Name: growth and characterization of irradiated organoids from mammary glands
Uploaded: 2019-05-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands at JoVE.com

Vi takker Dr. Laura L. Bronsart for å gi GFP og dTomato-merket RAW 264,7 makrofager. Denne forskningen ble økonomisk støttet av NIH stipend #R00CA201304.

Dyrestudier ble utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer og protokoller godkjent av Vanderbilt University institusjonelle Animal Care og use Committee.
1. utarbeidelse av mus og celle oppkjøp (tilpasset fra Nguyen-Ngoc et al.11)
<ol><li>Offer athymic nu/nu mus (8-10 uker gamle) ved hjelp av CO2 kvelning etterfulgt av cervical forvridning. Rengjør huden med 70% etanol.</li>
	<li>Resect abdominal og lysken brystkjertler fra mus ved hjelp av pre-...

<ol>
	<li>Lautner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disparities+in+the+Use+of+Breast-Conserving+Therapy+Among+Patients+With+Early-Stage+Breast+Cancer.">Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer.</a> Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).</li><li>Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregional+recurrence+after+breast+cancer+surgery+a+systematic+review+by+receptor+phenotype.">Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).</li><li>Kim, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Self-Seeding+by+Circulating+Cancer+Cells.">Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells.</a> Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).</li><li>Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Circulating+Breast+Cancer+Cells+Is+Stimulated+by+Radiotherapy.">Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy.</a> Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).</li><li>Rafat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Promote+Circulating+Tumor+Cell-Mediated+Local+Recurrence+following+Radiotherapy+in+Immunosuppressed+Patients.">Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients.</a> Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+Experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li><li>Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interplay+of+matrix+metalloproteinases,+morphogens+and+growth+factors+is+necessary+for+branching+of+mammary+epithelial+cells.">The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells.</a> Development. 128, 3117-3131 (2001).</li><li>Shamir, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist1-induced+dissemination+preserves+epithelial+identity+and+requires+E-cadherin.">Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin.</a> Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).</li><li>Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+Epithelial+Migration+and+Cell+Rearrangements+Drive+Mammary+Branching+Morphogenesis.">Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis.</a> Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+microenvironment+regulates+collective+migration+and+local+dissemination+in+normal+and+malignant+mammary+epithelium.">ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. -. V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Culture+Assays+of+Murine+Mammary+Branching+Morphogenesis+and+Epithelial+Invasion.">3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion.</a> Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).</li><li>Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+mammary+organoids+for+long-term+time-lapse+imaging.">Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews. , (2018).</li><li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+Cells+Regulate+Pulmonary+Metastasis+of+Mammary+Carcinomas+by+Enhancing+Protumor+Properties+of+Macrophages.">CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages.</a> Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).</li><li>Plaks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+Immune+Regulation+of+Mammary+Postnatal+Organogenesis.">Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis.</a> Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).</li><li>Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Proteinase+and+Collagenase+Fromcl.+Histolyticum.">Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum.</a> The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).</li><li>Mandl, I., Zaffuto, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serological+Evidence+for+a+Specific+Clostridium+histolyticum+Geltinase.">Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase.</a> The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).</li><li>Bond, M. D., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Individual+Collagenases+from+Clostridium+histolyticum.">Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum.</a> Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+estrogen-responsive+mouse+mammary+organoids+from+single+Lgr5+cells.">Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells.</a> Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).</li><li>Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+human+breast+tissues+from+patient+cells+in+3D+hydrogel+scaffolds.">Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds.</a> Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).</li><li>Richert, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+mouse+mammary+gland+development.">An atlas of mouse mammary gland development.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).</li><li>Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathways+in+response+to+ionizing+radiation+and+their+targetability+for+tumor+radiosensitization.">Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).</li><li>LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Human+Reduction+Mammoplasty+and+Mastectomy+Tissues+for+Cell+Culture.">Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).</li><li>Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3-D+in+vitro+co-culture+model+of+mammary+gland+involution.">A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution.</a> Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).</li><li>Chanson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells.">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).</li><li>Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+roles+for+macrophages+in+ovarian+cycle-associated+development+and+remodelling+of+the+mammary+gland+epithelium.">Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium.</a> Development. 137, 4229-4238 (2010).</li><li>Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+Adipocyte+Differentiation.">Understanding Adipocyte Differentiation.</a> Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).</li><li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Methods+of+Adipogenic+Differentiation+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li><li>Gabry&#347;, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+Effects+on+the+Cytoskeleton+of+Endothelial+Cells+and+Endothelial+Monolayer+Permeability.">Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).</li><li>Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations+for+long-term+time-lapse+imaging+of+epithelial+morphogenesis+in+three-dimensional+organotypic+cultures.">Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+M1/M2+ratio+of+tumor-associated+macrophages+is+associated+with+extended+survival+in+ovarian+cancer+patients.">A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients.</a> Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).</li><li>Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+M1+form+of+tumor-associated+macrophages+in+non-small+cell+lung+cancer+is+positively+associated+with+survival+time.">The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time.</a> BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).</li></ol>

