Name: growth and characterization of irradiated organoids from mammary glands
Uploaded: 2019-05-03T14:00:00
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Nous remercions le Dr Laura L. BRONSART d’avoir fourni des macrophages bruts 264,7 de GFP et de dTomato. Cette recherche a été financée financièrement par la subvention NIH #R00CA201304.

Des études sur les animaux ont été réalisées conformément aux directives et protocoles institutionnels approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Vanderbilt.
1. préparation des souris et acquisition de cellules (adapté de Nguyen-Ngoc et al.11)
<ol><li>Sacrifiez des souris nu/nu athymiques (8-10 semaines) en utilisant l’asphyxie du CO2 suivie d’une dislocation cervicale. Nettoyez la peau à...

<ol>
	<li>Lautner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disparities+in+the+Use+of+Breast-Conserving+Therapy+Among+Patients+With+Early-Stage+Breast+Cancer.">Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer.</a> Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).</li><li>Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregional+recurrence+after+breast+cancer+surgery+a+systematic+review+by+receptor+phenotype.">Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).</li><li>Kim, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Self-Seeding+by+Circulating+Cancer+Cells.">Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells.</a> Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).</li><li>Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Circulating+Breast+Cancer+Cells+Is+Stimulated+by+Radiotherapy.">Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy.</a> Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).</li><li>Rafat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Promote+Circulating+Tumor+Cell-Mediated+Local+Recurrence+following+Radiotherapy+in+Immunosuppressed+Patients.">Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients.</a> Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist1-induced+dissemination+preserves+epithelial+identity+and+requires+E-cadherin.">Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin.</a> Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).</li><li>Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+Epithelial+Migration+and+Cell+Rearrangements+Drive+Mammary+Branching+Morphogenesis.">Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis.</a> Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+microenvironment+regulates+collective+migration+and+local+dissemination+in+normal+and+malignant+mammary+epithelium.">ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. -. V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Culture+Assays+of+Murine+Mammary+Branching+Morphogenesis+and+Epithelial+Invasion.">3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion.</a> Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).</li><li>Ewald, A. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+Cells+Regulate+Pulmonary+Metastasis+of+Mammary+Carcinomas+by+Enhancing+Protumor+Properties+of+Macrophages.">CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages.</a> Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).</li><li>Plaks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+Immune+Regulation+of+Mammary+Postnatal+Organogenesis.">Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis.</a> Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).</li><li>Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+human+breast+tissues+from+patient+cells+in+3D+hydrogel+scaffolds.">Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds.</a> Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).</li><li>Richert, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+mouse+mammary+gland+development.">An atlas of mouse mammary gland development.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).</li><li>Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathways+in+response+to+ionizing+radiation+and+their+targetability+for+tumor+radiosensitization.">Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).</li><li>LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Human+Reduction+Mammoplasty+and+Mastectomy+Tissues+for+Cell+Culture.">Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).</li><li>Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+roles+for+macrophages+in+ovarian+cycle-associated+development+and+remodelling+of+the+mammary+gland+epithelium.">Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium.</a> Development. 137, 4229-4238 (2010).</li><li>Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+Adipocyte+Differentiation.">Understanding Adipocyte Differentiation.</a> Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).</li><li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Methods+of+Adipogenic+Differentiation+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li><li>Gabry&#347;, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+Effects+on+the+Cytoskeleton+of+Endothelial+Cells+and+Endothelial+Monolayer+Permeability.">Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).</li><li>Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations+for+long-term+time-lapse+imaging+of+epithelial+morphogenesis+in+three-dimensional+organotypic+cultures.">Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+M1/M2+ratio+of+tumor-associated+macrophages+is+associated+with+extended+survival+in+ovarian+cancer+patients.">A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients.</a> Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).</li><li>Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+M1+form+of+tumor-associated+macrophages+in+non-small+cell+lung+cancer+is+positively+associated+with+survival+time.">The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time.</a> BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).</li></ol>

Dans ce protocole, nous avons développé une méthode pour la croissance reproductible et la caractérisation des organoïdes des mammaires irradiés (figure 1). Une dose d’irradiation de 20 GY a été appliquée pour refléter les précédents modèles in vivo de recrutement de cellules tumorales5. L’irradiation des glandes mammaires ex vivo avant la formation organoïde a permis l’isolement des effets de dommages de rayonnement sans infiltration correspondant...

