Name: growth and characterization of irradiated organoids from mammary glands
Uploaded: 2019-05-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands at JoVE.com

אנו מודים ד ר לורה ל. ברוסארט עבור מתן GFP ו-dTomato התווית RAW 264.7 מקרופאגים. מחקר זה היה נתמך כספית על ידי מלגת NIHR00CA201304.

לימודי בעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ולפרוטוקולים המוסדיים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת ואנדרבילט.
1. הכנת עכברים ורכישת תאים (מותאם מ-נגוין-Ngoc et al.11)
<ol><li>להקריב את העכברים Nu/Nu (8-10 שבועות בן) באמצעות שיתוף2 חנק ואחריו פריקה צו...

<ol>
	<li>Lautner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disparities+in+the+Use+of+Breast-Conserving+Therapy+Among+Patients+With+Early-Stage+Breast+Cancer.">Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer.</a> Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).</li><li>Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregional+recurrence+after+breast+cancer+surgery+a+systematic+review+by+receptor+phenotype.">Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).</li><li>Kim, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Self-Seeding+by+Circulating+Cancer+Cells.">Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells.</a> Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).</li><li>Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Circulating+Breast+Cancer+Cells+Is+Stimulated+by+Radiotherapy.">Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy.</a> Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).</li><li>Rafat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Promote+Circulating+Tumor+Cell-Mediated+Local+Recurrence+following+Radiotherapy+in+Immunosuppressed+Patients.">Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients.</a> Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+Experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li><li>Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interplay+of+matrix+metalloproteinases,+morphogens+and+growth+factors+is+necessary+for+branching+of+mammary+epithelial+cells.">The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells.</a> Development. 128, 3117-3131 (2001).</li><li>Shamir, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist1-induced+dissemination+preserves+epithelial+identity+and+requires+E-cadherin.">Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin.</a> Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).</li><li>Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+Epithelial+Migration+and+Cell+Rearrangements+Drive+Mammary+Branching+Morphogenesis.">Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis.</a> Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+microenvironment+regulates+collective+migration+and+local+dissemination+in+normal+and+malignant+mammary+epithelium.">ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. -. V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Culture+Assays+of+Murine+Mammary+Branching+Morphogenesis+and+Epithelial+Invasion.">3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion.</a> Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).</li><li>Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+mammary+organoids+for+long-term+time-lapse+imaging.">Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews. , (2018).</li><li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+Cells+Regulate+Pulmonary+Metastasis+of+Mammary+Carcinomas+by+Enhancing+Protumor+Properties+of+Macrophages.">CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages.</a> Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).</li><li>Plaks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+Immune+Regulation+of+Mammary+Postnatal+Organogenesis.">Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis.</a> Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).</li><li>Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Proteinase+and+Collagenase+Fromcl.+Histolyticum.">Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum.</a> The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).</li><li>Mandl, I., Zaffuto, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serological+Evidence+for+a+Specific+Clostridium+histolyticum+Geltinase.">Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase.</a> The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).</li><li>Bond, M. D., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Individual+Collagenases+from+Clostridium+histolyticum.">Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum.</a> Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+estrogen-responsive+mouse+mammary+organoids+from+single+Lgr5+cells.">Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells.</a> Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).</li><li>Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+human+breast+tissues+from+patient+cells+in+3D+hydrogel+scaffolds.">Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds.</a> Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).</li><li>Richert, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+mouse+mammary+gland+development.">An atlas of mouse mammary gland development.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).</li><li>Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathways+in+response+to+ionizing+radiation+and+their+targetability+for+tumor+radiosensitization.">Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).</li><li>LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Human+Reduction+Mammoplasty+and+Mastectomy+Tissues+for+Cell+Culture.">Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).</li><li>Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3-D+in+vitro+co-culture+model+of+mammary+gland+involution.">A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution.</a> Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).</li><li>Chanson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells.">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).</li><li>Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+roles+for+macrophages+in+ovarian+cycle-associated+development+and+remodelling+of+the+mammary+gland+epithelium.">Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium.</a> Development. 137, 4229-4238 (2010).</li><li>Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+Adipocyte+Differentiation.">Understanding Adipocyte Differentiation.</a> Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).</li><li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Methods+of+Adipogenic+Differentiation+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li><li>Gabry&#347;, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+Effects+on+the+Cytoskeleton+of+Endothelial+Cells+and+Endothelial+Monolayer+Permeability.">Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).</li><li>Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations+for+long-term+time-lapse+imaging+of+epithelial+morphogenesis+in+three-dimensional+organotypic+cultures.">Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+M1/M2+ratio+of+tumor-associated+macrophages+is+associated+with+extended+survival+in+ovarian+cancer+patients.">A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients.</a> Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).</li><li>Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+M1+form+of+tumor-associated+macrophages+in+non-small+cell+lung+cancer+is+positively+associated+with+survival+time.">The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time.</a> BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).</li></ol>

