Name: growth and characterization of irradiated organoids from mammary glands
Uploaded: 2019-05-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands at JoVE.com

Ringraziamo la Dott. ssa Laura L. Bronsart per aver fornito GFP e i macrofagi RAW 264,7 con etichetta dTomato. Questa ricerca è stata sostenuta finanziariamente da NIH Grant #R00CA201304.

Gli studi sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida e i protocolli istituzionali approvati dal Comitato istituzionale di cura e uso degli animali Vanderbilt University.
1. preparazione di topi e l'acquisizione di cellule (adattato da Nguyen-Ngoc et al.11)
<ol><li>Sacrificio atimici nu/nu topi (8-10 settimane di età) utilizzando Co2 asfissia seguita da lussazione cervicale. Pulire la pelle utilizzando 70% etanolo.</li>
	<li>Reinvia...

<ol>
	<li>Lautner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disparities+in+the+Use+of+Breast-Conserving+Therapy+Among+Patients+With+Early-Stage+Breast+Cancer.">Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer.</a> Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).</li><li>Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregional+recurrence+after+breast+cancer+surgery+a+systematic+review+by+receptor+phenotype.">Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).</li><li>Kim, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Self-Seeding+by+Circulating+Cancer+Cells.">Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells.</a> Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).</li><li>Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Circulating+Breast+Cancer+Cells+Is+Stimulated+by+Radiotherapy.">Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy.</a> Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).</li><li>Rafat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Promote+Circulating+Tumor+Cell-Mediated+Local+Recurrence+following+Radiotherapy+in+Immunosuppressed+Patients.">Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients.</a> Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+Experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li><li>Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interplay+of+matrix+metalloproteinases,+morphogens+and+growth+factors+is+necessary+for+branching+of+mammary+epithelial+cells.">The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells.</a> Development. 128, 3117-3131 (2001).</li><li>Shamir, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist1-induced+dissemination+preserves+epithelial+identity+and+requires+E-cadherin.">Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin.</a> Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).</li><li>Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+Epithelial+Migration+and+Cell+Rearrangements+Drive+Mammary+Branching+Morphogenesis.">Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis.</a> Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+microenvironment+regulates+collective+migration+and+local+dissemination+in+normal+and+malignant+mammary+epithelium.">ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. -. V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Culture+Assays+of+Murine+Mammary+Branching+Morphogenesis+and+Epithelial+Invasion.">3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion.</a> Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).</li><li>Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+mammary+organoids+for+long-term+time-lapse+imaging.">Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews. , (2018).</li><li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+Cells+Regulate+Pulmonary+Metastasis+of+Mammary+Carcinomas+by+Enhancing+Protumor+Properties+of+Macrophages.">CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages.</a> Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).</li><li>Plaks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+Immune+Regulation+of+Mammary+Postnatal+Organogenesis.">Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis.</a> Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).</li><li>Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Proteinase+and+Collagenase+Fromcl.+Histolyticum.">Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum.</a> The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).</li><li>Mandl, I., Zaffuto, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serological+Evidence+for+a+Specific+Clostridium+histolyticum+Geltinase.">Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase.</a> The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).</li><li>Bond, M. D., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Individual+Collagenases+from+Clostridium+histolyticum.">Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum.</a> Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+estrogen-responsive+mouse+mammary+organoids+from+single+Lgr5+cells.">Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells.</a> Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).</li><li>Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+human+breast+tissues+from+patient+cells+in+3D+hydrogel+scaffolds.">Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds.</a> Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).</li><li>Richert, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+mouse+mammary+gland+development.">An atlas of mouse mammary gland development.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).</li><li>Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathways+in+response+to+ionizing+radiation+and+their+targetability+for+tumor+radiosensitization.">Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).</li><li>LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Human+Reduction+Mammoplasty+and+Mastectomy+Tissues+for+Cell+Culture.">Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).</li><li>Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3-D+in+vitro+co-culture+model+of+mammary+gland+involution.">A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution.</a> Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).</li><li>Chanson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells.">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).</li><li>Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+roles+for+macrophages+in+ovarian+cycle-associated+development+and+remodelling+of+the+mammary+gland+epithelium.">Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium.</a> Development. 137, 4229-4238 (2010).</li><li>Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+Adipocyte+Differentiation.">Understanding Adipocyte Differentiation.</a> Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).</li><li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Methods+of+Adipogenic+Differentiation+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li><li>Gabry&#347;, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+Effects+on+the+Cytoskeleton+of+Endothelial+Cells+and+Endothelial+Monolayer+Permeability.">Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).</li><li>Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations+for+long-term+time-lapse+imaging+of+epithelial+morphogenesis+in+three-dimensional+organotypic+cultures.">Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+M1/M2+ratio+of+tumor-associated+macrophages+is+associated+with+extended+survival+in+ovarian+cancer+patients.">A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients.</a> Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).</li><li>Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+M1+form+of+tumor-associated+macrophages+in+non-small+cell+lung+cancer+is+positively+associated+with+survival+time.">The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time.</a> BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).</li></ol>