I denne protokollen har vi utviklet en metode for reproduserbar vekst og karakterisering av bestrålt melke organoids (figur 1). En bestråling dose av 20 gy ble brukt til speilet tidligere in vivo modeller av tumor celle rekruttering5. Bestråling av brystkjertler ex vivo før organoid dannelse tillatt for isolering av strålings skade effekter uten en tilsvarende infiltrasjon av immunceller. Utviklingen av en in vitro bestrålt normal vev modell muliggjør sanntids ...

Omtrent 60% av de trippel negative brystkreft (TNBC) pasienter velger bryst-bevaring terapi (BCT) som en form for behandling1. I denne behandlingen modalitet, svulsten som inneholder en del av brystvevet er fjernet, og det omkringliggende normalt vev utsettes for ioniserende stråling å drepe noen gjenværende tumorceller. Behandling reduserer gjentakelse i store deler av brystkreft populasjonen; men ca 13,5% av behandlede pasienter med TNBC erfaring locoregional gjentakelser2. Derfor studerer hvordan stråling kan rekruttere sirkulerende tumorceller (CTC) vil føre til viktig innsikt i lokale gjentakelse3,4.
Tidligere arbeid har vist at stråling av det normale vevet øker rekrutteringen av ulike celletyper5. I pre-kliniske modeller av TNBC, bestråling av normalt vev økt macrophage og senere tumor celle rekruttering til normal vev5. Immun status påvirket tumor celle rekruttering til bestrålt områder, med tumor celle migrasjon observert i immunsupprimerte. Recapitulating disse interaksjoner bruker organoids avledet fra brystkjertler vil tillate observasjon av celle migrasjon og celle-stromal interaksjoner i sanntid med mikroskopi og live celle Imaging å bestemme rollen av stråling skade i endring tumor celle atferd.
Mus melke organoids har hjulpet belyse viktige trinn i utviklingen av melkekjertlene. En bryst organoid er en flercellede, tredimensjonal konstruksjon av isolert bryst epitel som er større enn 50 μm6,7,8,9,10. Ved bruk av primær epitel organoids, Simian et al. evaluert nødvendige faktorer for forgrening i melkekjertlene7. Shamir et al. oppdaget at formidling kan skje uten et epitel til mesenchymal overgang, gir innsikt i metastatisk Cascade8. Metoder for generering og karakteriserer organoids fra melke kjertel vevet er godt etablert6,11,12,13. Imidlertid, å våre kunnskap, metoder for voksing bestrålt organoids fra bryst kjortelen ha ikke blitt rapportere. En protokoll for dyrking og karakteriserer bestrålt organoids ville være et kritisk skritt i recapitulating stråling-indusert immun-og tumor celle rekruttering.
I denne utredningen, rapporterer vi en metode for dyrking og karakteriserer bestrålt bryst epitel organoids i lav vedheft mikroplater belagt med en hydrofile polymer som støtter dannelsen av spheroids. Disse organoids var co-kultivert med makrofager for å undersøke immun celle infiltrasjon Kinetics. Dette arbeidet kan utvides til å omfatte co-dyrking organoids med fett celler å recapitulate melke egenskaper, brystkreftceller for å visualisere tumor celle rekruttering, og CD8 + T-celler for å studere tumor-immun celle interaksjoner. Tidligere etablerte protokoller kan brukes til å evaluere bestrålt organoids. Tidligere modeller co-dyrking bryst organoids og immunceller har belyse mekanismer for metastasering og formidling. DeNardo et al. fant at CD4 + T celle regulering av tumor tilknyttede makrofager forbedret en metastatisk fenotype av bryst adenocarcinomas14. Co-kultur modeller har også blitt brukt til å belyse mekanismer for biologisk utvikling. Plaks et al. avklart rolle CD4 + T celler som ned-regulatorer av bryst organogenesen15. Men vår gruppe er den første til å etablere en prosedyre for å visualisere hvordan normal vev bestråling påvirker immun celle atferd. Fordi normal vev bestråling har vist seg å forbedre tumor celle rekruttering5, kan denne protokollen utvikles videre for å analysere hvordan tumor celle atferd er endret ved bestråling av normalt vev og celler, som fører til en større forståelse av kreft tilbakefall.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 14</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab181595</td>
			<td>Lot: GR3200524-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Cadherin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>24E10</td>
			<td>Lot: 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td>green 
			Lot: GR3203000-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150080</td>
			<td>red 
			Lot: GR3192711-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>62249</td>
			<td>Lot: TG2611041</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (10 mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclon Sphera 96 well plates</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>174927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab176757</td>
			<td>Lot: GR3214582-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tight Junction Protein 1</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP1-85047</td>
			<td>Lot: C115428</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>27250-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growth and characterization of irradiated organoids from mammary glands