בפרוטוקול זה פיתחנו שיטה לצמיחה ואפיון של מארגני הפטמות הקרינה (איור 1). מינון הקרנה של 20 Gy הוחל על מראה הקודם במודלים vivo של הזרקור של תא הגידול5. הקרנה של בלוטות החלב לשעבר vivo לפני היווצרות אורגאיד מותר לבידוד של אפקטי נזק קרינה ללא חדירה מתאימה של תאים חיסוניים...

כ 60% של סרטן השד שליליים משולשת (TNBC) מטופלים בוחרים בשד-שימור טיפול (BCT) כסוג של טיפול1. במובן זה מודאליות, הגידול המכיל חלק של רקמת השד מוסר, ואת הרקמה הנורמלית המקיפה נחשפת קרינה מייננת להרוג כל שרידי תאים סרטניים. הטיפול מפחית הישנות יותר של אוכלוסיית סרטן השד; עם זאת, כ 13.5% של חולים מטופלים עם החוויה TNBC לוקליזציה מופעים חוזרים2. לכן, ללמוד כיצד קרינה יכול לגייס תאים סרטניים במחזור (ctcs) יוביל לתובנות חשובות להישנות המקומי3,4.
העבודה הקודמת הראתה כי הקרינה של רקמות נורמלי מגביר את הגיוס של סוגי תאים שונים5. במודלים טרום קליניים של TNBC, הקרנה של רקמה נורמלית גדל מקרופאג ולאחר מכן הגידול התא הגיוס לרקמות נורמלי5. המצב החיסוני השפיעו על גיוס תאים סרטניים לאתרים שנחשפו לקרינה, עם הגירה תא הגידול נצפתה בנושאים חיסוני. העברת האינטראקציות הללו תוך שימוש באורגנואידים הנגזרים מבלוטות החלב תאפשר צפייה בהעברת תאים ואינטראקציות תאים מסטרומה בזמן אמת עם מיקרוסקופ ודימות תאים חיים כדי לקבוע את התפקיד של נזקי קרינה בשנות התנהגות תא הגידול.
אורגנואידים של העכבר עזרו להבהיר שלבי מפתח בהתפתחות בלוטת החלב. מבנה החלב הוא מגוון, שלושה מימדים המבנה של אפיתל החלב בודד כי הוא גדול יותר 50 יקרומטר6,7,8,9,10. באמצעות מארגני האפיתל העיקרי, Simian ואח ' העריך את הגורמים הדרושים עבור הסתעפות בבלוטת החלב7. שמיר ואח ' גילה כי הפצת יכול להתרחש ללא האפיתל למעבר mesenchymal, מתן תובנה האשד הגרורתי8. שיטות להפקת ואפיון אורגנואידים מרקמת בלוטת החלב מבוססים היטב6,11,12,13. עם זאת, על הידע שלנו, שיטות לגידול מאורגנואידים לקרינה מבלוטות החלב לא דווחו. פרוטוקול לגידול ולאפיון של אורגנואידים הקרינה יהיה צעד מכריע בארגון לכידה של הקרינה הנגרמת החיסונית והגידול תאים.
במאמר זה, אנו מדווחים על שיטה לגידול ולאפיון אפיתל הפטמות המנואידים במיקרופלטות נמוכות מצופות בפולימר הידרופילי התומך בהיווצרות הספרואידים. האורגנואידים האלה היו שותפים לתרבות עם מקרופאגים כדי לבחון קינטיקה חיסונית הסתננות של תאים. עבודה זו ניתן להרחיב כדי לכלול co-culturing אורגנואידים עם תאים האדיפוז מאפייני החלב, תאים סרטניים השד כדי להמחיש הזרקור תאים הגידול, ו CD8 + T תאים ללמוד גידול-אינטראקציות תאים חיסוניים. ניתן להשתמש בפרוטוקולים שנקבעו בעבר כדי להעריך את האורגנואידים הניתנים לקרינה. מוקדם יותר דגמים שיתוף החלב אורגנואידים ותאים חיסוניים יש לשפוך אור על מנגנונים של גרורות והפצת. DeNardo ואח ' מצא כי CD4 + T בוויסות התאים של מקרופאגים הקשורים הגידול משופרת פניטיפ גרוטיפים של הפטמות אדנוקרצינומות14. בנוסף, נעשה שימוש במודלים של תרבות משותפת כדי להבהיר מנגנונים לפיתוח ביולוגי. פלקס ואח ' הבהיר את תפקידה של CD4 + T כתאי הרגולטורים של החלב באורגאוגנזה15. עם זאת, הקבוצה שלנו היא הראשונה להקים הליך להמחיש כיצד הקרנה רקמה נורמלית משפיע על התנהגות התא החיסונית. מכיוון הקרנה רקמה נורמלית הוכח לשפר את הגיוס תאים סרטניים5, פרוטוקול זה ניתן לפתח עוד כדי לנתח כיצד התנהגות התאים הסרטניים משתנה על ידי הקרנה של רקמות ותאים נורמליים, המוביל להבנה רבה יותר של סרטן הישנות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 14</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab181595</td>
			<td>Lot: GR3200524-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Cadherin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>24E10</td>
			<td>Lot: 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td>green 
			Lot: GR3203000-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150080</td>
			<td>red 
			Lot: GR3192711-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>62249</td>
			<td>Lot: TG2611041</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (10 mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclon Sphera 96 well plates</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>174927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab176757</td>
			<td>Lot: GR3214582-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tight Junction Protein 1</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP1-85047</td>
			<td>Lot: C115428</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>27250-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growth and characterization of irradiated organoids from mammary glands

