuppressed+Patients.">Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients.</a> Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+Experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li><li>Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interplay+of+matrix+metalloproteinases,+morphogens+and+growth+factors+is+necessary+for+branching+of+mammary+epithelial+cells.">The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells.</a> Development. 128, 3117-3131 (2001).</li><li>Shamir, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist1-induced+dissemination+preserves+epithelial+identity+and+requires+E-cadherin.">Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin.</a> Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).</li><li>Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+Epithelial+Migration+and+Cell+Rearrangements+Drive+Mammary+Branching+Morphogenesis.">Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis.</a> Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+microenvironment+regulates+collective+migration+and+local+dissemination+in+normal+and+malignant+mammary+epithelium.">ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. -. V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Culture+Assays+of+Murine+Mammary+Branching+Morphogenesis+and+Epithelial+Invasion.">3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion.</a> Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).</li><li>Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+mammary+organoids+for+long-term+time-lapse+imaging.">Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews. , (2018).</li><li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+Cells+Regulate+Pulmonary+Metastasis+of+Mammary+Carcinomas+by+Enhancing+Protumor+Properties+of+Macrophages.">CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages.</a> Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).</li><li>Plaks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+Immune+Regulation+of+Mammary+Postnatal+Organogenesis.">Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis.</a> Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).</li><li>Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Proteinase+and+Collagenase+Fromcl.+Histolyticum.">Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum.</a> The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).</li><li>Mandl, I., Zaffuto, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serological+Evidence+for+a+Specific+Clostridium+histolyticum+Geltinase.">Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase.</a> The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).</li><li>Bond, M. D., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Individual+Collagenases+from+Clostridium+histolyticum.">Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum.</a> Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+estrogen-responsive+mouse+mammary+organoids+from+single+Lgr5+cells.">Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells.</a> Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).</li><li>Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+human+breast+tissues+from+patient+cells+in+3D+hydrogel+scaffolds.">Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds.</a> Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).</li><li>Richert, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+mouse+mammary+gland+development.">An atlas of mouse mammary gland development.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).</li><li>Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathways+in+response+to+ionizing+radiation+and+their+targetability+for+tumor+radiosensitization.">Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).</li><li>LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Human+Reduction+Mammoplasty+and+Mastectomy+Tissues+for+Cell+Culture.">Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).</li><li>Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3-D+in+vitro+co-culture+model+of+mammary+gland+involution.">A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution.</a> Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).</li><li>Chanson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells.">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).</li><li>Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+roles+for+macrophages+in+ovarian+cycle-associated+development+and+remodelling+of+the+mammary+gland+epithelium.">Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium.</a> Development. 137, 4229-4238 (2010).</li><li>Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+Adipocyte+Differentiation.">Understanding Adipocyte Differentiation.</a> Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).</li><li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Methods+of+Adipogenic+Differentiation+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li><li>Gabry&#347;, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+Effects+on+the+Cytoskeleton+of+Endothelial+Cells+and+Endothelial+Monolayer+Permeability.">Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).</li><li>Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations+for+long-term+time-lapse+imaging+of+epithelial+morphogenesis+in+three-dimensional+organotypic+cultures.">Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+M1/M2+ratio+of+tumor-associated+macrophages+is+associated+with+extended+survival+in+ovarian+cancer+patients.">A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients.</a> Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).</li><li>Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+M1+form+of+tumor-associated+macrophages+in+non-small+cell+lung+cancer+is+positively+associated+with+survival+time.">The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time.</a> BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).</li></ol>

I denne protokol har vi udviklet en metode til reproducerbar vækst og karakterisering af bestrålede mælke organoider (figur 1). En bestrålingsdosis på 20 Gy blev anvendt til at spejle tidligere in vivo-modeller af tumor celle rekruttering5. Bestråling af brystkirtler ex vivo før organoid dannelse tilladt for isolering af stråling skader virkninger uden en tilsvarende infiltration af immunceller. Udviklingen af en in vitro-bestrålet normal vævs model muliggø...