In questo protocollo, abbiamo sviluppato un metodo per la crescita riproducibile e la caratterizzazione di organoidi mammari irradiati (Figura 1). Una dose di irradiazione di 20 GY è stata applicata allo specchio precedenti modelli in vivo di reclutamento di cellule tumorali5. L'irradiazione delle ghiandole mammarie ex vivo prima della formazione organoide ha permesso di isolare gli effetti di danno da radiazioni senza una corrispondente infiltrazione di cellule immu...

Circa il 60% dei pazienti con triplo cancro al seno negativo (TNBC) sceglie la terapia di conservazione del seno (BCT) come forma di trattamento1. In questa modalità di trattamento, il tumore contenente parte del tessuto mammario viene rimosso, e il tessuto normale circostante è esposto a radiazioni ionizzanti per uccidere eventuali cellule tumorali residue. Il trattamento riduce la recidiva in gran parte della popolazione di cancro al seno; Tuttavia, circa 13,5% dei pazienti trattati con TNBC esperienza locoregionale recidive2. Pertanto, studiando come la radiazione può reclutare cellule tumorali circolanti (CTCs) porterà a importanti approfondimenti sulla ricorrenza locale3,4.
Il lavoro precedente ha dimostrato che la radiazione del tessuto normale aumenta il reclutamento di vari tipi di cellule5. Nei modelli preclinici di TNBC, l'irradiazione del tessuto normale ha aumentato il macrofago e successivamente il reclutamento delle cellule tumorali nei tessuti normali5. Stato immunitario influenzato il reclutamento delle cellule tumorali nei siti irradiati, con la migrazione delle cellule tumorali osservata in soggetti immunocompromessi. Ricapitolando queste interazioni utilizzando organoidi derivati da ghiandole mammarie permetterà l'osservazione della migrazione cellulare e interazioni cellulare-stromali in tempo reale con microscopia e imaging cellulare vivo per determinare il ruolo del danno da radiazioni in alterare comportamento delle cellule tumorali.
Gli organoidi mammari del topo hanno aiutato a chiarire i passi chiave nello sviluppo della ghiandola mammaria. Un organoide mammario è un costrutto tridimensionale multicellulare di epitelio mammario isolato che è più grande di 50 μm6,7,8,9,10. Usando organoidi epiteliali primari, Simian et al. ha valutato i fattori necessari per la ramificazione nella ghiandola mammaria7. Ha scoperto che la diffusione può avvenire senza una transizione epiteliale a mesenchimale, fornendo informazioni sulla cascata metastatica8. I metodi per la generazione e la caratterizzazione di organoidi dal tessuto della ghiandola mammaria sono ben consolidati6,11,12,13. Tuttavia, a nostra conoscenza, non sono stati segnalati metodi per la coltivazione di organoidi irradiati da ghiandole mammarie. Un protocollo per la coltivazione e la caratterizzazione di organoidi irradiati sarebbe un passo critico nella ricapitolazione del reclutamento di cellule immunitarie e tumorali indotta da radiazioni.
In questo articolo riportiamo un metodo per coltivare e caratterizzare organoidi epiteliali mammari irradiati in micropiastre a bassa adesione rivestite con un polimero idrofilo che supporta la formazione di sferoidi. Questi organoidi sono stati co-coltivati con macrofagi per esaminare la cinetica di infiltrazione delle cellule immunitarie. Questo lavoro può essere esteso per includere organoidi co-coltura con cellule adiposo per ricapitolare caratteristiche mammarie, cellule di cancro al seno per visualizzare il reclutamento delle cellule tumorali, e CD8 + cellule T per studiare le interazioni del tumore-immunitarie. I protocolli precedentemente stabiliti possono essere utilizzati per valutare gli organoidi irradiati. I modelli precedenti che cocoltivano organoidi mammari e cellule immunitarie hanno fatto luce sui meccanismi di metastasi e diffusione. Ha riscontrato che la regolazione delle cellule T CD4 + dei macrofagi associati al tumore ha migliorato un fenotipo metastatico di adenocarcinomi mammari14. I modelli di co-coltura sono stati utilizzati anche per chiarire i meccanismi di sviluppo biologico. Chiarito il ruolo delle cellule T CD4 + come down-regolatori di organogenesi mammaria15. Tuttavia, il nostro gruppo è il primo a stabilire una procedura per visualizzare come l'irraggiamento del tessuto normale influenza il comportamento delle cellule immunitarie. Poiché l'irraggiamento tissutale normale è stato dimostrato per migliorare il reclutamento delle cellule tumorali5, questo protocollo può essere ulteriormente sviluppato per analizzare come il comportamento delle cellule tumorali è alterato dall'irradiazione di tessuti e cellule normali, portando ad una maggiore comprensione del recidiva di cancro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 14</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab181595</td>
			<td>Lot: GR3200524-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Cadherin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>24E10</td>
			<td>Lot: 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td>green 
			Lot: GR3203000-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150080</td>
			<td>red 
			Lot: GR3192711-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>62249</td>
			<td>Lot: TG2611041</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (10 mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclon Sphera 96 well plates</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>174927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab176757</td>
			<td>Lot: GR3214582-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tight Junction Protein 1</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP1-85047</td>
			<td>Lot: C115428</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>27250-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growth and characterization of irradiated organoids from mammary glands

