Name: growth and characterization of irradiated organoids from mammary glands
Uploaded: 2019-05-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands at JoVE.com

Wij danken Dr. Laura L. Bronsart voor het verstrekken van GFP en dTomato-gelabelde RAUWe 264,7 macrofagen. Dit onderzoek werd financieel gesteund door NIH Grant #R00CA201304.

Animal studies werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en protocollen goedgekeurd door de Vanderbilt University Institutional Animal Care en use Comite.
1. voorbereiding van muizen en cel aanwinst (aangepast van Nguyen-Ngoc et al.11)
<ol><li>Offer athymic nu/nu muizen (8-10 weken oud) met behulp van CO2 verstikking gevolgd door cervicale dislocatie. Reinig de huid met behulp van 70% ethanol.</li>
	<li>Resekte abdominale en Lie...

<ol>
	<li>Lautner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disparities+in+the+Use+of+Breast-Conserving+Therapy+Among+Patients+With+Early-Stage+Breast+Cancer.">Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer.</a> Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).</li><li>Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregional+recurrence+after+breast+cancer+surgery+a+systematic+review+by+receptor+phenotype.">Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).</li><li>Kim, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Self-Seeding+by+Circulating+Cancer+Cells.">Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells.</a> Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).</li><li>Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Circulating+Breast+Cancer+Cells+Is+Stimulated+by+Radiotherapy.">Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy.</a> Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).</li><li>Rafat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Promote+Circulating+Tumor+Cell-Mediated+Local+Recurrence+following+Radiotherapy+in+Immunosuppressed+Patients.">Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients.</a> Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+Experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li><li>Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interplay+of+matrix+metalloproteinases,+morphogens+and+growth+factors+is+necessary+for+branching+of+mammary+epithelial+cells.">The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells.</a> Development. 128, 3117-3131 (2001).</li><li>Shamir, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist1-induced+dissemination+preserves+epithelial+identity+and+requires+E-cadherin.">Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin.</a> Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).</li><li>Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+Epithelial+Migration+and+Cell+Rearrangements+Drive+Mammary+Branching+Morphogenesis.">Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis.</a> Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+microenvironment+regulates+collective+migration+and+local+dissemination+in+normal+and+malignant+mammary+epithelium.">ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. -. V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Culture+Assays+of+Murine+Mammary+Branching+Morphogenesis+and+Epithelial+Invasion.">3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion.</a> Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).</li><li>Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+mammary+organoids+for+long-term+time-lapse+imaging.">Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews. , (2018).</li><li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+Cells+Regulate+Pulmonary+Metastasis+of+Mammary+Carcinomas+by+Enhancing+Protumor+Properties+of+Macrophages.">CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages.</a> Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).</li><li>Plaks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+Immune+Regulation+of+Mammary+Postnatal+Organogenesis.">Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis.</a> Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).</li><li>Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Proteinase+and+Collagenase+Fromcl.+Histolyticum.">Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum.</a> The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).</li><li>Mandl, I., Zaffuto, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serological+Evidence+for+a+Specific+Clostridium+histolyticum+Geltinase.">Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase.</a> The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).</li><li>Bond, M. D., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Individual+Collagenases+from+Clostridium+histolyticum.">Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum.</a> Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+estrogen-responsive+mouse+mammary+organoids+from+single+Lgr5+cells.">Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells.</a> Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).</li><li>Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+human+breast+tissues+from+patient+cells+in+3D+hydrogel+scaffolds.">Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds.</a> Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).</li><li>Richert, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+mouse+mammary+gland+development.">An atlas of mouse mammary gland development.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).</li><li>Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathways+in+response+to+ionizing+radiation+and+their+targetability+for+tumor+radiosensitization.">Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).</li><li>LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Human+Reduction+Mammoplasty+and+Mastectomy+Tissues+for+Cell+Culture.">Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).</li><li>Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3-D+in+vitro+co-culture+model+of+mammary+gland+involution.">A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution.</a> Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).</li><li>Chanson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells.">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).</li><li>Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+roles+for+macrophages+in+ovarian+cycle-associated+development+and+remodelling+of+the+mammary+gland+epithelium.">Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium.</a> Development. 137, 4229-4238 (2010).</li><li>Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+Adipocyte+Differentiation.">Understanding Adipocyte Differentiation.</a> Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).</li><li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Methods+of+Adipogenic+Differentiation+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li><li>Gabry&#347;, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+Effects+on+the+Cytoskeleton+of+Endothelial+Cells+and+Endothelial+Monolayer+Permeability.">Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).</li><li>Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations+for+long-term+time-lapse+imaging+of+epithelial+morphogenesis+in+three-dimensional+organotypic+cultures.">Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+M1/M2+ratio+of+tumor-associated+macrophages+is+associated+with+extended+survival+in+ovarian+cancer+patients.">A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients.</a> Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).</li><li>Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+M1+form+of+tumor-associated+macrophages+in+non-small+cell+lung+cancer+is+positively+associated+with+survival+time.">The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time.</a> BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).</li></ol>