Ca. 60% af de tredobbelte negative brystkræftpatienter (TNBC) vælger amnings behandling (BCT) som en form for behandling1. I denne behandling modalitet fjernes tumoren, der indeholder en del af brystvæv, og det omgivende normale væv udsættes for ioniserende stråling for at dræbe eventuelle resterende tumorceller. Behandling reducerer recidiv i en stor del af brystkræft populationen; Men, ca. 13,5% af behandlede patienter med TNBC erfaring lokoregional gentagelser2. Derfor, studere hvordan stråling kan rekruttere cirkulerende tumorceller (ctc'er) vil føre til vigtig indsigt i lokal gentagelse3,4.
Tidligere arbejde har vist, at stråling af det normale væv øger rekrutteringen af forskellige celletyper5. I prækliniske modeller af TNBC, bestråling af normale væv øget makrofag og efterfølgende tumor celle rekruttering til normale væv5. Immunstatus påvirkede tumor celle rekruttering til bestrålede steder, med tumor celle migration observeret hos immunkompromitterede forsøgspersoner. Rekapitulating disse interaktioner ved hjælp af organoider afledt af brystkirtler vil gøre det muligt observation af celle migration og celle-stromale interaktioner i realtid med mikroskopi og levende celle Imaging til at bestemme den rolle, stråling skader i at ændre tumor celle adfærd.
Muse bryst organoider har hjulpet med at belyse vigtige trin i udviklingen af brystkirtlen. En bryst organoid er en flercellet, tredimensionel konstruktion af isoleret bryst Epitelet, der er større end 50 μm6,7,8,9,10. Ved brug af primære epitelial organoider evaluerede Simian et al. de nødvendige faktorer for forgreningen i brystkirtlen7. Shamir et al. opdagede, at spredning kan ske uden en epitel til mesenkymale overgang, giver indsigt i den metastatiske kaskade8. Metoder til generering og karakterisering af organoider fra mælke kirtlens væv er veletablerede6,11,12,13. Men til vores viden, metoder til dyrkning af bestrålede organoider fra brystkirtler er ikke blevet rapporteret. En protokol til dyrkning og karakterisering af bestrålede organoider ville være et kritisk skridt i at rekapitulere stråling-induceret immun og tumor celle rekruttering.
I dette dokument rapporterer vi om en metode til dyrkning og karakterisering af bestrålede bryst epitelial organoider i lave vedhæftnings mikroplader belagt med en hydrofile polymer, der understøtter dannelsen af sfæroider. Disse organoider blev co-kuleret med makrofager at undersøge immuncelle infiltration kinetik. Dette arbejde kan udvides til at omfatte Co-culturing organoider med fedtvæv celler til at rekapitulere bryst egenskaber, brystkræft celler til at visualisere tumor celle rekruttering, og CD8 + T celler til at studere tumor-immuncelle interaktioner. Tidligere etablerede protokoller kan anvendes til vurdering af bestrålede organoider. Tidligere modeller, der co-kulerer mælke-organoider og immunceller har kaste lys over mekanismer af metastaser og formidling. Denardo et al. fandt, at CD4 + T-celle reguleringen af tumor associerede makrofager forstærkede en metastatisk fænotype af bryst adenocarcinomer14. Samkulturmodeller er også blevet brugt til at belyse mekanismerne for biologisk udvikling. Plaks et al. præciserede betydningen af CD4 + T-celler som ned-regulatorer af bryst organogenesen15. Men vores gruppe er den første til at etablere en procedure for at visualisere, hvordan normal vævs bestråling påvirker immuncelle adfærd. Fordi normal vævs bestråling har vist sig at forbedre tumor celle rekruttering5, denne protokol kan videreudvikles til at analysere, hvordan tumor celle adfærd er ændret ved bestråling af normale væv og celler, hvilket fører til en større forståelse af kræft.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 14</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab181595</td>
			<td>Lot: GR3200524-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Cadherin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>24E10</td>
			<td>Lot: 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td>green 
			Lot: GR3203000-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150080</td>
			<td>red 
			Lot: GR3192711-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>62249</td>
			<td>Lot: TG2611041</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (10 mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclon Sphera 96 well plates</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>174927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab176757</td>
			<td>Lot: GR3214582-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tight Junction Protein 1</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP1-85047</td>
			<td>Lot: C115428</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>27250-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growth and characterization of irradiated organoids from mammary glands