Gli organoidi derivati dal tessuto digerito sono costrutti tridimensionali (3D) multicellulari che ricapitolano meglio le condizioni in vivo rispetto ai monostrati cellulari. Anche se non possono modellare completamente la complessità in vivo, mantengono alcune funzionalità dell'organo originale. Nei modelli tumorali, gli organoidi sono comunemente usati per studiare l'invasione delle cellule tumorali. Questo protocollo mira a sviluppare e caratterizzare gli organoidi dal normale e irradiato tessuto della ghiandola mammaria del topo per valutare la risposta alle radiazioni nei tessuti normali. Questi organoidi possono essere applicati a futuri studi di cancro in vitro per valutare le interazioni delle cellule tumorali con organoidi irradiati. Le ghiandole mammarie sono state resecate, irradiate a 20 GY e digerite in una soluzione di collagenasi VIII. Gli organoidi epiteliali sono stati separati tramite differenziazione centrifuga e gli organoidi 3D sono stati sviluppati in micropiastre 96 e a bassa adesione. Gli organoidi hanno espresso il caratteristico marcatore epiteliale citcheratina 14. L'interazione macrofage con gli organoidi è stata osservata negli esperimenti di co-coltura. Questo modello può essere utile per studiare le interazioni tumorale-stromali, l'infiltrazione delle cellule immunitarie e la polarizzazione dei macrofati all'interno di un microambiente irradiato.

Gli organoidi mammari epiteliali irradiati sono stati ottenuti con successo dalle ghiandole mammarie del topo, elaborati e coltivati su piastre a bassa adesione (Figura 1). La resa organoide è stata testata dalla semina in diversi ambienti di crescita (Figura 2a-G). La semina delle cellule direttamente sulla coltura tissutale trattata di piastre cellulari da 10 cm ha prodotto una crescita eccessiva delle cellule fibroblasti. I fibroblasti sono stati identificati sotto micro...

Watch this Scientific Journal Video about Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands at JoVE.com

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Gli organoidi sviluppati dalle ghiandole mammarie del topo sono stati irradiati e caratterizzati per valutare i tratti epiteliali e le interazioni con le cellule immunitarie. Gli organoidi irradiati possono essere utilizzati per valutare meglio le interazioni delle cellule cellulari che possono portare al reclutamento di cellule tumorali nel tessuto normale irradiato.