אורגנואידים נגזר מרקמת מתעכל הם רב-תאיים תלת מימדי (3D) מבנים כי טוב יותר לכידה בתנאים vivo מאשר תא monolayers. למרות שהם לא יכולים לגמרי לדגמן במורכבות vivo, הם שומרים כמה פונקציונליות של האיבר המקורי. ב מודלים סרטניים, אורגנואידים משמשים בדרך כלל כדי ללמוד הפלישה תא הגידול. פרוטוקול זה מטרתו לפתח ולאפיין אורגנואידים מרקמת בלוטת החלב הרגילה והקרינה הרדיואקטיבית כדי להעריך את תגובת הקרינה ברקמות רגילות. האורגנואידים האלה יכולים להיות מיושמים על עתיד בלימודי סרטן מבחנה כדי להעריך את האינטראקציות של תאי הגידול עם אורגנואידים לקרינה. בלוטות החלב היו resected, הקרינה עד 20 Gy מתעכל בתמיסה בקולגן השמיני. אורגנואידים אפיתל הופרדו באמצעות בידול צנטריפוגלי, ו 3D אורגנואידים פותחו ב 96-היטב מיקרופלטות הדבקה נמוכה. אורגנואידים הביע את סימן האפיתל האופייני ציטוקרטין 14. מקרופאג האינטראקציה עם האורגנואידים נצפתה בניסויים בשיתוף תרבות. מודל זה עשוי להיות שימושי עבור לימוד אינטראקציות הגידול סטרומה, הסתננות של תאים חיסוניים, ו מקרופאג קיטוב בתוך סביבת מיקרו הקרינה.

