Name: growth and characterization of irradiated organoids from mammary glands
Uploaded: 2019-05-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands at JoVE.com

Agradecemos ao Dr. Laura L. Bronsart por fornecer GFP e dTomato-rotulados RAW 264,7 macrófagos. Esta pesquisa foi apoiada financeiramente pelo subsídio NIH #R00CA201304.

Os estudos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e protocolos institucionais aprovados pela Comissão de cuidados e uso de animais institucionais da Universidade Vanderbilt.
1. preparação de camundongos e aquisição de células (adaptado de Nguyen-Ngoc et al.11)
<ol><li>Sacrifique ratos de nu/nu atímicos (8-10 semanas velho) usando a asfixia de co2 seguida pela deslocação cervical. Limpe a pele com 70% de etanol.</li>
	<li>Resect gl?...

<ol>
	<li>Lautner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disparities+in+the+Use+of+Breast-Conserving+Therapy+Among+Patients+With+Early-Stage+Breast+Cancer.">Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer.</a> Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).</li><li>Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregional+recurrence+after+breast+cancer+surgery+a+systematic+review+by+receptor+phenotype.">Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).</li><li>Kim, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Self-Seeding+by+Circulating+Cancer+Cells.">Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells.</a> Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).</li><li>Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Circulating+Breast+Cancer+Cells+Is+Stimulated+by+Radiotherapy.">Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy.</a> Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).</li><li>Rafat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Promote+Circulating+Tumor+Cell-Mediated+Local+Recurrence+following+Radiotherapy+in+Immunosuppressed+Patients.">Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients.</a> Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+Experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li><li>Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interplay+of+matrix+metalloproteinases,+morphogens+and+growth+factors+is+necessary+for+branching+of+mammary+epithelial+cells.">The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells.</a> Development. 128, 3117-3131 (2001).</li><li>Shamir, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist1-induced+dissemination+preserves+epithelial+identity+and+requires+E-cadherin.">Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin.</a> Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).</li><li>Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+Epithelial+Migration+and+Cell+Rearrangements+Drive+Mammary+Branching+Morphogenesis.">Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis.</a> Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+microenvironment+regulates+collective+migration+and+local+dissemination+in+normal+and+malignant+mammary+epithelium.">ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. -. V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Culture+Assays+of+Murine+Mammary+Branching+Morphogenesis+and+Epithelial+Invasion.">3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion.</a> Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).</li><li>Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+mammary+organoids+for+long-term+time-lapse+imaging.">Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews. , (2018).</li><li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+Cells+Regulate+Pulmonary+Metastasis+of+Mammary+Carcinomas+by+Enhancing+Protumor+Properties+of+Macrophages.">CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages.</a> Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).</li><li>Plaks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+Immune+Regulation+of+Mammary+Postnatal+Organogenesis.">Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis.</a> Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).</li><li>Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Proteinase+and+Collagenase+Fromcl.+Histolyticum.">Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum.</a> The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).</li><li>Mandl, I., Zaffuto, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serological+Evidence+for+a+Specific+Clostridium+histolyticum+Geltinase.">Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase.</a> The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).</li><li>Bond, M. D., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Individual+Collagenases+from+Clostridium+histolyticum.">Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum.</a> Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+estrogen-responsive+mouse+mammary+organoids+from+single+Lgr5+cells.">Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells.</a> Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).</li><li>Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+human+breast+tissues+from+patient+cells+in+3D+hydrogel+scaffolds.">Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds.</a> Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).</li><li>Richert, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+mouse+mammary+gland+development.">An atlas of mouse mammary gland development.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).</li><li>Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathways+in+response+to+ionizing+radiation+and+their+targetability+for+tumor+radiosensitization.">Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).</li><li>LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Human+Reduction+Mammoplasty+and+Mastectomy+Tissues+for+Cell+Culture.">Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).</li><li>Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3-D+in+vitro+co-culture+model+of+mammary+gland+involution.">A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution.</a> Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).</li><li>Chanson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells.">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).</li><li>Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+roles+for+macrophages+in+ovarian+cycle-associated+development+and+remodelling+of+the+mammary+gland+epithelium.">Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium.</a> Development. 137, 4229-4238 (2010).</li><li>Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+Adipocyte+Differentiation.">Understanding Adipocyte Differentiation.</a> Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).</li><li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Methods+of+Adipogenic+Differentiation+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li><li>Gabry&#347;, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+Effects+on+the+Cytoskeleton+of+Endothelial+Cells+and+Endothelial+Monolayer+Permeability.">Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).</li><li>Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations+for+long-term+time-lapse+imaging+of+epithelial+morphogenesis+in+three-dimensional+organotypic+cultures.">Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+M1/M2+ratio+of+tumor-associated+macrophages+is+associated+with+extended+survival+in+ovarian+cancer+patients.">A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients.</a> Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).</li><li>Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+M1+form+of+tumor-associated+macrophages+in+non-small+cell+lung+cancer+is+positively+associated+with+survival+time.">The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time.</a> BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).</li></ol>