Crescita e caratterizzazione di organoidi irradiati da ghiandole mammarie

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Questo protocollo può essere utilizzato e ulteriormente sviluppato per analizzare come le radiazioni ionizzanti influenzano il reclutamento delle cellule tumorali, portando a una maggiore comprensione della recidiva del cancro. Gli organoidi mammari sono modelli potenti. Imitano le caratteristiche in vivo di base, ma consentono un facile isolamento delle variabili biologiche.L'uso di piastre a bassa adesione nega le sfide del flusso di lavoro associate alle matrici proteiche. I pazienti con tumore al seno triplo negativo sperimentano recidiva regionale locale a tassi più elevati dopo la terapia. Studiare come le radiazioni influenzano il comportamento del tumore e delle cellule immunitarie porterà a importanti intuizioni sui meccanismi di ricorrenza.A dimostrare la microscopia confocale degli organoidi è Javier Gomez, uno studente laureato nel laboratorio silvera batista. Inizia questa procedura con la rimozione delle ghiandole mammarie addominali e inguinali dai topi sacrificati come descritto nel protocollo di testo. 45 minuti dopo l'irradiazione dei campioni come descritto nel protocollo di testo, posizionare le ghiandole mammarie in una piastra cellulare sterile di 35 millimetri e tritare con bisturi.Tritare con circa 40 colpi fino a quando il tessuto si rilassa e si ottengono pezzi che non sono più grandi di circa un millimetro quadrato di area. Ora trasferisci il tessuto in soluzione di collagenasi in un tubo di centrifuga da 50 millilitri. Utilizzare 10 millilitri di soluzione di collagenasi per topo.Posizionare i tubi campione in un bagno d'acqua per 30-60 minuti a 37 gradi Celsius, vortice per cinque secondi ogni 10 minuti. La digestione è completa quando la soluzione di collagenasi è torbosa. Far girare la soluzione digerita a 450 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente.Ora si osservano tre strati. Il supernatante è composto da grasso, lo strato intermedio è una soluzione acquosa e il fondo è un pellet. Il pellet appare rosso, in quanto è una miscela di cellule epiteliali, singoli globuli stromali e globuli rossi.Pre-rivestire tutte le pipette, le punte delle pipette e i tubi di centrifuga con soluzione BSA prima del contatto mediante aggiunta e rimozione della soluzione BSA. La soluzione BSA può essere riutilizzata, anche se deve essere filtrata sterilemente prima di ogni esperimento. Per un ulteriore recupero, trasferire il supernatante in un tubo fresco da 15 millilitri rivestito di BSA.Pipetta su e giù vigorosamente per disperdere lo strato di grasso. Centrifugare il campione a 450 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante, lasciando una piccola quantità di supporto nel tubo per evitare di aspirare il pellet cellulare.Ora aspira lo strato acquoso dal tubo con il pellet originale. Aggiungere 10 millilitri di DMEM/F12 al tubo con il pellet originale e trasferirli al secondo tubo. Pipetta vigorosamente per combinare e rimescolare i due pellet.Dopo aver centrifugato a 450 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente, aspirare il supernatante e aggiungere quattro millilitri di DMEM/F12 al tubo. Aggiungere 40 microlitri di deossiribonucleasi alla sospensione e agitare delicatamente a mano per due o cinque minuti a temperatura ambiente. Aggiungere accuratamente sei millilitri di DMEM/F12 e pipetta.Dopo aver centrifugato il tubo a 450 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente, aspirare il supernatante al segno di 0,5 millilitri. Resuspend il pellet in 10 millilitri di DMEM/F12 e pipetta accuratamente. Ora centrifuga il tubo pulsando a 450 volte G e fermandosi quattro secondi dopo aver raggiunto quella velocità.Ripetere i passaggi di lavaggio altre tre volte per purificare gli organoidi tramite differenziazione centrifuga. Il pellet dovrebbe ora essere un colore bianco sconto costituito solo da organoidi epiteliali. Resuspend il pellet in 10 millilitri di DMEM/F12.Pipetta accuratamente per creare una soluzione omogenea. Trasferire 50 microlitri in una piastra di Petri da 30 millimetri e visualizzarli al microscopio a contrasto di fase a 20X. Contare il numero di organoidi con un contatore tally.Pipetta 50 microlitri di organoidi in ogni pozzo di una piastra a bassa adesione. Aggiungere 150 microlitri di mezzo organoide per portare il volume di lavoro totale a 200 microlitri. Sostituire con cura il mezzo ogni due giorni.Mantenere i macrofagi grezzi con etichetta GFP o D 264,7 in supporti DMEM integrati con 10%FPS e 1%penicillina-streptomicina. Seminare le cellule nel mezzo organoide alla densità desiderata. Usa il contrasto di fase delle cellule vive e l'imaging fluorescente per monitorare l'infiltrazione di macrofagi nel tempo.Rimuovere il mezzo organoide dai pozzi aspirando con cura. Fissare i campioni con formalina tamponata al 10% in modo neutro per 15 minuti a temperatura ambiente. Lavare gli organoidi fissi tre volte per cinque minuti in 1X PBS.Se lo si desidera, i campioni fissi possono essere conservati a quattro gradi Celsius per una settimana per un'ulteriore colorazione. Dopo il lavaggio, permeabilizzare gli organoidi fissi per cinque minuti. Bloccare gli organoidi fissi con siero di capra normale al 5% nello 0,1%PBST per un'ora a temperatura ambiente prima di lavarsi tre volte per cinque minuti con PBS.Incubare gli organoidi fissi con