In dit protocol hebben we een methode ontwikkeld voor reproduceerbare groei en karakterisering van bestraalde borst organoids (Figuur 1). Een stralingsdosis van 20 GY werd toegepast op de spiegel vorige in vivo modellen van de cel van de tumor rekrutering5. Bestraling van de borstklieren ex vivo voorafgaand aan organite vorming toegestaan voor isolatie van stralingsschade effecten zonder een overeenkomstige infiltratie van het immuunsysteem cellen. De ontwikkeling van...

Ongeveer 60% van de drievoudige negatieve borstkanker (TNBC) patiënten kiezen voor borst-conserverende therapie (BCT) als een vorm van behandeling1. In deze behandeling modaliteit, de tumor die een deel van het borstweefsel wordt verwijderd, en de omliggende normale weefsel wordt blootgesteld aan ioniserende straling om eventuele resterende tumorcellen te doden. De behandeling vermindert herhaling in veel van de bevolking van borstkanker; echter, ongeveer 13,5% van de behandelde patiënten met TNBC ervaring locoregionale herhalingen2. Daarom, het bestuderen van hoe straling kan aanwerven circulerende tumorcellen (ctcs) zal leiden tot belangrijke inzichten in de lokale recidief3,4.
Het vorige werk heeft aangetoond dat de straling van het normale weefsel rekrutering van diverse cel types5verhoogt. In pre-klinische modellen van TNBC, bestraling van normaal weefsel toegenomen macrofagen en vervolgens tumor cel rekrutering tot normale weefsels5. De immune status beïnvloedde de rekrutering van de tumor cel aan bestraalde plaatsen, met de migratie van de tumor cel waargenomen in immuungecompromitteerde onderwerpen. Recapitulerend deze interacties met behulp van organoids afgeleid van de borstklieren zal de observatie van de cel migratie en cel-stromale interacties in real-time met microscopie en live cel beeldvorming om de rol van straling schade te bepalen in het veranderen tumor cel gedrag.
Muis borstklieren organoids hebben geholpen bij het ophelderen van de belangrijkste stappen in de ontwikkeling van de borstklier. Een borst organite is een multicellulaire, driedimensionale constructie van geïsoleerde borst epitheel dat groter is dan 50 μm6,7,8,9,10. Met behulp van primaire epitheel organoids, Simian et al. geëvalueerd noodzakelijke factoren voor vertakking in de borstklier7. Shamir et al. ontdekte dat de verspreiding kan plaatsvinden zonder een epitheel om mesenchymale overgang, het verstrekken van inzicht in de gemetastaseerde Cascade8. Methoden voor het genereren en karakteriseren organoids van de borstklier weefsel zijn goed ingeburgerd6,11,12,13. Nochtans, aan onze kennis, zijn de methodes om bestraalde organoids van borstklieren te kweken niet gemeld. Een protocol voor het kweken van en het kenmerken van bestraalde organoids zou een kritieke stap in Recapitulerend straling-veroorzaakte immune en de rekrutering van de tumor cel zijn.
In deze paper, rapporteren we een methode voor het kweken en karakteriseren bestraalde borstklier epitheel organoids in lage adhesie microplates bekleed met een hydrofiele polymeer dat de vorming van sferoïden ondersteunt. Deze organoids werden samen met macrofagen gekweekt om de kinetiek van infiltratie van de immune cel te onderzoeken. Dit werk kan worden uitgebreid tot co-kweken organoids met vetcellen te recapituleren borstklieren kenmerken, borstkanker cellen te visualiseren tumor cel aanwerving, en CD8 + T cellen te bestuderen tumor-immune cel interacties. Eerder vastgestelde protocollen kunnen worden gebruikt om bestraalde organoids te evalueren. Eerdere modellen co-kweken borstklieren organoids en immuun cellen hebben licht werpen op de mechanismen van metastase en verspreiding. Denardo et al. vond dat CD4 + T Cell regulering van tumorgeassocieerde macrofagen verbeterde een gemetastaseerde fenotype van de borst adenocarcinomen14. Er zijn ook cocultuur modellen gebruikt om mechanismen van biologische ontwikkeling te verhelderen. Plaks et al. verduidelijkte de rol van CD4 + T cellen als down-regulatoren van de borst organogenese15. Echter, onze groep is de eerste om een procedure van het visualiseren van hoe normaal weefsel straling invloeden immuun cel gedrag vast te stellen. Omdat normaal weefsel bestraling is aangetoond dat tumor cel rekrutering te verbeteren5, kan dit Protocol verder worden ontwikkeld om te analyseren hoe tumorcellen gedrag wordt gewijzigd door bestraling van normale weefsels en cellen, wat leidt tot een beter begrip van kanker recidief.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 14</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab181595</td>
			<td>Lot: GR3200524-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Cadherin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>24E10</td>
			<td>Lot: 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td>green 
			Lot: GR3203000-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150080</td>
			<td>red 
			Lot: GR3192711-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>62249</td>
			<td>Lot: TG2611041</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (10 mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclon Sphera 96 well plates</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>174927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab176757</td>
			<td>Lot: GR3214582-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tight Junction Protein 1</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP1-85047</td>
			<td>Lot: C115428</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>27250-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growth and characterization of irradiated organoids from mammary glands