Organoids avledet fra fordøyd vevet er flercellede tredimensjonale (3D) konstruksjoner som bedre recapitulate in vivo forhold enn celle monolagere. Selv om de ikke kan helt modell in vivo kompleksitet, beholder de noe funksjonalitet i det opprinnelige organet. I kreft modeller, organoids er ofte brukt til å studere tumor celle invasjon. Denne protokollen har som mål å utvikle og karakterisere organoids fra normal og bestrålt mus melke kjertel vev å evaluere strålingen respons i normalt vev. Disse organoids kan anvendes på fremtidige in vitro kreft studier for å evaluere tumor celle interaksjoner med bestrålt organoids. Melkekjertlene ble resected, bestrålt til 20 gy og fordøyd i en kollagenase VIII-løsning. Epitel organoids ble separert via sentrifugal differensiering, og 3D-organoids ble utviklet i 96-brønn lav vedheft mikroplater. Organoids uttrykte den karakteristiske epitel markøren cytokeratin 14. Macrophage interaksjon med organoids ble observert i co-kultur eksperimenter. Denne modellen kan være nyttig for å studere tumor-stromal interaksjoner, infiltrasjon av immunceller, og macrophage polarisering innenfor en bestrålt mikromiljøet.

Bestrålt epitel bryst organoids ble vellykket innhentet fra mus melkekjertler, bearbeidet, og kultivert på lav-vedheft plater (figur 1). Organoid yield ble testet av seeding i ulike vekst miljøer (figur 2a-G). Seeding celler direkte på vev kultur behandlet 10 cm celle plater gitt en overvekst av Fibroblast celler. Fibroblaster ble identifisert under fase kontrast mikroskopi i eller i nærheten av samme planet av fokus som organoids, og de raskt vokste ut fra belagt organ...

Watch this Scientific Journal Video about Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands at JoVE.com

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Organoids utviklet fra mus melkekjertlene var bestrålt og preget til å vurdere epitel trekk og interaksjoner med immunceller. Bestrålt organoids kan brukes til å bedre evaluere celle-celle interaksjoner som kan føre til tumor celle rekruttering i bestrålt normalt vev.

