Name: growth and characterization of irradiated organoids from mammary glands
Uploaded: 2019-05-03T14:00:00
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私たちは、GFP と dTomato 標識の生264.7 マクロファージを提供するために、Dr. ローラ l. Bronsart に感謝します。本研究は、NIH 助成 #R00CA201304 による財政的支援であった。

動物実験は、ヴァンダービルト大学組織動物ケア・ユース委員会によって承認された制度的ガイドラインとプロトコルに従って実施した。
1. マウスおよび細胞の獲得の準備 (グエン・ゴック et al.11から適応)
<ol><li>犠牲無胸腺 Nu/Nu マウス (8-10 週齢) を使用して、co2 窒息の後に頚部脱臼が続きます。70% エタノールを使用して皮膚をきれいにしま?...

<ol>
	<li>Lautner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disparities+in+the+Use+of+Breast-Conserving+Therapy+Among+Patients+With+Early-Stage+Breast+Cancer.">Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer.</a> Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).</li><li>Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregional+recurrence+after+breast+cancer+surgery+a+systematic+review+by+receptor+phenotype.">Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).</li><li>Kim, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Self-Seeding+by+Circulating+Cancer+Cells.">Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells.</a> Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).</li><li>Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Circulating+Breast+Cancer+Cells+Is+Stimulated+by+Radiotherapy.">Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy.</a> Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).</li><li>Rafat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Promote+Circulating+Tumor+Cell-Mediated+Local+Recurrence+following+Radiotherapy+in+Immunosuppressed+Patients.">Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients.</a> Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+Experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li><li>Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interplay+of+matrix+metalloproteinases,+morphogens+and+growth+factors+is+necessary+for+branching+of+mammary+epithelial+cells.">The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells.</a> Development. 128, 3117-3131 (2001).</li><li>Shamir, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist1-induced+dissemination+preserves+epithelial+identity+and+requires+E-cadherin.">Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin.</a> Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).</li><li>Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+Epithelial+Migration+and+Cell+Rearrangements+Drive+Mammary+Branching+Morphogenesis.">Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis.</a> Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+microenvironment+regulates+collective+migration+and+local+dissemination+in+normal+and+malignant+mammary+epithelium.">ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. -. V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Culture+Assays+of+Murine+Mammary+Branching+Morphogenesis+and+Epithelial+Invasion.">3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion.</a> Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).</li><li>Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+mammary+organoids+for+long-term+time-lapse+imaging.">Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews. , (2018).</li><li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+Cells+Regulate+Pulmonary+Metastasis+of+Mammary+Carcinomas+by+Enhancing+Protumor+Properties+of+Macrophages.">CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages.</a> Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).</li><li>Plaks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+Immune+Regulation+of+Mammary+Postnatal+Organogenesis.">Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis.</a> Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).</li><li>Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Proteinase+and+Collagenase+Fromcl.+Histolyticum.">Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum.</a> The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).</li><li>Mandl, I., Zaffuto, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serological+Evidence+for+a+Specific+Clostridium+histolyticum+Geltinase.">Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase.</a> The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).</li><li>Bond, M. D., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Individual+Collagenases+from+Clostridium+histolyticum.">Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum.</a> Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+estrogen-responsive+mouse+mammary+organoids+from+single+Lgr5+cells.">Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells.</a> Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).</li><li>Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+human+breast+tissues+from+patient+cells+in+3D+hydrogel+scaffolds.">Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds.</a> Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).</li><li>Richert, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+mouse+mammary+gland+development.">An atlas of mouse mammary gland development.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).</li><li>Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathways+in+response+to+ionizing+radiation+and+their+targetability+for+tumor+radiosensitization.">Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).</li><li>LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Human+Reduction+Mammoplasty+and+Mastectomy+Tissues+for+Cell+Culture.">Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).</li><li>Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3-D+in+vitro+co-culture+model+of+mammary+gland+involution.">A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution.</a> Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).</li><li>Chanson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells.">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).</li><li>Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+roles+for+macrophages+in+ovarian+cycle-associated+development+and+remodelling+of+the+mammary+gland+epithelium.">Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium.</a> Development. 137, 4229-4238 (2010).</li><li>Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+Adipocyte+Differentiation.">Understanding Adipocyte Differentiation.</a> Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).</li><li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Methods+of+Adipogenic+Differentiation+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li><li>Gabry&#347;, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+Effects+on+the+Cytoskeleton+of+Endothelial+Cells+and+Endothelial+Monolayer+Permeability.">Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).</li><li>Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations+for+long-term+time-lapse+imaging+of+epithelial+morphogenesis+in+three-dimensional+organotypic+cultures.">Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+M1/M2+ratio+of+tumor-associated+macrophages+is+associated+with+extended+survival+in+ovarian+cancer+patients.">A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients.</a> Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).</li><li>Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+M1+form+of+tumor-associated+macrophages+in+non-small+cell+lung+cancer+is+positively+associated+with+survival+time.">The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time.</a> BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).</li></ol>

このプロトコルでは、照射された乳腺オルガノイドの再生可能な成長と特性評価のための方法を開発しました (図 1)。20 Gy の照射用量を、腫瘍細胞リクルート5の前インビボモデルを鏡映するために適用した。オルガノイド形成の前にインビボの乳腺の照射は、免疫細胞の対応する浸潤を伴わずに放射線損傷の影響を単離することを可能にした。インビ?...