Neste protocolo, desenvolvemos um método de crescimento reprodutível e caracterização de organóides mamários irradiados (Figura 1). Uma dose da irradiação de 20 GY foi aplicada para espelhar modelos in vivo precedentes do recrutamento da pilha do tumor5. A irradiação de glândulas mamárias ex vivo antes da formação organoide permitiu o isolamento de efeitos de dano de radiação sem uma infiltração correspondente de células imunes. O desenvolvimento de...

Aproximadamente 60% dos pacientes com câncer de mama triplo negativo (TNBC) escolhem a terapia conservadora da mama (BCT) como forma de tratamento1. Nesta modalidade do tratamento, o tumor que contem a parte do tecido do peito é removido, e o tecido normal circunvizinho é exposto à radiação ionizante para matar todas as pilhas residuais do tumor. O tratamento reduz a recorrência em grande parte da população de câncer de mama; Entretanto, aproximadamente 13,5% dos pacientes tratados com TNBC experimentam recidivas locoregionais2. Portanto, estudar como a radiação pode recrutar células tumorais circulantes (CTCs) levará a importantes insights sobre a recorrência local3,4.
O trabalho precedente mostrou que a radiação do tecido normal aumenta o recrutamento de vários tipos da pilha5. Em modelos pré-clínicos de TNBC, a irradiação do tecido normal aumentou o macrófago e subseqüentemente o recrutamento da pilha do tumor aos tecidos normais5. O estado imunológico influenciou o recrutamento de células tumorais a sítios irradiados, com migração de células tumorais observada em indivíduos imunocomprometidos. Recapitulando essas interações usando organóides derivados de glândulas mamárias permitirá a observação da migração celular e interações célula-stromal em tempo real com microscopia e imagens de células vivas para determinar o papel de dano de radiação na alteração comportamento de células tumorais.
Os organóides mamários do camundongo ajudaram a elucidar passos importantes no desenvolvimento da glândula mamária. Um organóide mamário é um construto tridimensional multicelular de epitélio mamário isolado que é maior que 50 μm6,7,8,9,10. Usando organóides epiteliais primários, Simian et al. avaliaram os fatores necessários para a ramificação na glândula mamária7. Shamir et al. descobriram que a disseminação pode ocorrer sem uma transição epitelial para mesenquimal, proporcionando uma visão da cascata metastática8. Os métodos para a geração e caracterização de organóides do tecido da glândula mamária estão bemestabelecidos6,11,12,13. Entretanto, a nosso conhecimento, os métodos para crescer organoids irradiados das glândulas mamária não foram relatados. Um protocolo para o cultivo e a caracterização de organóides irradiados seria um passo crítico na recapitulação do recrutamento de células imunes e tumorais induzidas por radiação.
Neste trabalho, nós relatamos um método para crescer e caracterizar os organoids epithelial mamária irradiados em microplates baixos da adesão revestidos com um polímero hidrófilo que apoie a formação de spheroids. Esses organóides foram cocultivados com macrófagos para examinar a cinética de infiltração de células imunológicas. Este trabalho pode ser estendido para incluir os organoids coculturing com pilhas adiposas para recapitular características mamária, pilhas do cancro da mama para visualizar o recrutamento da pilha do tumor, e CD8 + pilhas de T para estudar interações tumor-imunes da pilha. Protocolos previamente estabelecidos podem ser utilizados para avaliar organóides irradiados. Os modelos mais adiantados que cocultivam organoids mamária e pilhas imunes derramaram a luz em mecanismos da metástase e da disseminação. DeNardo et al. verificaram que a regulação da célula T CD4 + de macrófagos associados ao tumor aumentou um fenótipo metastático de adenocarcinomas mamários14. Modelos de cocultura também têm sido utilizados para elucidar mecanismos de desenvolvimento biológico. Plaks et al. esclareceram o papel das células T CD4 + como reguladores da organogênese mamária15. Entretanto, nosso grupo é o primeiro a estabelecer um procedimento de Visualizar como a irradiação normal do tecido influencia o comportamento da pilha imune. Porque a irradiação normal do tecido foi mostrada para realçar o recrutamento da pilha do tumor5, este protocolo pode mais ser desenvolvido para analisar como o comportamento da pilha do tumor é alterado pela irradiação do tecido e das pilhas normais, conduzindo a uma compreensão maior de recorrência do cancro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 14</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab181595</td>
			<td>Lot: GR3200524-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Cadherin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>24E10</td>
			<td>Lot: 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td>green 
			Lot: GR3203000-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150080</td>
			<td>red 
			Lot: GR3192711-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>62249</td>
			<td>Lot: TG2611041</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (10 mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclon Sphera 96 well plates</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>174927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab176757</td>
			<td>Lot: GR3214582-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tight Junction Protein 1</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP1-85047</td>
			<td>Lot: C115428</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>27250-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growth and characterization of irradiated organoids from mammary glands