Vekst og karakterisering av bestrålt Organoids fra Brystkjertler

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Denne protokollen kan brukes og videreutvikles for å analysere hvordan ironiserende stråling påvirker rekruttering av tumorceller, noe som fører til en større forståelse av tilbakefall av kreft. Mammary organoider er kraftige modeller. De etterligner grunnleggende in vivo egenskaper, men de tillater enkel isolering av biologiske variabler.Bruk av lav-vedhesjonsplater negerer arbeidsflytutfordringer forbundet med proteinmatriser. Trippel-negative brystkreftpasienter opplever lokal regional tilbakefall ved høyere priser etter behandling. Å studere hvordan stråling påvirker svulst og immuncelleatferd vil føre til viktig innsikt i tilbakefallsmekanismer.Viser konfokal mikroskopi av organoider er Javier Gomez, en utdannet student i Silvera Batista lab. Begynn denne prosedyren med fjerning av abdominale og inguinal brystkjertler fra ofret mus som beskrevet i tekstprotokollen. 45 minutter etter bestråling av prøvene som beskrevet i tekstprotokollen, plasser brystkjertlene i en 35 millimeter steril celleplate og kjøttdeig med skalpeller.Kjøttdeig med ca 40 slag til vevet slapper av og biter er oppnådd som ikke er større enn omtrent en kvadratimm millimeter i området. Overfør nå vevet til kollagenoppløsning i et 50-milliliter sentrifugerør. Bruk 10 milliliter collagenaseløsning per mus.Plasser prøverørene i et vannbad i 30 til 60 minutter ved 37 grader Celsius, virvler i fem sekunder hvert 10. Fordøyelsen er fullført når kollagenaseløsningen er overskyet. Spinn ned den fordøyde løsningen ved 450 ganger-G i 10 minutter ved romtemperatur.Nå observeres tre lag. Det overnaturlige består av fett, det midterste laget er en vandig løsning, og bunnen er en pellet. Pelleten vises rød, da det er en blanding av epitelceller, individuelle stromale celler og røde blodlegemer.Pre-coat alle pipetter, pipette tips, og sentrifuge rør med BSA løsning før kontakt ved tilsetning og fjerning av BSA løsning. BSA-løsningen kan brukes på nytt, selv om den skal sterilfiltreres før hvert eksperiment. For ekstra utvinning, overfør supernatanten til et friskt BSA-belagt 15-milliliter rør.Pipetten opp og ned kraftig for å spre fettlaget. Sentrifuger prøven ved 450 ganger-G i 10 minutter ved romtemperatur. Aspirer det overnaturante, og la en liten mengde medier i røret unngå å aspirere cellepelleten.Nå aspirerer det vandige laget fra røret med den opprinnelige pelleten. Tilsett 10 milliliter DMEM/F12 i røret med den opprinnelige pelleten, og overfør til det andre røret. Pipette kraftig for å kombinere og gjenbruke de to pellets.Etter sentrifugering ved 450 ganger-G i 10 minutter ved romtemperatur, aspirerer overnatanten og tilsett fire milliliter DMEM / F12 til røret. Tilsett 40 mikroliter deoksyribonukleærer til suspensjonen og rist forsiktig for hånd i to til fem minutter ved romtemperatur. Tilsett seks milliliter DMEM/F12 og pipette grundig.Etter å ha sentrifugert røret ved 450 ganger-G i 10 minutter ved romtemperatur, aspirerer det overnaturante til 0,5-millilitermerket. Resuspend pellet i 10 milliliter DMEM / F12 og pipette grundig. Sentrifuger røret ved å pulsere til 450 ganger-G og stoppe fire sekunder etter å ha nådd den hastigheten.Gjenta vasketrinnene tre ganger til for å rense organoider via sentrifugaldilatering. Pelleten skal nå være en off-white farge bestående av bare epitelorganoider. Resuspend pellet i 10 milliliter DMEM/F12.Pipette grundig for å skape en homogen løsning. Overfør 50 mikroliter til en 30-millimeter petriskål og se under et fasekontrastmikroskop ved 20X. Telle antall organoider med en tally teller.Pipette 50 mikroliter organoider i hver brønn av en lav vedheft plate. Tilsett 150 mikroliter organoid medium for å bringe det totale arbeidsvolumet til 200 mikroliter. Skift forsiktig ut mediet annenhver dag.Vedlikehold GFP eller D-tomat-merket rå 264,7 makrofager i DMEM media supplert med 10% FPS og 1% penicillin-streptomycin. Seed cellene inn i organoidmediet ved ønsket tetthet. Bruk live cellefasekontrast og fluorescerende bildebehandling for å overvåke makrofaginfiltrasjon over tid.Fjern organoid medium fra brønnene ved å aspirere forsiktig. Fiks prøvene med 10 % nøytralbufret formalin i 15 minutter ved romtemperatur. Vask de faste organoidene tre ganger i fem minutter i 1X PBS.Om ønskelig kan faste prøver lagres ved fire grader Celsius i en uke for ytterligere farging. Etter vask gjennomsyrer du de faste organoidene i fem minutter. Blokker de faste organoidene med 5 % normalt geiteserum i 0,1 %PBST i én time ved romtemperatur før du vasker tre ganger i fem minutter med PBS.Inkuber de faste organoidene med anti-cytokeratin-14, E-kadherin eller tettkryssende protein en, i 1% NGS i PBST i en time ved romtemperatur. Vask deretter tre ganger i fem minutter i PBST. Nå inkubere organoider med geit anti-kanin sekundært antistoff med 1% NGS PBST i en time ved romtemperatur.Dekk med folie for å unngå lyseksponering. Etter vask som før, bruk atomfargen til å flekke kjerner i omtrent en halv time. Vask de beisede organoidene i fem minutter i PBS tre ganger.Hvis du bruker et kammersklie, monteres du med en dekselslipp. Oppbevar organoidene innpakket i folie ved fire grader Celsius i opptil to uker. Bestrålte organoider kan dyrkes i lav-vedheft plater, eller innenfor kjelleren membran, men den raskeste veksten skjedde i lav-vedheft plater.Organoider rekaitulert brystkjertel egenskaper. Konstruksjoner som er morfologisk lik kanaler og fliker ble observert. Veksttrender indikerte at når organoider ble umiddelbart sådd etter fordøyelse og sortering, vokste ikke-bestrålte organoider raskere enn bestrålte organoider, mest sannsynlig på grunn av cellevekstarrest som følge av mekanismer for DNA-skadereparasjon.Organoider uttrykte epitelegenskaper, som ble evaluert gjennom immunofluorescerende farging. Bestrålte organoider uttrykte epitelmarkører. Cytokeratin-14, en markør for myoepithelium, ble uttrykt sterkt på overflaten av bestrålte organoider.I tillegg ble E-kadherin og tettkrysset protein man uttrykt i cellulære kryss av organoider. Disse proteinene er avgjørende for riktig celle vedheft. Etter bestråling fortsatte organoider å beholde sine epitelegenskaper.Fluorescerende farging av organoider kan visualiseres innenfor lavadhesjonsplater ved hjelp av fluorescensmikroskopi. Imidlertid ble den klareste visualiseringen oppnådd via konfokal mikroskopi. Korrigert total fluorescensintensitet ble beregnet ved å trekke bakgrunnen, og normalisere ved organoidområde.Voksende organoider i 96-brønns lav-vedheftsplater forenklet også samkultureksperimenter. Når seeded ved konsentrasjoner typisk i brystkjertelen, makrofag colocalization økt med bestrålte organoider. Når du utfører denne prosedyren, er de viktigste tingene å huske å ikke overdøye organoidene, og å rense sentrifugaldilatasjonen på riktig måte.Etter denne prosedyren kan flere co-kultur eksperimenter utføres. Organoider kan være co-kultivert med tumorceller, andre immunceller, og stromale celler for å gjenskape bestrålt mikromiljø forbundet med tilbakefall. Denne metoden vil være viktig for å vurdere hvordan normal vevsskade spesifikt påvirker immuncelledynamikken, og vil til slutt bli brukt til å forstå tumorcellerekrutteringsmekanismer.Mammary organoider har belyst mekanismer for brystkjertel utvikling, og har robust rekahalert brystkreft in vitro. Vi håper at vår modell gir innsikt om strålingsindusert tumorcellerekruttering.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Produksjon og gjenoppretting av β-celle sfæroider Fra Step-vekst PEG-peptid Hydrogeler

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

Et hormon-responsive 3D Culture Model of Human melkekjertlene Epitel

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Intraductal Delivery to the Rabbit Mammary Gland

Intraductal Levering til kanin melkekjertlene

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and ...

Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

Forberedelse og karakterisering av nye HDL-imiterende nanopartikler for nervvekstfaktorkapsling

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Microfluidic Bioprinting for utvikling Stangeriaceae vev og Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

Fabrikasjon og karakterisering av optisk vev Phantoms som inneholder Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Deteksjon av Endotoxin i Nano-formuleringer bruker Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) analyser

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Focused Ion Beam Lithography to Etch Nano-architectures into Microelectrodes

Fokusert ion Beam litografi å etse nano-arkitekturer i Microelectrodes

With advances in electronics and fabrication technology, intracortical microelectrodes have undergone substantial improvements enabling the production of ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Skalerbar generasjon av modne cerebellar organoider fra humane pluripotente stamceller og karakterisering ved immunstaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...