Organoider afledt af det fordøjet væv er fler cellulære tredimensionale (3D) konstruktioner, der bedre rekapitulere in vivo betingelser end celle monolayers. Selv om de ikke helt kan model in vivo kompleksitet, de bevarer nogle funktionalitet af det oprindelige organ. I kræft modeller, organoider er almindeligt anvendt til at studere tumor celle invasion. Denne protokol har til formål at udvikle og karakterisere organoider fra den normale og bestrålede muse brystkirtler væv til at evaluere stråling respons i normale væv. Disse organoider kan anvendes til fremtidige in vitro Cancer undersøgelser for at evaluere tumor celle interaktioner med bestrålede organoider. Mælkekirtler blev påvirket, bestrålet med 20 Gy og fordøjet i en kollagenase VIII-opløsning. Epitelial organoider blev adskilt via centrifugal differentiering, og 3D organoider blev udviklet i 96-godt lav-vedhæftning mikroplader. Organoider udtrykte den karakteristiske epitelial markør cytokeratin 14. Makrofag interaktion med organoider blev observeret i co-kultur eksperimenter. Denne model kan være nyttig til at studere tumor-stromale interaktioner, infiltration af immunceller, og makrofag polarisering inden for et bestrålet mikromiljø.

Bestrålede epitelial organoider blev med held indhentet fra muse brystkirtler, forarbejdet og dyrket på plader med lav vedhæftning (figur 1). Organoid-udbyttet blev testet ved såning i forskellige vækst miljøer (figur 2a-G). Seeding celler direkte på vævskultur behandlet 10 cm celle plader gav en overvækst af fibroblast celler. Fibroblaster blev identificeret under fasekontrast mikroskopi i eller nær samme plan af fokus som organoider, og de voksede hurtigt ud af b...

Watch this Scientific Journal Video about Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands at JoVE.com

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Organoider udviklet fra muse brystkirtler blev bestrålet og karakteriseret til at vurdere epiteliale træk og interaktioner med immunceller. Bestrålede organoider kan bruges til bedre at evaluere celle celle interaktioner, der kan føre til tumor celle rekruttering i bestrålet normalt væv.