Environ 60% des patients atteints de cancer du sein à triple négatif (TNBC) choisissent une thérapie de conservation du sein (BCT) comme forme de traitement1. Dans cette modalité de traitement, la tumeur contenant une partie du tissu mammaire est enlevée, et le tissu normal environnant est exposé aux rayonnements ionisants pour tuer les cellules tumorales résiduelles. Le traitement réduit la récurrence dans une grande partie de la population de cancer du sein; Cependant, environ 13,5% des patients traités par TNBC éprouvent des récidives locorégionales2. Par conséquent, étudier comment le rayonnement peut recruter des cellules tumorales circulantes (CTCS) mènera à des aperçus importants sur la récurrence locale3,4.
Des travaux antérieurs ont montré que le rayonnement du tissu normal augmente le recrutement de divers types de cellules5. Dans les modèles précliniques de TNBC, l’irradiation du tissu normal augmentait le macrophages et subséquemment le recrutement des cellules tumorales dans les tissus normaux5. Le statut immunitaire a influencé le recrutement des cellules tumorales sur les sites irradiés, avec la migration des cellules tumorales observée chez les sujets immunodéprimés. La récapitulation de ces interactions à l’aide d’organoïdes dérivés de glandes mammaires permettra l’observation de la migration cellulaire et des interactions cellules-stromales en temps réel avec la microscopie et l’imagerie cellulaire en direct afin de déterminer le rôle des dommages causés par les radiations lors de l’altération comportement des cellules tumorales.
Souris mammaires organoïdes ont contribué à élucider les étapes clés dans le développement de la glande mammaire. Un organoïde mammaire est une construction multicellulaire en trois dimensions de l’épithélium mammaire isolé qui est plus grand que 50 μM6,7,8,9,10. À l’aide d’organoïdes épithéliaux primaires, Simian et coll. ont évalué les facteurs nécessaires à la ramification dans la glande mammaire7. Shamir et coll. ont découvert que la dissémination peut se produire sans transition épithéliale à médéchymateuses, ce qui donne un aperçu de la cascade métastatique8. Les méthodes de production et de caractérisation des organoïdes du tissu de la glande mammaire sont bien établies6,11,12,13. Cependant, à notre connaissance, les méthodes de croissance des organoïdes irradiés des glandes mammaires n’ont pas été rapportées. Un protocole pour la culture et la caractérisation des organoïdes irradiés serait une étape cruciale dans la récapitulation du recrutement immunitaire et des cellules tumorales induite par le rayonnement.
Dans cet article, nous rapmettons une méthode pour cultiver et caractériser les organoïdes épithéliaux mammaires irradiés dans des microplaques à faible adhérence recouvertes d’un polymère hydrophile qui soutient la formation de sphéroïïdes. Ces organoïdes ont été co-cultivés avec des macrophages pour examiner la cinétique d’infiltration des cellules immunitaires. Ce travail peut être étendu pour inclure les organoïdes de co-culturing avec les cellules adipeuses pour récapituler les caractéristiques mammaires, les cellules cancéreuses du sein pour visualiser le recrutement de cellules tumorales, et les cellules de T + + T pour étudier les interactions de cellules de tumeur-immunes. Des protocoles préalablement établis peuvent être utilisés pour évaluer les organoïdes irradiés. Les modèles antérieurs co-culturant les organoïdes mammaires et les cellules immunitaires ont mis en lumière les mécanismes de métastase et de dissémination. DeNardo et coll. ont constaté que la régulation des lymphocytes T CD4 + des macrophages associés aux tumeurs a amélioré le phénotype métastatique des adénocarcinomes mammaires14. Des modèles de co-culture ont également été utilisés pour élucider les mécanismes de développement biologique. Plaks et coll. ont clarifié le rôle des lymphocytes T CD4 + comme régulateurs de bas de l’organogenèse mammaire15. Cependant, notre groupe est le premier à établir une procédure de visualisation de la façon dont l’irradiation tissulaire normale influe sur le comportement des cellules immunitaires. Parce que l’irradiation normale des tissus a été montré pour améliorer le recrutement de cellules tumorales5, ce protocole peut être développé pour analyser comment le comportement des cellules tumorales est altéré par l’irradiation des tissus normaux et des cellules, conduisant à une meilleure compréhension de récidive du cancer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 14</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab181595</td>
			<td>Lot: GR3200524-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Cadherin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>24E10</td>
			<td>Lot: 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td>green 
			Lot: GR3203000-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150080</td>
			<td>red 
			Lot: GR3192711-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>62249</td>
			<td>Lot: TG2611041</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (10 mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclon Sphera 96 well plates</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>174927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab176757</td>
			<td>Lot: GR3214582-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tight Junction Protein 1</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP1-85047</td>
			<td>Lot: C115428</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>27250-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growth and characterization of irradiated organoids from mammary glands