Organoids afgeleid van het verteerd weefsel zijn multicellulaire driedimensionale (3D) constructies die beter recapituleren in vivo omstandigheden dan cel monolayers. Hoewel ze niet volledig kunnen modelleren in vivo complexiteit, behouden ze een aantal functionaliteit van het oorspronkelijke orgel. In kanker modellen, organoids worden vaak gebruikt om tumor cel invasie studie. Dit protocol beoogt te ontwikkelen en te karakteriseren organoids van de normale en bestraalde muis borstklier weefsel om de straling reactie in normale weefsels te evalueren. Deze organoids kunnen op toekomstige in vitro kanker studies worden toegepast om de interactie van de tumor cel met bestraalde organoids te evalueren. De borstklieren werden ontleed, bestraald tot 20 GY en verteerd in een Collagenase VIII oplossing. De epitheel organoids werden gescheiden via centrifugaal differentiatie, en 3D organoids werden ontwikkeld in 96-goed laag-adhesie microplaten. Organoids drukte de kenmerkende epitheel teller cytokeratine 14 uit. Macrofagen interactie met de organoids werd waargenomen in co-cultuur experimenten. Dit model kan nuttig zijn voor het bestuderen van tumor-stromale interacties, infiltratie van immune cellen, en de polarisatie van de macrofagen binnen een bestraald micro-milieu.

Bestraalde epitheel borsten organoids werden met succes verkregen van de muis borstklieren, verwerkt, en gekweekt op lage-adhesie platen (Figuur 1). Organite opbrengst werd getest door zaaien in verschillende groei omgevingen (Figuur 2a-G). Zaaien cellen direct op weefselcultuur behandeld 10 cm cel platen leverde een overgroei van fibroblast cellen. Fibroblasten werden geïdentificeerd onder fasecontrast microscopie in of in de buurt van hetzelfde vlak van de focus als organ...

Watch this Scientific Journal Video about Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands at JoVE.com

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Organoids ontwikkeld van muis borstklieren werden bestraald en gekarakteriseerd om epitheel eigenschappen en interacties met immuun cellen te beoordelen. Bestraalde organoids kan worden gebruikt om cel-cel interacties beter te evalueren die tot de rekrutering van de tumor cel in bestraald normaal weefsel kunnen leiden.