Os organóides derivados do tecido digerido são construções tridimensionais multicelulares (3D) que melhor recapitulam as condições in vivo do que as monolayers celulares. Embora não possam modelar completamente a complexidade in vivo, mantêm alguma funcionalidade do órgão original. Em modelos de câncer, os organóides são comumente usados para estudar a invasão de células tumorais. Este protocolo tem como objetivo desenvolver e caracterizar organóides do tecido mamário do camundongo normal e irradiado para avaliar a resposta à radiação em tecidos normais. Estes organoids podem ser aplicados aos estudos in vitro futuros do cancro para avaliar interações da pilha do tumor com organoids irradiados. As glândulas mamárias resected, irradiadas a 20 GY e digeridas em uma solução do colagenase VIII. Os organoids epithelial foram separados através da diferenciação centrífuga, e os organoids 3D foram desenvolvidos em microplates da baixo-adesão do 96-well. Os organoids expressaram o marcador epithelial característico Cytokeratin 14. A interação dos macrófagos com os organóides foi observada em experimentos de cocultura. Este modelo pode ser útil para o estudo de interações tumor-estromal, infiltração de células imunes e polarização de macrófagos dentro de um microambiente irradiado.

Os organóides mamários epiteliais irradiados foram obtidos com sucesso de glândulas mamárias de camundongo, processadas e cultivadas em placas de baixa adesão (Figura 1). A produção de organóides foi testada por semeadura em diferentes ambientes de crescimento (Figura 2a-G). Semeando pilhas diretamente na cultura do tecido tratou 10 placas de pilha do cm rendeu um overgrowth de pilhas do fibroblasto. Fibroblastos foram identificados em microscopia de contraste de fas...

Watch this Scientific Journal Video about Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands at JoVE.com

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Organóides desenvolvidos a partir de glândulas mamárias do camundongo foram irradiados e caracterizados para avaliar características epiteliais e interações com células imunes. Os organóides irradiados podem ser usados para melhor avaliar as interações célula-célula que podem levar ao recrutamento de células tumorais em tecido normal irradiado.