Les organoïdes dérivés du tissu digéré sont des constructions tridimensionnelles (3D) multicellulaires qui mieux récapitulent les conditions in vivo que les monocouches cellulaires. Bien qu’ils ne puissent pas complètement modéliser la complexité in vivo, ils conservent certaines fonctionnalités de l’orgue d’origine. Dans les modèles de cancer, les organoïdes sont couramment utilisés pour étudier l’invasion de cellules tumorales. Ce protocole vise à développer et caractériser les organoïdes du tissu de la glande mammaire de souris normale et irradiée pour évaluer la réponse de rayonnement dans les tissus normaux. Ces organoïdes peuvent être appliqués à de futures études de cancer in vitro pour évaluer les interactions des cellules tumorales avec des organoïdes irradiés. Les glandes mammaires ont été retouchées, irradiées à 20 Gy et digérées dans une solution de collagénase VIII. Les organoïdes épithéliaux ont été séparés par une différenciation centrifuge, et des organoïdes 3D ont été développés dans des microplaques à faible adhérence à 96 puits. Les organoïdes ont exprimé la cytokératine du marqueur épithélial caractéristique 14. L’interaction macrophage avec les organoïdes a été observée dans des expériences de co-culture. Ce modèle peut être utile pour étudier les interactions tumeur-stromale, l’infiltration des cellules immunitaires et la polarisation des macrophages dans un microenvironnement irradié.

Les organoïdes épithéliaux mammaires irradiés ont été obtenus avec succès à partir de glandes mammaires de souris, traitées et cultivées sur des plaques à faible adhérence (figure 1). Le rendement organoïde a été testé par ensemencement dans différents environnements de croissance (figure 2a-G). Les cellules ensemencées directement sur la culture tissulaire traitée sur des plaques cellulaires de 10 cm ont donné une prolifération de cellules fibroblastes....

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Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Les organoïdes développés à partir de glandes mammaires de souris ont été irradiés et caractérisés pour évaluer les traits épithéliaux et les interactions avec les cellules immunitaires. Les organoïdes irradiés peuvent être utilisés pour mieux évaluer les interactions de cellules cellulaires qui peuvent conduire au recrutement de cellules tumorales dans le tissu normal irradié.