anti-citocheratina-14, E-cadherina o proteina a giunzione stretta uno, in 1%NGS in PBST per un'ora a temperatura ambiente. Quindi lavare tre volte per cinque minuti in PBST. Ora incuba gli organoidi con anticorpi secondari anti-coniglio di capra con 1%NGS PBST per un'ora a temperatura ambiente.Coprire con un foglio per evitare l'esposizione alla luce. Dopo il lavaggio come prima, utilizzare il colorante nucleare per macchiare i nuclei per circa mezz'ora. Lavare gli organoidi macchiati per cinque minuti in PBS tre volte.Se si utilizza uno scivolo a camera, montare con uno slittamento di copertura. Conservare gli organoidi avvolti in un foglio a quattro gradi Celsius per un massimo di due settimane. Gli organoidi irradiati potevano essere coltivati in piastre a bassa adesione, o all'interno della membrana basale, ma la crescita più rapida si è verificata nelle piastre a bassa adesione.Gli organoidi ricapitolavano le caratteristiche della ghiandola mammaria. Sono stati osservati costrutti morfologicamente simili a dotti e lobi. Le tendenze di crescita hanno indicato che quando gli organoidi sono stati immediatamente seminati dopo la digestione e lo smistamento, gli organoidi non irradiati sono cresciuti più velocemente degli organoidi irradiati, molto probabilmente a causa dell'arresto della crescita cellulare derivante da meccanismi di riparazione dei danni al DNA.Gli organoidi esprimevano caratteristiche epiteliali, che venivano valutate attraverso la colorazione immunofluorescente. Gli organoidi irradiati hanno espresso marcatori epiteliali. La citocheratina-14, un marcatore di mioepitelio, è stata espressa fortemente sulla superficie degli organoidi irradiati.Inoltre, l'E-cadherina e la proteina a giunzione stretta sono state espresse all'interno delle giunzioni cellulari degli organoidi. Queste proteine sono essenziali per una corretta adesione cellulare. Dopo l'irradiazione, gli organoidi hanno continuato a mantenere le loro caratteristiche epiteliali.La colorazione fluorescente degli organoidi potrebbe essere vista all'interno di piastre a bassa adesione utilizzando la microscopia a fluorescenza. Tuttavia, la visualizzazione più chiara è stata ottenuta tramite microscopia confocale. L'intensità di fluorescenza totale corretta è stata calcolata sottraendo lo sfondo e normalizzando per area organoide.La crescita degli organoidi nelle placche a bassa adesione da 96 pozzi ha anche semplificato gli esperimenti di co-coltura. Se sementi a concentrazioni tipiche della ghiandola mammaria, la colocalizzazione dei macrofagi è aumentata con organoidi irradiati. Quando si esegue questa procedura, le cose più importanti da ricordare sono non digerire eccessivamente gli organoidi e purificare adeguatamente la differenziazione centrifuga.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire ulteriori esperimenti di co-coltura. Gli organoidi possono essere co-coltivati con cellule tumorali, altre cellule immunitarie e cellule stromali per ricreare il microambiente irradiato associato alla ricorrenza. Questo metodo sarà importante per valutare come il normale danno tissutale influenzi specificamente la dinamica delle cellule immunitarie e alla fine verrà utilizzato per comprendere i meccanismi di reclutamento delle cellule tumorali.Gli organoidi mammari hanno meccanismi chiariti di sviluppo della ghiandola mammaria e hanno un cancro al seno robustamente riassunto in vitro. Speriamo che il nostro modello fornisca informazioni sul reclutamento di cellule tumorali indotte dalle radiazioni.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Axon crescita Stretch: Il meccanotrasduzione di crescita neuronale

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Ricerca

Bioingegneria

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generazione e recupero dei β-cellule Spheroids dal passaggio di crescita PEG-peptide idrogel

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

Una cultura Modello 3D Ormone-sensibile della Human ghiandola mammaria Epithelium

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Intraductal Delivery to the Rabbit Mammary Gland

Consegna intraduttale al Coniglio ghiandola mammaria

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and ...

Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

Preparazione e caratterizzazione di novel nanoparticelle che imitano HDL per l&#39;incapsulamento del fattore di crescita del nervo

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Vascularized microfluidic multimateriali per l'ingegneria dei tessuti e Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

Fabbricazione e caratterizzazione dei fantasmi di tessuto ottico contenente macrostruttura

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Rilevamento dell'endotossina in Nano-formulazioni utilizzando dosaggi di Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Focused Ion Beam Lithography to Etch Nano-architectures into Microelectrodes

Focalizzata la litografia del fascio ionico per esacire di nano-architetture nei microelettrodi

With advances in electronics and fabrication technology, intracortical microelectrodes have undergone substantial improvements enabling the production of ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Generazione scalabile di organoidi cerebellari maturi da cellule staminali pluripotenti umane e caratterizzazione da immunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...