Groei en karakterisering van bestraalde Organoids van de borstklieren

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Dit protocol kan worden gebruikt en verder ontwikkeld om te analyseren hoe ioniserende straling de rekrutering van tumorcellen beïnvloedt, wat leidt tot een beter begrip van recidief van kanker. Borstorganoïden zijn krachtige modellen. Ze bootsen fundamentele in vivo kenmerken na, maar ze zorgen voor een eenvoudige isolatie van biologische variabelen.Het gebruik van lage-hechtingsplaten ontkent werk-flow uitdagingen in verband met eiwit matrices. Drievoudig negatieve borstkankerpatiënten ervaren lokale regionale recidief bij hogere tarieven na de behandeling. Het bestuderen van hoe straling beïnvloedt tumor en immuuncel gedrag zal leiden tot belangrijke inzichten in recidief mechanismen.Het aantonen van confocale microscopie van de organoïden is Javier Gomez, een afgestudeerde student in de Silvera Batista lab. Begin deze procedure met het verwijderen van buik- en inguinale borstklieren uit geofferde muizen zoals beschreven in het tekstprotocol. 45 minuten na bestraling van de monsters zoals beschreven in het tekstprotocol, plaats borstklieren in een 35-millimeter steriele celplaat en gehakt met scalpels.Mince met ongeveer 40 slagen tot het weefsel ontspant en stukken worden verkregen die niet groter zijn dan ongeveer een vierkante millimeter in het gebied. Breng het weefsel nu over naar collagenase oplossing in een 50-milliliter centrifugebuis. Gebruik 10 milliliter collagenase oplossing per muis.Plaats de monsterbuizen 30 tot 60 minuten in een waterbad bij 37 graden Celsius, waarbij elke 10 minuten vijf seconden wordt gevorceerd. De spijsvertering is voltooid wanneer de collagenase-oplossing troebel is. Draai de verteerde oplossing 10 minuten naar beneden bij 450-keer-G bij kamertemperatuur.Nu worden drie lagen waargenomen. De supernatant bestaat uit vet, de middelste laag is een waterige oplossing, en de bodem is een pellet. De pellet lijkt rood, want het is een mengsel van epitheliale cellen, individuele stromale cellen, en rode bloedcellen.Precoat alle pipetten, pipettips en centrifugebuizen met BSA-oplossing voorafgaand aan het contact door toevoeging en verwijdering van BSA-oplossing. BSA-oplossing kan worden hergebruikt, hoewel het voor elk experiment steriel moet worden gefilterd. Voor extra herstel, breng de supernatant naar een verse BSA-gecoate 15-milliliter buis.Pipet op en neer krachtig om de vetlaag te verspreiden. Centrifugeren het monster op 450-keer-G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Aspirate de supernatant, waardoor een kleine hoeveelheid media in de buis om te voorkomen dat aspirating de cel pellet.Nu aspirate de waterige laag uit de buis met de originele pellet. Voeg 10 milliliter DMEM/F12 toe aan de buis met de originele pellet en breng over naar de tweede buis. Pipette krachtig te combineren en resuspend de twee pellets.Na het centrifugeren op 450-keer-G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, aspirate de supernatant en voeg vier milliliter DMEM /F12 aan de buis. Voeg 40 microliter deoxyribonuclease toe aan de suspensie en schud voorzichtig twee tot vijf minuten met de hand bij kamertemperatuur. Voeg zes milliliter DMEM/F12 en pipet goed toe.Na het centrifugeren van de buis op 450-keer-G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, aspirate de supernatant aan de 0,5-milliliter merk. Resuspend de pellet in 10 milliliter DMEM/F12 en pipet grondig. Centrifuge nu de buis door te pulseren tot 450 keer-G en vier seconden te stoppen na het bereiken van die snelheid.Herhaal de wasstappen nog drie keer om organoïden te zuiveren via centrifugale differentiatie. De pellet moet nu een off-witte kleur bestaande uit alleen epitheliale organoïden. Resuspend de pellet in 10 milliliter DMEM/F12.Pipette grondig om een homogene oplossing te creëren. Breng 50 microliter over naar een petrischaal van 30 millimeter en bekijk onder een fasecontrastmicroscoop op 20X. Tel het aantal organoïden met een teller.Pipette 50 microliter organoïden in elke put van een lage hechtingsplaat. Voeg 150 microliter organoïde medium toe om het totale werkvolume op 200 microliters te brengen. Vervang het medium voorzichtig om de twee dagen.Houd GFP of D-tomaat-gelabeld raw 264.7 macrofagen in DMEM media aangevuld met 10% FPS en 1%penicilline-streptomycine. Zaad de cellen in het organoïde medium bij de gewenste dichtheid. Gebruik het contrast van de live celfase en fluorescerende beeldvorming om macrofaaginfiltratie in de loop van de tijd te controleren.Verwijder organoïde medium uit de putten door zorgvuldig aspirating. Bevestig de monsters met 10% neutraal gebufferd formaline gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Was de vaste organoïden drie keer gedurende vijf minuten in 1X PBS.Indien gewenst kunnen vaste monsters worden opgeslagen op vier graden Celsius voor een week voor verdere kleuring. Na het wassen, permeabiliseren van de vaste organoïden gedurende vijf minuten. Blokkeer de vaste organoïden met 5%normaal geitenserum in 0,1%PBST