3つの否定的な乳癌 (TNBC) の患者のおよそ 60% は処置1の形態として乳房温存療法 (BCT) を選ぶ。この治療モダリティでは、乳房組織の一部を含む腫瘍を除去し、周囲の正常組織を電離放射線に曝露して、任意の残留腫瘍細胞を死滅させる。治療は、乳癌集団の多くで再発を減少させます;しかし、TNBC 経験を持つ治療された患者の約 13.5% が2を再発局所領域的。したがって、放射線がどのように循環腫瘍細胞 (CTCs) を募集するかを研究することは、局所再発3,4における重要な洞察につながります。
従来の研究は、正常組織の放射線が様々な細胞型5の動員を増加させることを示している。TNBC の前臨床モデルにおいて、正常組織の照射はマクロファージを増加させ、続いて正常組織5に腫瘍細胞を動員する。免疫状態は、照射部位への腫瘍細胞の動員に影響を与え、腫瘍細胞の遊走は免疫不全の被験者で観察された。乳腺に由来するオルガノイドを用いてこれらの相互作用を概説することで、細胞遊走と細胞間相互作用を顕微鏡検査と生細胞イメージングでリアルタイムに観察し、変化による放射線損傷の役割を決定することができます。腫瘍細胞の挙動。
マウス乳腺オルガノイドは、乳腺の発達における主要なステップを解明するのに役立った。乳腺オルガノイドは50μ m6,7,8,9,10よりも大きい単離された乳腺上皮の多細胞性、三次元構造体である。原発性上皮オルガノイドを用いて、サル et al. は、乳腺7における分枝について必要な因子を評価した。シャミル et al. は上皮間葉転移を伴わない伝播が起こり得ることを発見し、転移性カスケード8に対する洞察を提供する。乳腺組織からのオルガノイドの生成および特徴づけの方法は、6、11、12、13で十分に確立されている。しかし、我々の知る限りでは、乳腺から照射されたオルガノイドが増殖するための方法は報告していない。照射されたオルガノイドの増殖および特性評価のためのプロトコルは、放射線誘導免疫および腫瘍細胞の概説において重要なステップである。
本論文では、スフェロイドの形成をサポートする親水性高分子を被覆した低接着マイクロプレートにおいて、照射された乳腺上皮オルガノイドを増殖・特性評価する方法を報告する。これらのオルガノイドは、免疫細胞浸潤動態を調べるためにマクロファージと共培養した。この作業は、脂肪細胞との共培養オルガノイドを乳房特性に不在し、腫瘍細胞の動員を可視化する乳癌細胞、および CD8 + T 細胞が腫瘍・免疫細胞相互作用を研究するように拡張することができる。以前に確立されたプロトコルは、照射オルガノイドを評価するために使用することができる。以前のモデルでは、乳腺オルガノイドと免疫細胞の共培養は、転移と播種のメカニズムに光を当てています。DeNardo et al. は、腫瘍関連マクロファージの CD4 + T 細胞調節が乳腺腺癌14の転移性表現型を増強したことを見出した。共培養モデルは、生物学的発達のメカニズムを解明するためにも用いられてきた。Plaks et al. は、乳腺器官形成15のダウンレギュレータとしての CD4 + T 細胞の役割を明らかにした。しかし、私たちのグループは、正常な組織の照射がどのように免疫細胞の挙動に影響するかを可視化する手順を最初に確立します。正常な組織の照射が腫瘍細胞の動員5を増強することが示されているので、このプロトコルは、腫瘍細胞の挙動が正常な組織および細胞の照射によってどのように変化するかを分析するためにさらに開発することができ、より大きな理解につながる癌の再発

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 14</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab181595</td>
			<td>Lot: GR3200524-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Cadherin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>24E10</td>
			<td>Lot: 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td>green 
			Lot: GR3203000-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150080</td>
			<td>red 
			Lot: GR3192711-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>62249</td>
			<td>Lot: TG2611041</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (10 mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclon Sphera 96 well plates</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>174927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab176757</td>
			<td>Lot: GR3214582-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tight Junction Protein 1</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP1-85047</td>
			<td>Lot: C115428</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>27250-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growth and characterization of irradiated organoids from mammary glands