בלוטות החלב שנחשפו לקרינה התקבלו בהצלחה מבלוטות החלב של העכבר, מעובדות ומתרבות על לוחות הדבקה נמוכה (איור 1). תשואה אורגאיד נבדקה על ידי זריעה בסביבות גידול שונות (איור 2A-G). זורעי תאים ישירות על תרבות רקמות שטופלו 10 ס מ לוחות התא הניבו צמיחה יתר של תאים פיברובסט. המי?...

Watch this Scientific Journal Video about Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands at JoVE.com

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

אורגנואידים פיתח מבלוטות החלב של העכבר היו לקרינה מאופיין להעריך תכונות אפיתל ואינטראקציות עם תאים חיסוניים. ניתן להשתמש באורגנואידים הניתנים לקרינה כדי להעריך טוב יותר את האינטראקציות של תאי התא שעלולות להוביל לגיוס תאי גידול ברקמה נורמלית שניתן לקרינה.

צמיחה ואפיון של אורגנואידים לקרינה מבלוטות החלב

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

פרוטוקול זה יכול לשמש ולפתח עוד יותר כדי לנתח כיצד קרינה מייננת משפיעה על גיוס תאים סרטניים, מה שמוביל להבנה טובה יותר של הישנות סרטן. אורגנואידים ממאריים הם מודלים רבי עוצמה. הם מחקים מאפיינים בסיסיים של vivo, אך הם מאפשרים בידוד קל של משתנים ביולוגיים.השימוש בצלחות הידבקות נמוכות שולל אתגרי זרימת העבודה הקשורים למטריס חלבונים. חולי סרטן שד משולש שלילי חווים הישנות אזורית מקומית בשיעורים גבוהים יותר לאחר הטיפול. לימוד האופן שבו קרינה משפיעה על התנהגות הגידולים ותאי החיסון יוביל לתובנות חשובות על מנגנוני הישנות.הפגנת מיקרוסקופיה קונפוקרטית של האורגנואידים היא חוויאר גומז, סטודנט לתואר שני במעבדת סילברה בטיסטה. התחל הליך זה עם הסרת בלוטות החלב בטן ו inguinal מעכברים הקריבו כמפורט בפרוטוקול הטקסט. 45 דקות לאחר הקרנת הדגימות כמתואר בפרוטוקול הטקסט, מניחים בלוטות החלב בצלחת תאים סטריליים 35 מ"מ וטחון עם אזמלים.טחון עם כ 40 משיכות עד הרקמה מרגיעה חתיכות מתקבלים כי הם לא גדולים יותר מאשר כ מילימטר מרובע אחד באזור. עכשיו להעביר את הרקמה לתסמת קולגן בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר. השתמש 10 מיליליטר של פתרון קולגן לכל עכבר.מניחים את צינורות המדגם באמבט מים במשך 30 עד 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, מערבולת במשך חמש שניות כל 10 דקות. העיכול הושלם כאשר פתרון הקולגנס מעונן. סובבו את הפתרון המתעכל ב-450 פעמים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.עכשיו נצפו שלוש שכבות. העל-טבעי מורכב משומן, השכבה האמצעית היא פתרון מים, והתחתית היא גלולה. גלולה מופיע אדום, כפי שהוא תערובת של תאי אפיתל, תאים בודדים stromal, ותאי דם אדומים.יש לציפוי מראש של כל הפיפטות, טיפים לפיפט וצינורות צנטריפוגה עם פתרון BSA לפני המגע על ידי הוספה והסרה של פתרון BSA. ניתן לעשות שימוש חוזר בפתרון BSA, אם כי יש לסנן אותו באופן סטרילי לפני כל ניסוי. להתאוששות נוספת, מעבירים את העל-טבעי לצינור טרי מצופה BSA של 15 מיליליטר.פיפטה למעלה ולמטה במרץ כדי לפזר את שכבת השומן. צנטריפוגה המדגם ב 450 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. שאף את supernatant, משאיר כמות קטנה של מדיה בצינור, כדי למנוע שאף את גלולת התא.עכשיו שאף את השכבה המים מהצינור עם גלולה המקורית. מוסיפים 10 מיליליטר של DMEM/F12 לצינור עם גלולה המקורית, ומעבירים לצינור השני. פיפטה במרץ לשלב ולתלות מחדש את שני כדורי.לאחר צנטריפוגה ב 450 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, שאפו את העל-טבעי והוסיפו ארבעה מיליליטר של DMEM/F12 לצינור. מוסיפים 40 מיקרוליטרים של deoxyribonuclease להשעיה בעדינות ללחוץ ביד במשך שתיים עד חמש דקות בטמפרטורת החדר. הוסף שישה מיליליטר של DMEM / F12 ו pipette ביסודיות.לאחר צנטריפוגה הצינור ב 450 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, שאף את העל-טבעי לסימן 0.5 מיליליטר. תן שימוש חוזר את גלולה ב 10 מיליליטר של DMEM / F12 ו pipette ביסודיות. עכשיו צנטריפוגה הצינור על ידי פועם ל450 פעמים G ועצירת ארבע שניות לאחר שהגיע למהירות ש.חזור על שלבי הכביסה שלוש פעמים נוספות כדי לטהר אורגנואידים באמצעות התברואה צנטריפוגלית. גלולה צריך עכשיו להיות צבע לבן המורכב רק אורגנואידים אפיתל. תן שימוש חוזר לכדור ב-10 מיליליטר של DMEM/F12.