Crescimento e caracterização de organóides irradiados de glândulas mamárias

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Este protocolo pode ser usado e desenvolvido para analisar como a radiação ionizante afeta o recrutamento de células tumorais, levando a uma maior compreensão da recidiva do câncer. Organoides mamários são modelos poderosos. Eles imitam características básicas in vivo, mas permitem o fácil isolamento das variáveis biológicas.O uso de placas de baixa adesão nega os desafios de fluxo de trabalho associados às matrizes proteicas. Pacientes com câncer de mama triplo negativo experimentam recidiva regional local a taxas mais altas após a terapia. Estudar como a radiação influencia o comportamento tumoral e das células imunes levará a importantes insights sobre mecanismos de recorrência.Demonstrando microscopia confocal dos organoides está Javier Gomez, estudante de pós-graduação do laboratório Silvera Batista. Inicie este procedimento com a remoção de glândulas mamárias abdominais e inguinais de camundongos sacrificados conforme detalhado no protocolo de texto. 45 minutos após a irradiação das amostras, conforme descrito no protocolo de texto, coloque as glândulas mamárias em uma placa celular estéril de 35 milímetros e picadinho com bisturis.Pica com aproximadamente 40 golpes até que o tecido relaxe e pedaços sejam obtidos que não sejam maiores do que aproximadamente um milímetro quadrado na área. Agora transfira o tecido para a solução de colagem em um tubo centrífuga de 50 mililitros. Use 10 mililitros de solução de colagenase por mouse.Coloque os tubos de amostra em um banho de água por 30 a 60 minutos a 37 graus Celsius, vórtice por cinco segundos a cada 10 minutos. A digestão é completa quando a solução de colagem é nublada. Gire a solução digerida a 450 vezes G por 10 minutos à temperatura ambiente.Agora três camadas são observadas. O supernante é composto de gordura, a camada média é uma solução aquosa, e a parte inferior é uma pelota. A pelota parece vermelha, pois é uma mistura de células epiteliais, células estromais individuais e glóbulos vermelhos.Pré-cubra todas as pipetas, pontas de pipeta e tubos de centrífugas com solução BSA antes do contato por adição e remoção da solução BSA. A solução BSA pode ser reutilizada, embora deva ser filtrada estéril antes de cada experimento. Para recuperação adicional, transfira o supernatante para um tubo fresco revestido de BSA de 15 mililitros.Pipeta para cima e para baixo vigorosamente para dispersar a camada de gordura. Centrifugar a amostra a 450 vezes G por 10 minutos à temperatura ambiente. Aspire o supernasce, deixando uma pequena quantidade de mídia no tubo para evitar aspirar a pelota celular.Agora aspire a camada aquosa do tubo com a pelota original. Adicione 10 mililitros de DMEM/F12 ao tubo com a pelota original e transfira para o segundo tubo. Pipeta vigorosamente para combinar e resuspensar as duas pelotas.Depois de centrifugar a 450 vezes G por 10 minutos à temperatura ambiente, aspire o supernatante e adicione quatro mililitros de DMEM/F12 ao tubo. Adicione 40 microliters de desoxiribonuclease à suspensão e aperte suavemente à mão por dois a cinco minutos em temperatura ambiente. Adicione seis mililitros de DMEM/F12 e pipeta completamente.Depois de centrifugar o tubo a 450 vezes G por 10 minutos à temperatura ambiente, aspire o supernatante à marca de 0,5 mililitro. Resuspenda a pelota em 10 mililitros de DMEM/F12 e pipeta completamente. Agora centrifufique o tubo pulsando para 450 vezes G e parando quatro segundos depois de atingir essa velocidade.Repita as etapas de lavagem mais três vezes para purificar organoides através da diferenciação centrífuga. A pelota deve ser agora uma cor off-white consistindo apenas de organoides epiteliais. Resuspende a pelota em 10 mililitros de DMEM/F12.Pipeta completamente para criar uma solução homogênea. Transfira 50 microlitros para uma placa de Petri de 30 milímetros e veja sob um microscópio de contraste de fase a 20X. Conte o número de organoides com um contador de contagem.Pipeta 50 microliters de organoides em cada poço de uma placa de baixa adesão. Adicione 150 microliters de meio organoide para trazer o volume total de trabalho para 200 microliters. Substitua cuidadosamente o meio a cada dois dias.Mantenha macrófagos brutos GFP ou D-tomate 264,7 em mídia DMEM suplementados com 10%FPS e 1%penicilina-estreptomicina. Seme as células no meio organoide na densidade desejada. Use contraste de fase de células vivas e imagens fluorescentes para monitorar a infiltração de macrófagos ao longo do tempo.Remova o meio organoide dos poços aspirando cuidadosamente. Fixar as amostras com formalina tamponada 10% neutra por 15 minutos à temperatura ambiente. Lave os organoides fixos três vezes por cinco minutos em 1X PBS.Se desejar, as amostras fixas podem ser armazenadas a quatro graus Celsius durante uma semana para mais manchas. Após a lavagem, permeabilize os organoides fixos por cinco minutos. Bloqueie os organoides fixos com soro de cabra 5% normal em 0,1%PBST por uma hora em temperatura ambiente antes de lavar três vezes por cinco minutos com PBS.Incubar os organoides fixos