Vækst og karakterisering af bestrålede Organoider fra mælkekirtler

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Denne protokol kan bruges og videreudvikles til at analysere, hvordan iionisering stråling påvirker tumor celle rekruttering, fører til en større forståelse af kræft tilbagefald. Mammary organoids er kraftfulde modeller. De efterligner grundlæggende in vivo egenskaber, men de giver mulighed for nem isolering af biologiske variabler.Brug af lav-vedhæftning plader negerer arbejdsflow udfordringer forbundet med protein matricer. Triple-negative brystkræftpatienter oplever lokale regionale tilbagefald ved højere satser efter behandling. Undersøgelse af, hvordan stråling påvirker tumor og immuncelle adfærd vil føre til vigtig indsigt i recidiv mekanismer.Demonstration konfokal mikroskopi af organoids er Javier Gomez, en kandidat studerende i Silvera Batista lab. Begynd denne procedure med fjernelse af abdominal og lyskeagtige mælkekirtler fra ofrede mus som beskrevet i tekstprotokollen. 45 minutter efter bestråling af prøverne som beskrevet i tekstprotokollen, skal du placere mælkekirtlerne i en 35-millimeter steril celleplade og hakkekød med skalpeller.Hakkekød med ca 40 slag, indtil vævet slapper af og stykker er opnået, der ikke er større end ca. en kvadrat millimeter i området. Overfør nu vævet til kollagenopløsning i et 50-milliliter centrifugerør. Brug 10 milliliter kollagenopløsning pr. mus.Placer prøverørene i et vandbad i 30 til 60 minutter ved 37 grader Celsius, vortexing i fem sekunder hver 10 minutter. Fordøjelsen er færdig, når kollagenaseopløsningen er uklar. Drej den fordøjede opløsning ned ved 450 gange G i 10 minutter ved stuetemperatur.Nu er tre lag observeret. Supernatanten er sammensat af fedt, det midterste lag er en vandig opløsning, og bunden er en pellet. Pellet vises rød, da det er en blanding af epitelceller, individuelle stromale celler, og røde blodlegemer.Forfrakke alle pipetter, pipettespidser og centrifugerør med BSA-opløsning før kontakt ved tilsætning og fjernelse af BSA-opløsning. BSA-opløsningen kan genbruges, selv om den skal sterilfiltrere før hvert eksperiment. For yderligere genvinding overføres supernatanten til et frisk BSA-belagt 15 milliliterrør.Pipette op og ned kraftigt at sprede fedt lag. Centrifuge prøven ved 450-gange-G i 10 minutter ved stuetemperatur. Inspirer supernatanten, og efterslæb en lille mængde medier i røret for at undgå at aspirere cellepellet.Nu aspirere det vandige lag fra røret med den oprindelige pellet. Der tilsættes 10 milliliter DMEM/F12 til røret med den originale pellet, og overføres til det andet rør. Pipette kraftigt at kombinere og resuspendere de to pellets.Efter centrifugering ved 450 gange G i 10 minutter ved stuetemperatur, aspirere supernatant og tilsæt fire milliliter DMEM/F12 til røret. Der tilsættes 40 mikroliter deoxyribonuclease til suspensionen, og ryst forsigtigt i hånden i to til fem minutter ved stuetemperatur. Tilsæt seks milliliter DMEM/F12 og pipette grundigt.Efter centrifugering af røret ved 450 gange G i 10 minutter ved stuetemperatur, aspirere supernatanten til 0,5-millilitermærket. Opsplit pellet i 10 milliliter DMEM/F12 og pipette grundigt. Nu centrifuge røret ved pulserende til 450-gange-G og stoppe fire sekunder efter at have nået denne hastighed.Gentag vasketrinnene tre gange mere for at rense organoider via centrifugaldifferentiering. Pellet bør nu være en off-white farve, der består af kun epitelorganoider. Opsplitning af pellet i 10 milliliter DMEM/F12.Pipette grundigt for at skabe en homogen løsning. Overfør 50 mikroliter til en 30-millimeter petriskål og se under et fasekontrastmikroskop ved 20X. Tæl antallet af organoider med en tæller.Pipette 50 mikroliter af organoider i hver brønd af en lav-adhæsion plade. Der tilsættes 150 mikroliter organoid medium for at bringe det samlede arbejdsvolumen op på 200 mikroliter. Udskift forsigtigt mediet hver anden dag.Vedligehold GFP eller D-tomat-mærket rå 264,7 makrofager i DMEM medier suppleret med 10% FPS og 1% penicillin-streptomycin. Frø cellerne ind i organoidmediet ved den ønskede tæthed. Brug levende cellefasekontrast og fluorescerende billeddannelse til at overvåge makrofaginfiltration over tid.Fjern organoid medium fra brøndene ved omhyggeligt at aspirere. Fix prøverne med 10% neutral-buffered formalin i 15 minutter ved stuetemperatur. De faste organoider vaskes tre gange i fem minutter i 1X PBS.Hvis det ønskes, kan faste prøver opbevares ved fire grader Celsius i en uge for yderligere farvning. Efter vask, permeabilize de faste organoids i fem