Croissance et caractérisation des organoïdes irradiés des glandes mammaires

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Ce protocole peut être utilisé et développé pour analyser comment le rayonnement ionisant affecte le recrutement de cellules tumorales, conduisant à une meilleure compréhension de la récidive du cancer. Les organoïdes mammaires sont des modèles puissants. Ils imitent les caractéristiques in vivo de base, mais ils permettent un isolement facile des variables biologiques.L’utilisation de plaques à faible adhérence annule les défis liés au flux de travail associés aux matrices protéiques. Les patientes triple-négatives de cancer du sein éprouvent la répétition régionale locale aux taux plus élevés suivant la thérapie. L’étude de la façon dont le rayonnement influence le comportement tumoral et immunitaire des cellules mènera à des aperçus importants des mécanismes de répétition.Javier Gomez, étudiant diplômé du laboratoire Silvera Batista, fait la démonstration de la microscopie confoccale des organoïdes. Commencez cette procédure avec l’ablation des glandes mammaires abdominales et inguinales des souris sacrifiées comme détaillé dans le protocole de texte. 45 minutes après l’irradiation des échantillons tel que décrit dans le protocole de texte, placez les glandes mammaires dans une plaque cellulaire stérile de 35 millimètres et hachettez avec des scalpels.Hacher avec environ 40 coups jusqu’à ce que le tissu se détende et des morceaux sont obtenus qui ne sont pas plus grands qu’environ un millimètre carré dans la zone. Maintenant, transférez le tissu à la solution de collagène dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres. Utilisez 10 millilitres de solution de collagène par souris.Placez les tubes d’échantillon dans un bain d’eau pendant 30 à 60 minutes à 37 degrés Celsius, en tourbillonnant pendant cinq secondes toutes les 10 minutes. La digestion est complète lorsque la solution de collagène est trouble. Faites tourner la solution digérée à 450 fois G pendant 10 minutes à température ambiante.Maintenant, trois couches sont observées. Le supernatant est composé de graisse, la couche moyenne est une solution aqueuse, et le fond est une pastille. La pastille apparaît rouge, car il s’agit d’un mélange de cellules épithéliales, de cellules stromales individuelles et de globules rouges.Pré-enrober toutes les pipettes, les pointes de pipette et les tubes de centrifugeuse avec la solution BSA avant le contact par ajout et retrait de la solution BSA. La solution BSA peut être réutilisée, bien qu’elle soit filtrée stérilement avant chaque expérience. Pour une récupération supplémentaire, transférez le supernatant dans un tube frais de 15 millilitres recouvert de BSA.Pipette de haut en bas vigoureusement pour disperser la couche de graisse. Centrifuger l’échantillon à 450 fois G pendant 10 minutes à température ambiante. Aspirer le supernatant, en laissant une petite quantité de médias dans le tube pour éviter d’aspirer la pastille cellulaire.Aspirez maintenant la couche aqueuse du tube avec la pastille d’origine. Ajouter 10 millilitres de DMEM/F12 au tube avec la pastille d’origine, et transférer au deuxième tube. Pipette vigoureusement pour combiner et résuspendre les deux granulés.Après avoir centrifugé à 450 fois-G pendant 10 minutes à température ambiante, aspirer le supernatant et ajouter quatre millilitres de DMEM/F12 au tube. Ajouter 40 microlitres de désoxyribonuclease à la suspension et serrer doucement à la main pendant deux à cinq minutes à température ambiante. Ajouter six millilitres de DMEM/F12 et bien pipette.Après avoir centrifugé le tube à 450 fois G pendant 10 minutes à température ambiante, aspirez le supernatant à la marque de 0,5 millilitre. Resuspendez la pastille en 10 millilitres de DMEM/F12 et pipette à fond. Maintenant centrifuger le tube en pulsant à 450 fois-G et en s’arrêtant quatre secondes après avoir atteint cette vitesse.Répétez les étapes de lavage trois fois de plus pour purifier les organoïdes par différenciation centrifuge. La pastille doit maintenant être une couleur blanc clair composée uniquement d’organoïdes épithéliales. Resuspendez la pastille en 10 millilitres de DMEM/F12.Pipette à fond pour créer une solution homogène. Transférer 50 microlitres dans une boîte de Petri de 30 millimètres et la voir sous un microscope à contraste de phase à 20X. Comptez le nombre d’organoïdes avec un compteur de décompte.Pipette 50 microlitres d’organoïdes dans chaque puits d’une plaque à faible adhérence. Ajouter 150 microlitres de milieu organoïde pour porter le volume de travail total à 200 microlitres. Remplacez soigneusement le milieu tous les deux jours.Maintenir