消化された組織に由来するオルガノイドは、多細胞三次元 (3D) 構成要素であり、細胞単層よりもインビボ条件においてより良い不在を有する。これらは、生体内の複雑さを完全にモデル化できませんが、元の臓器のいくつかの機能を保持します。がんモデルでは、オルガノイドは、腫瘍細胞の浸潤を研究するために一般的に使用されます。このプロトコルは正常な、照射されたマウス乳腺組織からのオルガノイドを発達させることを特徴とし、正常組織における放射線応答を評価することを目的とする。これらのオルガノイドは、放射線照射されたオルガノイドとの腫瘍細胞相互作用を評価するために将来のインビトロ癌研究に適用することができる。乳腺を切除し、20 Gy に照射し、コラゲナーゼ VIII 溶液で消化した。上皮のオルガノイドは遠心分化によって分離され、3D オルガノイドは96の低付着性マイクロプレートで開発しました。オルガノイドは、特徴的な上皮マーカーサイトケラチン14を発現した。オルガノイドとのマクロファージ相互作用は、共培養実験で観察された。このモデルは、腫瘍間質相互作用、免疫細胞の浸潤、および照射された微小環境内のマクロファージ偏波を研究するのに有用である可能性がある。

照射した上皮乳腺オルガノイドをマウス乳腺から正常に取得し、処理し、低付着性プレート上で培養した (図 1)。オルガノイド収率は、異なる増殖環境で播種することによって試験された (図2a − G)。組織培養に直接播種された細胞は 10 cm の細胞版を処理し、線維芽細胞の増殖を引き起こした。線維芽細胞は、オルガノイドと同じ焦点のまたはその近くの位...

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Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

マウス乳腺から開発されたオルガノイドを照射し、上皮形質および免疫細胞との相互作用を評価することを特徴とした。照射されたオルガノイドは、照射正常組織における腫瘍細胞動員につながる可能性のある細胞間相互作用をよりよく評価するために使用することができる。