com anti-citokeratina-14, E-cadherin, ou proteína de junção apertada, em 1%NGS em PBST por uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, lave três vezes por cinco minutos no PBST. Agora incubar os organoides com anticorpo secundário anti-coelho de cabra com 1%NGS PBST por uma hora em temperatura ambiente.Cubra com papel alumínio para evitar a exposição à luz. Depois de lavar como antes, use o corante nuclear para manchar núcleos por aproximadamente meia hora. Lave os organoides manchados por cinco minutos na PBS três vezes.Se usar um slide de câmara, monte com um deslizamento de tampa. Armazene os organoides embrulhados em papel alumínio a quatro graus Celsius por até duas semanas. Organoides irradiados poderiam ser cultivados em placas de baixa adesão, ou dentro da membrana do porão, mas o crescimento mais rápido ocorreu em placas de baixa adesão.Organoides recapitularam características da glândula mamária. Foram observados construtos morfologicamente semelhantes aos dutos e lóbulos. As tendências de crescimento indicaram que quando os organoides foram imediatamente semeados após a digestão e triagem, os organoides não irradiados cresceram mais rápido do que os organoides irradiados, provavelmente devido à parada de crescimento celular resultante de mecanismos de reparação de danos de DNA.Os organoides expressaram características epiteliais, que foram avaliadas por meio de coloração imunofluorescente. Organoides irradiados expressavam marcadores epiteliais. Citokeratin-14, um marcador de mioepithelium, foi expressa fortemente na superfície de organoides irradiados.Além disso, a e-cadherina e a proteína de junção apertada foram expressas dentro de junções celulares de organoides. Essas proteínas são essenciais para a adesão celular adequada. Após a irradiação, os organoides continuaram a manter suas características epiteliais.A coloração fluorescente de organoides pode ser visualizada dentro de placas de baixa adesão usando microscopia de fluorescência. No entanto, a visualização mais clara foi obtida via microscopia confocal. A intensidade de fluorescência total corrigida foi calculada subtraindo o fundo e normalizando por área organoide.Organoides em crescimento nas placas de baixa adesão de 96 poços também simplificaram experimentos de co-cultura. Quando semeada em concentrações típicas da glândula mamária, a colocalização do macrófago aumentou com organoides irradiados. Ao realizar este procedimento, as coisas mais importantes a se lembrar são não digerir demais os organoides, e purificar adequadamente a diferenciação centrífuga.Após este procedimento, podem ser realizados experimentos adicionais de cocultura. Organoides podem ser co-cultivados com células tumorais, outras células imunes e células estromais para recriar o microambiente irradiado associado à recidiva. Este método será importante para avaliar como os danos normais do tecido influenciam especificamente a dinâmica das células imunes, e eventualmente serão usados para entender os mecanismos de recrutamento de células tumorais.Organoides mamários têm mecanismos elucidados de desenvolvimento da glândula mamária, e têm robustamente recapitulado câncer de mama in vitro. Esperamos que nosso modelo forneça insights sobre o recrutamento de células tumorais induzidas por radiação.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Axon Crescimento Stretch: O Mecanotransdução do Crescimento Neuronal

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Bioengenharia

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Geração e recuperação de β-esferóides de células a partir do passo de crescimento-PEG-péptido Hidrogéis

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

Um modelo de cultura 3D Hormone-responsive da Human glândula mamária Epitélio

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Intraductal Delivery to the Rabbit Mammary Gland

Entrega Intraductal ao Coelho glândula mamária

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and ...

Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

Preparação e caracterização de novas nanopartículas simuladoras de HDL para encapsulação de fatores de crescimento nervoso

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Vascularizado de microfluidic Bioprinting para a engenharia de tecidos e Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

Fabricação e caracterização de espectros ópticos de tecido contendo Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Deteção da endotoxina em Nano-formulações usando Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) ensaios

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Focused Ion Beam Lithography to Etch Nano-architectures into Microelectrodes

Litografia de feixe de íons focada para etch nano-arquiteturas em microeletrodos

With advances in electronics and fabrication technology, intracortical microelectrodes have undergone substantial improvements enabling the production of ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Geração escalável de organoides cerebelares maduros de células-tronco pluripotentes humanas e caracterização por imunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...