פיפטה ביסודיות כדי ליצור פתרון הומוגני. מעבירים 50 מיקרוליטרים לצלחת פטרי 30 מ"מ ותצוגה תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה ב 20X. לספור את מספר האורגנואידים עם מונה ספירה.פיפטה 50 מיקרוליטרים של אורגנואידים לתוך כל באר של צלחת הידבקות נמוכה. הוסף 150 מיקרוליטרים של מדיום אורגנואידי כדי להביא את נפח העבודה הכולל ל-200 מיקרוליטרים. בזהירות להחליף את המדיום כל יומיים.שמור על מקרופאגים גולמיים בעלי תווית GFP או D-tomato 264.7 במדיה DMEM בתוספת 10%FPS ו- 1%פניצילין-סטרפטומיצין. זרע את התאים לתוך המדיום האורגנואידי בצפיפות הרצויה. השתמש בניגודיות פאזה של תאים חיים ובהדמיה פלואורסצנטית כדי לפקח על חדירת מקרופאג' לאורך זמן.הסר מדיום אורגנואיד מה בארות על ידי שאספירה בזהירות. תקן את הדגימות עם פורמלין עם 10%-חיץ ניטרלי במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את האורגנואידים קבוע שלוש פעמים במשך חמש דקות ב 1X PBS.אם תרצה, דגימות קבועות ניתן לאחסן בארבע מעלות צלזיוס במשך שבוע אחד עבור כתמים נוספים. לאחר שטיפה, לחלחל אורגנואידים קבוע במשך חמש דקות. חסום את האורגנואידים הקבועים עם סרום עיזים רגיל של 5% ב- PBST של 0.1% למשך שעה בטמפרטורת החדר לפני שטיפה שלוש פעמים במשך חמש דקות עם PBS.הדגירה אורגנואידים קבועים עם אנטי ציטוקראטין-14, E-cadherin, או חלבון צומת הדוק אחד, ב 1% NGS ב PBST במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לשטוף שלוש פעמים במשך חמש דקות PBST. עכשיו להדק את האורגנואידים עם נוגדן משני נגד ארנב עזים עם 1% NGS PBST במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.מכסים בנייר כסף כדי למנוע חשיפה לאור. לאחר שטיפה כבעבר, השתמש בצבע הגרעיני כדי להכתים גרעינים במשך כחצי שעה. לשטוף את האורגנואידים מוכתמים במשך חמש דקות PBS שלוש פעמים.אם אתה משתמש בשקופית תא, תמוקם עם פתק כיסוי. לאחסן את האורגנואידים עטופים בנייר כסף בארבע מעלות צלזיוס עד שבועיים. אורגנואידים מוקרנים יכולים להיות מתורבתים בצלחות הידבקות נמוכות, או בתוך קרום המרתף, אבל הצמיחה המהירה ביותר התרחשה בצלחות הידבקות נמוכה.אורגנואידים סותמים מחדש את מאפייני בלוטת החלב. מבנים הדומים מורפולוגית לתעלות ולאונות נצפו. מגמות הצמיחה הצביעו על כך שכאשר אורגנואידים נזרעו מיד לאחר העיכול והמיון, אורגנואידים שאינם מוקרנים גדלו מהר יותר מאשר אורגנואידים מוקרנים, ככל הנראה עקב מעצר צמיחת תאים כתוצאה ממנגנונים של תיקון נזק לדנ"א.אורגנואידים הביעו מאפייני אפיתל, אשר הוערכו באמצעות כתמים immunofluorescent. אורגנואידים מוקרנים הביעו סמני אפיתל. ציטוקרטין-14, סמן של מיופיתליום, בא לידי ביטוי בחוזקה על פני השטח של אורגנואידים מוקרנים.בנוסף, E-cadherin וחלבון צומת הדוק אחד באו לידי ביטוי בתוך צמתים הסלולר של אורגנואידים. חלבונים אלה חיוניים להיתוך התא הנכון. לאחר ההקרנה, אורגנואידים המשיכו לשמור על מאפייני האפיתל שלהם.כתמים פלואורסצנטיים של אורגנואידים יכולים להיות חזותיים בתוך צלחות הידבקות נמוכה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטי. עם זאת, ההדמיה הברורה ביותר הושגה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקאלית. עוצמת הפלואורסצנטיות הכוללת תוקנה חושבה על ידי חיסור הרקע, ונורמליזציה לפי אזור אורגנואיד.גידול אורגנואידים בצלחות הידבקות נמוכה של 96 בארות גם פישט את הניסויים בתרבות ה-Co. כאשר זרע בריכוזים אופייניים בלוטת החלב, קולוקליזציה מקרופאג גדל עם אורגנואידים מוקרנים. בעת ביצוע הליך זה, הדברים החשובים ביותר שיש לזכור הם לא לעכל יתר על כן את האורגנואידים, ולטהר כראוי את ההתברמות הצנטריפוגלית.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע ניסויים נוספים בתרבות השיתוף. אורגנואידים יכולים להיות מתורבתים במשותף עם תאים סרטניים, תאים חיסוניים אחרים, ותאים סטרומה כדי לשחזר את microenvironment מוקרן הקשורים הישנות. שיטה זו תהיה חשובה להערכת האופן שבו נזק לרקמות נורמלי משפיע באופן ספציפי על הדינמיקה של תאי החיסון, ובסופו של דבר ישמש להבנת מנגנוני גיוס תאים סרטניים.אורגנואידים החלב יש מנגנונים מובהרים של התפתחות בלוטת החלב, יש מחדש חזק סרטן השד במבחנה. אנו מקווים כי המודל שלנו מספק תובנות על גיוס תאים סרטניים הנגרמים על ידי קרינה.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