gedurende een uur bij kamertemperatuur voordat u drie keer vijf minuten met PBS wast.Incubeer de vaste organoïden met anti-cytokeratine-14, E-cadherine, of tight-junction eiwit een, in 1%NGS in PBST gedurende een uur bij kamertemperatuur. Was vervolgens drie keer gedurende vijf minuten in PBST. Nu incubeer de organoïden met geit anti-konijn secundaire antilichaam met 1%NGS PBST gedurende een uur bij kamertemperatuur.Dek af met folie om blootstelling aan licht te voorkomen. Na het wassen als voorheen, gebruik de nucleaire kleurstof om kernen vlek voor ongeveer een half uur. Was de gekleurde organoïden drie keer vijf minuten in PBS.Bij gebruik van een kamer schuif, monteren met een cover slip. Bewaar de organoïden verpakt in folie op vier graden Celsius voor maximaal twee weken. Bestraalde organoïden kunnen worden gekweekt in lage hechtingsplaten, of binnen keldermembraan, maar de snelste groei deed zich voor in platen met een lage hechting.Organoïden recapitulated borstklier kenmerken. Constructies die morfologisch vergelijkbaar zijn met kanalen en lobben werden waargenomen. Groeitrends wezen erop dat wanneer organoïden onmiddellijk werden gezaaid na de spijsvertering en sortering, niet-bestraalde organoïden sneller groeiden dan bestraalde organoïden, waarschijnlijk als gevolg van celgroeiarrestatie als gevolg van mechanismen van DNA-schadeherstel.Organoïden uitgedrukt epitheel kenmerken, die werden geëvalueerd door middel van immunofluorescente kleuring. Bestraalde organoïden uitgedrukt epitheliale markers. Cytokeratine-14, een marker van myoepithelium, werd sterk uitgedrukt op het oppervlak van bestraalde organoïden.Bovendien, E-cadherine en tight-junction eiwit een werden uitgedrukt in cellulaire knooppunten van organoïden. Deze eiwitten zijn essentieel voor een goede celhechting. Na bestraling bleven organoïden hun epitheliale kenmerken behouden.Fluorescerende kleuring van organoïden kan worden gevisualiseerd binnen lage hechtingsplaten met behulp van fluorescentiemicroscopie. Echter, de duidelijkste visualisatie werd verkregen via confocale microscopie. Gecorrigeerde totale fluorescentie intensiteit werd berekend door het aftrekken van de achtergrond, en normaliseren door organoïde gebied.Het kweken van organoïden in de 96-goed lage-adhesieplaten vereenvoudigde ook co-cultuurexperimenten. Wanneer gezaaid in concentraties typisch in de borstklier, macrofaag colocalisatie toegenomen met bestraalde organoïden. Bij het uitvoeren van deze procedure, de belangrijkste dingen om te onthouden zijn om niet te verteren de organoïden, en op de juiste manier zuiveren van de centrifugale differentiatie.Na deze procedure kunnen aanvullende co-cultuurexperimenten worden uitgevoerd. Organoïden kunnen worden co-gekweekt met tumorcellen, andere immuuncellen, en stromale cellen om de bestraalde micro-omgeving geassocieerd met recidief opnieuw. Deze methode zal belangrijk zijn voor de evaluatie van hoe normale weefselschade specifiek de immuunceldynamiek beïnvloedt en uiteindelijk zal worden gebruikt om tumorcelwervingsmechanismen te begrijpen.Borstorganoïden hebben opgehelderd mechanismen van borstklier ontwikkeling, en hebben robuust samengevat borstkanker in vitro. We hopen dat ons model inzichten biedt over door straling geïnduceerde tumorcelwerving.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Axon Stretch groei: de Mechanotransductie van neuronale groei

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generatie en terugwinning van β-cel sferoïden Van Step-groei PEG-peptide Hydrogelen

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

Een hormoon-responsieve 3D Cultuur Model van de Human borstklier epitheel

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Intraductal Delivery to the Rabbit Mammary Gland

Intraductale Levering aan de Rabbit borstklier

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and ...

Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

Voorbereiding en karakterisering van nieuwe HDL-nabootsende nanodeeltjes voor ingewikkelde zenuwgroei Factor

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Microfluidic Bioprinting voor Engineering gevacuoliseerd weefsels en Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

Fabricage en karakterisatie van optische weefsel Phantoms met macrostructuur

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detectie van endotoxinen in Nano-formuleringen gebruiken Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) testen

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Focused Ion Beam Lithography to Etch Nano-architectures into Microelectrodes

Gerichte ionen straal-lithografie voor etch nano-architecturen in micro elektroden

With advances in electronics and fabrication technology, intracortical microelectrodes have undergone substantial improvements enabling the production of ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Schaalbare generatie van volwassen cerebellar organoïden uit menselijke pluripotente stamcellen en karakterisering door immunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...