minutter. De faste organoider med 5 % normalt gedeserum i 0,1 % PBST i en time ved stuetemperatur, før de vaskes tre gange i fem minutter med PBS.Inkuber de faste organoider med anti-cytokeratin-14, E-cadherin eller stramt kryds protein en, i 1% NGS i PBST i en time ved stuetemperatur. Derefter vaskes tre gange i fem minutter i PBST. Nu inkubere organoider med ged anti-kanin sekundære antistof med 1% NGS PBST i en time ved stuetemperatur.Dæk med folie for at undgå lyseksponering. Efter vask som før, bruge den nukleare farvestof til at plette kerner i cirka en halv time. De farvede organoider vaskes i fem minutter i PBS tre gange.Hvis du bruger et kammerslide, skal du montere med en dæksel. Opbevar organoiderne pakket ind i folie ved fire grader Celsius i op til to uger. Bestrålede organoider kunne dyrkes i lav-adhæsion plader, eller i kælderen membran, men den hurtigste vækst opstod i lav-vedhæftning plader.Organoider opsummerede mælkekirtlens egenskaber. Konstruktioner, der er morfologisk ligner kanaler og lapper blev observeret. Væksttendenser viste, at når organoider straks blev seedet efter fordøjelsen og sorteringen, voksede ikke-bestrålede organoider hurtigere end bestrålede organoider, sandsynligvis på grund af cellevækstarholdning som følge af mekanismer til reparation af DNA-skader.Organoider udtrykte epitelegenskaber, som blev evalueret ved immunfluorescerende farvning. Bestrålede organoider udtrykt epitelmarkører. Cytokeratin-14, en markør for myoepithelium, blev udtrykt kraftigt på overfladen af bestrålede organoider.Derudover, E-cadherin og tight-junction protein ene blev udtrykt i cellulære kryds af organoider. Disse proteiner er afgørende for korrekt celle vedhæftning. Efter bestråling fortsatte organoider med at bevare deres epitelegenskaber.Fluorescerende farvning af organoider kan visualiseres i lav-adhæsion plader ved hjælp af fluorescens mikroskopi. Men den klareste visualisering blev opnået via konfokal mikroskopi. Korrigeret total fluorescens intensitet blev beregnet ved at trække baggrunden, og normalisere efter organoid område.Dyrkning organoider i 96-godt lav-adhæsion plader også forenklet co-kultur eksperimenter. Når seedet på koncentrationer typisk i mælkekirtlen, makrofag colocalization steget med bestrålede organoider. Når du udfører denne procedure, de vigtigste ting at huske er ikke at over-fordøje organoids, og til passende rense centrifugal differentiering.Efter denne procedure kan der udføres yderligere co-culture-eksperimenter. Organoider kan co-dyrkes med tumorceller, andre immunceller, og stromale celler til at genskabe bestrålet mikromiljø forbundet med gentagelse. Denne metode vil være vigtigt for at vurdere, hvordan normal vævsskade specifikt påvirker immuncelledynamik, og vil i sidste ende blive brugt til at forstå tumorcelle rekrutteringsmekanismer.Mælkeorganoider har belyst mekanismer af mælkekirtlen udvikling, og har robust opsummeret brystkræft in vitro. Vi håber, at vores model giver indsigt i stråling-induceret tumor celle rekruttering.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation og indvinding af β-celle Sfæroider Fra Step-vækst PEG-peptid hydrogeler

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

Et hormon-responsiv 3D Kultur Model af menneskelige mælkekirtler epitel

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Intraductal Delivery to the Rabbit Mammary Gland

Intraduktal Levering til kanin mælkekirtlerne

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and ...

Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

Fremstilling og karakterisering af hidtil ukendte HDL-imiterende nanopartikler til nervevækstfaktorindkapsling

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Mikrofluid Bioprinting for Engineering vaskulariserede væv og Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

Fremstilling og karakterisering af optiske væv Phantoms indeholdende Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Påvisning af Endotoxin i Nano-formuleringer bruger Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Focused Ion Beam Lithography to Etch Nano-architectures into Microelectrodes

Fokuseret Ionstrålithografi til etch Nano-arkitekturer i Mikroelektroderne

With advances in electronics and fabrication technology, intracortical microelectrodes have undergone substantial improvements enabling the production of ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Skalerbar generation af modne cerebellar organoider fra humane pluripotente stamceller og karakterisering ved immunstaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...