乳腺からの照射オルガノイドの成長とキャラクタリゼーション

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

このプロトコルは、電離放射線が腫瘍細胞の動員にどのような影響を与えるかを分析するために使用され、さらに開発され、癌再発の理解を深めることができます。乳腺オルガノイドは強力なモデルです。生体内の基本的な特性を模倣しますが、生物学的変数の容易な分離を可能にします。低接着プレートの使用は、タンパク質マトリックスに関連する作業フローの課題を否定します。トリプルネガティブ乳癌患者は、治療後のより高い率で局所的な再発を経験する。放射線が腫瘍や免疫細胞の挙動にどのような影響を与えるかを調べると、再発メカニズムに関する重要な洞察につながります。オルガノイドの共焦点顕微鏡を実証しているのは、シルバラ・バティスタ研究所の大学院生ハビエル・ゴメスです。テキストプロトコルに詳述されているように、犠牲マウスから腹部および鼠科乳腺を除去してこの手順を開始する。テキストプロトコルに記載されているサンプルを照射してから45分後、乳腺を35ミリメートルの無菌細胞プレートに入れ、メスを含むミンチを入れる。組織がリラックスし、面積が約1平方ミリメートル以下の部分が得られるまで、約40ストロークのミンチ。今50ミリリットル遠心分離チューブでコラゲターゼ溶液に組織を転送します。10ミリリットルのコラゲターゼ溶液をマウスあたりに使用してください。サンプルチューブを水浴に30~60分摂氏37度で置き、10分ごとに5秒間渦を出します。コラゲアーゼ溶液が曇っているとき、消化は完了します。消化した溶液を室温で10分間450倍Gでスピンダウンします。これで3層が観測されます。上清は脂肪で構成され、中間層は水溶液、底部はペレットです。ペレットは、上皮細胞、個々の間質細胞、および赤血球の混合物であるため、赤色に見える。BSA溶液の添加および除去によって接触する前にBSA溶液のすべてのピペット、ピペットの先端および遠心分離管を前塗りする。BSA溶液は、各実験の前に滅菌濾過する必要がありますが、再利用することができます。さらなる回復のために、上清を新鮮なBSAコーティングされた15ミリリットルの管に移す。ピペットは、脂肪層を分散させるために激しく上下します。試料を室温で10分間450倍Gで遠心する。上清を吸引し、細胞ペレットを吸引することを避けるために少量の培地をチューブに残す。今、元のペレットでチューブから水性層を吸引します。元のペレットを持つチューブにDMEM /F12の10ミリリットルを加え、第2のチューブに移します。ピペットを激しく組み合わせ、2つのペレットを再中断します。室温で10分間450回Gで遠心した後、上清を吸引し、チューブに4ミリリットルのDMEM/F12を加える。40マイクロリットルのデオキシリボヌクレアーゼを懸濁液に加え、室温で2~5分間手で軽く振ります。DMEM/F12を6ミリリットル加え、ピペットを十分に加えます。チューブを室温で10分間450回Gで遠心した後、上清を0.5ミリリットルのマークに吸引する。ペレットをDMEM/F12の10ミリリットルに再び懸濁し、ピペットを十分に再懸濁します。今、450倍Gに脈動し、その速度に達した後、4秒停止することによってチューブを遠心分離します。遠心分化を介してオルガノイドを精製するために、さらに3回洗浄手順を繰り返します。ペレットは、上皮オルガノイドのみで構成されるオフホワイト色にする必要があります。ペレットをDMEM/F12の10ミリリットルで再懸濁します。ピペットを徹底的に均質な溶液を作成します。50マイクロリットルを30ミリメートルのペトリ皿に移し、20Xで位相対照顕微鏡で見ます。集計カウンターでオルガノイドの数を数えます。ピペット50マイクロリットルのオルガノイドを低接着板の各ウェルに入る。オルガノイド培地の150マイクロリットルを加える 200 マイクロリットルに総作業量を持って来る。慎重に2日ごとに培地を交換してください。GFPまたはDトマト標識生264.7マクロファージを10%FPSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを補うDMEM培地で維持する。細胞を所望の密度でオルガノイド培地に播種します。ライブ細胞位相コントラストと蛍光イメージングを使用して、時間の経過に応じマクロファージの浸潤を監視します。慎重に吸引することによって、ウェルからオルガノイド培地を除去します。室温で15分間、10%中性緩衝ホルマリンでサンプルを固定します。1X PBSで固定オルガノイドを5分間3回洗浄します。必要に応じて、固定サンプルは、さらなる染色のために1週間摂氏4度で保存することができます。洗浄後、固定オルガノイドを5分間透過させます。PBSで5分間3回洗浄する前に、室温で1時間0.1%PBSTで5%正常ヤギ血清で固定オルガノイドをブロックします。固定オルガノイドを、抗サイトケラチン-14、Eカドヘリン、またはタイトジャンクションタンパク質1個をPBSTで1%NGSで室温で1時間インキュベートします。その後、PBSTで5分間3回洗浄します。今、ヤギ抗ウサギ二次抗体と1%NGS PBSTを室温で1時間インキュベートします。光の露出を避けるためにホイルで覆います。前のように洗浄した後、核を約30分間染色するために核染料を使用します。染色したオルガノイドをPBSで5分間洗浄します。チャンバースライドを使用する場合は、カバースリップ付きマウントします。オルガノイドをホイルで包んだのを摂氏4度で2週間保存します。照射されたオルガノイドは、低接着プレートまたは基基膜内で培養することができたが、最も急速な成長は低接着プレートで起こった。オルガノイドは乳腺の特徴を再現した。ダクトやローブに形態学的に類似した構造が観察された。成長傾向は、消化および選別後にオルガノイドを直ちに播種すると、照射されていないオルガノイドが照射されたオルガノイドよりも速く成長し、DNA損傷修復のメカニズムに起因する細胞増殖停止による可能性が最も高いことを示した。オルガノイドは上皮特性を発現し、免疫蛍光染色を通じて評価した。照射されたオルガノイドは上皮マーカーを発現した。ミオエピテリウムのマーカーであるサイトケラチン-14は、照射されたオルガノイドの表面に強く発現した。さらに、Eカドヘリンおよびタイトジャンクションタンパク質1は、オルガノイドの細胞結合内で発現した。これらのタンパク質は、適切な細胞接着に不可欠です。照射後、オルガノイドは上皮特性を保持し続けた。オルガノイドの蛍光染色は、蛍光顕微鏡を用いて低接着板内で可視化することができた。しかし、最も明確な可視化は共焦点顕微鏡を介して得られた。補正した全蛍光強度は、背景を減算し、オルガノイド領域による正規化を行って算出した。96ウェル低接着プレートでオルガノイドを成長させることも、共培養実験を簡素化した。乳腺に典型的な濃度で播種すると、マクロファージ共局在化は照射されたオルガノイドと共に増加した。この手順を行う際に覚えておくべき最も重要なことは、オルガノイドを過剰に消化しないこと、および遠心分化を適切に精製することです。この手順に従って、追加の共培養実験を行うことができる。オルガノイドは、腫瘍細胞、他の免疫細胞、および間質細胞と共培養して、再発に関連する照射された微小環境を再現することができる。この方法は、正常な組織損傷が免疫細胞のダイナミクスに特異的にどのような影響を与えるかを評価するために重要であり、最終的には腫瘍細胞の採用メカニズムを理解するために使用されます。乳腺オルガノイドは乳腺の発達のメカニズムを解明し、体外で乳癌を強く再現した。私たちのモデルが放射線誘発性腫瘍細胞のリクルートに関する洞察を提供することを願っています。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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