les macrophages crus GFP ou D-tomato-labeled 264.7 dans les médias de DMEM complétés avec 10%FPS et 1%penicilline-streptomycine. Ensemencer les cellules dans le milieu organoïde à la densité désirée. Utilisez le contraste de phase cellulaire vivante et l’imagerie fluorescente pour surveiller l’infiltration des macrophages au fil du temps.Retirer le milieu organoïde des puits en aspirant soigneusement. Fixer les échantillons avec de la formaline tamponnée à 10 % pendant 15 minutes à température ambiante. Laver les organoïdes fixes trois fois pendant cinq minutes en 1X PBS.Si désiré, des échantillons fixes peuvent être conservés à quatre degrés Celsius pendant une semaine pour d’autres taches. Après le lavage, perméabiliser les organoïdes fixes pendant cinq minutes. Bloquer les organoïdes fixes avec 5% de sérum de chèvre normal dans 0,1%PBST pendant une heure à température ambiante avant de laver trois fois pendant cinq minutes avec PBS.Incuber les organoïdes fixes avec de l’anti-cytokératine-14, de l’É-cadhérine ou de la protéine à jonction serrée, en 1% NGS en PBST pendant une heure à température ambiante. Puis laver trois fois pendant cinq minutes en PBST. Maintenant, incuber les organoïdes avec des anticorps secondaires anti-lapin de chèvre avec 1%NGS PBST pendant une heure à température ambiante.Couvrir de papier d’aluminium pour éviter l’exposition à la lumière. Après le lavage comme avant, utiliser le colorant nucléaire pour tacher les noyaux pendant environ une demi-heure. Laver les organoïdes tachés pendant cinq minutes en PBS trois fois.Si vous utilisez une glissière de chambre, montez avec un bordereau de couverture. Conserver les organoïdes enveloppés dans du papier d’aluminium à quatre degrés Celsius jusqu’à deux semaines. Les organoïdes irradiés pourraient être cultivés dans des plaques à faible adhérence, ou dans la membrane du sous-sol, mais la croissance la plus rapide s’est produite dans les plaques à faible adhérence.Organoïdes récapitulés caractéristiques de la glande mammaire. Des constructions morphologiquement semblables aux conduits et lobes ont été observées. Les tendances de croissance ont indiqué que lorsque les organoïdes ont été immédiatement ensemencés après digestion et tri, les organoïdes non irradiés ont augmenté plus rapidement que les organoïdes irradiés, probablement en raison de l’arrêt de la croissance cellulaire résultant de mécanismes de réparation des dommages à l’ADN.Les organoïdes ont exprimé des caractéristiques épithéliales, qui ont été évaluées par coloration immunofluorescente. Les organoïdes irradiés ont exprimé des marqueurs épithéliales. La cytokératine-14, un marqueur du myoepithelium, a été fortement exprimée à la surface des organoïdes irradiés.En outre, l’E-cadhérine et la protéine à jonction serrée ont été exprimées dans les jonctions cellulaires des organoïdes. Ces protéines sont essentielles pour une adhérence cellulaire appropriée. Après irradiation, les organoïdes ont continué à conserver leurs caractéristiques épithéliales.La coloration fluorescente des organoïdes pourrait être visualisée dans les plaques à faible adhérence à l’aide de microscopie par fluorescence. Cependant, la visualisation la plus claire a été obtenue par microscopie confoccale. L’intensité totale corrigée de fluorescence a été calculée en soustrayant l’arrière-plan, et en normalisant par zone organoïde.La culture d’organoïdes dans les plaques de co-culture de 96 puits à faible adhérence a également simplifié les expériences de co-culture. Une fois ensemencée à des concentrations typiques dans la glande mammaire, la colocalisation de macrophage a augmenté avec les organoïdes irradiés. Lors de l’exécution de cette procédure, les choses les plus importantes à retenir sont de ne pas trop digérer les organoïdes, et de purifier adéquatement la différenciation centrifuge.Suite à cette procédure, d’autres expériences de co-culture peuvent être réalisées. Les organoïdes peuvent être co-cultivés avec des cellules tumorales, d’autres cellules immunitaires et des cellules stromales pour recréer le microenvironnement irradié associé à la récidive. Cette méthode sera importante pour évaluer comment les dommages normaux de tissu influencent spécifiquement la dynamique de cellules immunisées, et seront par la suite employées pour comprendre des mécanismes de recrutement de cellules de tumeur.Organoïdes mammaires ont élucidé les mécanismes du développement de la glande mammaire, et ont solidement récapitulé le cancer du sein in vitro. Nous espérons que notre modèle fournit des aperçus sur le recrutement de cellules tumorales induites par la radiation.

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