אקסון צמיחה מתיחה: Mechanotransduction הצמיחה העצבית

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

דור ושחזור של spheroids β-תא מהידרוג שלב צמיחת PEG-פפטיד

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

מודל התרבות 3D-תגובת הורמון של האפיתל בלוטת חלב האדם

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Intraductal Delivery to the Rabbit Mammary Gland

משלוח Intraductal אל ארנב חלב בלוט

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and ...

Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

הכנה ואפיון של נוזל HDL מחקה ננו-חלקיקים עבור אנקפסולציה גורם העצב הגדילה

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Vascularized Microfluidic Bioprinting עבור הנדסת רקמות, Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

ייצור ואפיון רקמות אופטי הפאנטומים המכיל למפלגות

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

זיהוי של אנדוטוקסין ניסוחים-Nano באמצעות מבחני Lysate (LAL) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Focused Ion Beam Lithography to Etch Nano-architectures into Microelectrodes

ליתוגרפיה של קרן יון ממוקדת לחרוט ננו-ארכיטקטורות למיקרואלקטרודות

With advances in electronics and fabrication technology, intracortical microelectrodes have undergone substantial improvements enabling the production of ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

דור מדרגי של אורגנואידים המוח הקטן בוגר מתאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים ואפיון על ידי אימונוסטיין

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...