Name: growth and characterization of irradiated organoids from mammary glands
Uploaded: 2019-05-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands at JoVE.com

Мы благодарим д-р Лаура л. Бронсар для обеспечения GFP и Dтомат-помечены RAW 264,7 макрофагов. Это исследование было финансово поддержано субсидии низ #R00CA201304.

Исследования на животных проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами и протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных Университета Вандербильта.
1. Подготовка мышей и приобретение клеток (адаптировано из Нгуен-Нгок и...

<ol>
	<li>Lautner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disparities+in+the+Use+of+Breast-Conserving+Therapy+Among+Patients+With+Early-Stage+Breast+Cancer.">Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer.</a> Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).</li><li>Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregional+recurrence+after+breast+cancer+surgery+a+systematic+review+by+receptor+phenotype.">Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).</li><li>Kim, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Self-Seeding+by+Circulating+Cancer+Cells.">Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells.</a> Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).</li><li>Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Circulating+Breast+Cancer+Cells+Is+Stimulated+by+Radiotherapy.">Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy.</a> Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).</li><li>Rafat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Promote+Circulating+Tumor+Cell-Mediated+Local+Recurrence+following+Radiotherapy+in+Immunosuppressed+Patients.">Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients.</a> Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+Experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li><li>Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interplay+of+matrix+metalloproteinases,+morphogens+and+growth+factors+is+necessary+for+branching+of+mammary+epithelial+cells.">The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells.</a> Development. 128, 3117-3131 (2001).</li><li>Shamir, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist1-induced+dissemination+preserves+epithelial+identity+and+requires+E-cadherin.">Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin.</a> Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).</li><li>Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+Epithelial+Migration+and+Cell+Rearrangements+Drive+Mammary+Branching+Morphogenesis.">Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis.</a> Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+microenvironment+regulates+collective+migration+and+local+dissemination+in+normal+and+malignant+mammary+epithelium.">ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. -. V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Culture+Assays+of+Murine+Mammary+Branching+Morphogenesis+and+Epithelial+Invasion.">3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion.</a> Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).</li><li>Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+mammary+organoids+for+long-term+time-lapse+imaging.">Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews. , (2018).</li><li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+Cells+Regulate+Pulmonary+Metastasis+of+Mammary+Carcinomas+by+Enhancing+Protumor+Properties+of+Macrophages.">CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages.</a> Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).</li><li>Plaks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+Immune+Regulation+of+Mammary+Postnatal+Organogenesis.">Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis.</a> Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).</li><li>Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Proteinase+and+Collagenase+Fromcl.+Histolyticum.">Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum.</a> The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).</li><li>Mandl, I., Zaffuto, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serological+Evidence+for+a+Specific+Clostridium+histolyticum+Geltinase.">Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase.</a> The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).</li><li>Bond, M. D., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Individual+Collagenases+from+Clostridium+histolyticum.">Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum.</a> Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+estrogen-responsive+mouse+mammary+organoids+from+single+Lgr5+cells.">Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells.</a> Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).</li><li>Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+human+breast+tissues+from+patient+cells+in+3D+hydrogel+scaffolds.">Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds.</a> Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).</li><li>Richert, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+mouse+mammary+gland+development.">An atlas of mouse mammary gland development.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).</li><li>Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathways+in+response+to+ionizing+radiation+and+their+targetability+for+tumor+radiosensitization.">Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).</li><li>LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Human+Reduction+Mammoplasty+and+Mastectomy+Tissues+for+Cell+Culture.">Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).</li><li>Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3-D+in+vitro+co-culture+model+of+mammary+gland+involution.">A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution.</a> Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).</li><li>Chanson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells.">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).</li><li>Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+roles+for+macrophages+in+ovarian+cycle-associated+development+and+remodelling+of+the+mammary+gland+epithelium.">Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium.</a> Development. 137, 4229-4238 (2010).</li><li>Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+Adipocyte+Differentiation.">Understanding Adipocyte Differentiation.</a> Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).</li><li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Methods+of+Adipogenic+Differentiation+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li><li>Gabry&#347;, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+Effects+on+the+Cytoskeleton+of+Endothelial+Cells+and+Endothelial+Monolayer+Permeability.">Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).</li><li>Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations+for+long-term+time-lapse+imaging+of+epithelial+morphogenesis+in+three-dimensional+organotypic+cultures.">Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+M1/M2+ratio+of+tumor-associated+macrophages+is+associated+with+extended+survival+in+ovarian+cancer+patients.">A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients.</a> Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).</li><li>Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+M1+form+of+tumor-associated+macrophages+in+non-small+cell+lung+cancer+is+positively+associated+with+survival+time.">The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time.</a> BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).</li></ol>

В этом протоколе мы разработали метод воспроизводимых темпов роста и характеризации облученных молочных органоидов (рис. 1). Доза облучения 20 гр был применен для зеркала предыдущего в естественных условиях модели набора опухолевых клеток5. Облучение молочн...

Примерно 60% от тройной отрицательный рак молочной железы (TNBC) пациенты выбирают грудного сохранения терапии (BCT) в качестве одной из форм лечения1. В этом модальности лечения, опухоль, содержащая часть ткани молочной железы удаляется, и окружающие нормальные ткани подвергается воздействию ионизирующего излучения, чтобы убить любые остаточные опухолевые клетки. Лечение уменьшает рецидив в большей части населения рака молочной железы; Тем не менее, примерно 13,5% пациентов с TNBC опыт локализрегионарно рецидивов2. Таким образом, изучая, как излучение может набирать циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) приведет к важным понимание местных рецидивов3,4.
Предыдущая работа показала, что излучение нормальных тканей увеличивает набор различных типов клеток5. В доклинических моделях TNBC, облучение нормальных тканей увеличенного макрофага и впоследствии набора опухолевых клеток к нормальным тканям5. Иммунный статус повлиял на набор опухолевых клеток в облученных участках, с миграцией опухолевых клеток наблюдается у субъектов с ослабленным иммунитетом. Резюме этих взаимодействий с использованием органоидов, полученных из молочных желез позволит наблюдение клеточной миграции и клеток стромальных взаимодействий в режиме реального времени с микроскопией и живой визуализации клеток, чтобы определить роль радиационного повреждения в изменении поведение опухолевых клеток.
Органоиды молочных мышей помогли прояснить ключевые шаги в развитии молочной железы. Оргаоид молочной железы представляет собой многоклеточный, трехмерный конструкт изолированного молочной эпителия, который больше 50 мкм6,7,8,9,10. Используя первичные эпителиальные органоиды, Симиан и др. оценивали необходимые факторы для ветвления в молочной железе7. Шамир и др. обнаружили, что распространение может происходить без эпителиального мезенхимального перехода, обеспечивая понимание метастатического каскада8. Методы генерации и характеристики органоидов из ткани молочной железы хорошо созданы6,11,12,13. Однако, насколько нам известно, о методах выращивания облученных органоидов из молочных желез не сообщалось. Протокол для выращивания и характерирования облученных органоидов был бы критическим шагом в переподборе индуцированных радиацией иммунных и опухолевых клеток.
В данной статье мы сообщаем о методе выращивания и характеризующих облученных в низкоадгезиальных микропластиках молочных эпителиоидов, покрытых гидрофильным полимером, поддерживающего формирование сфероидов. Эти органоиды были совместно культивировали с макрофагами, чтобы изучить кинетику проникновения иммунной клетки. Эта работа может быть расширена за включение совместного культивирования органоиды с жировой клетки, чтобы резюмировать молочных характеристик, клетки рака молочной железы для визуализации опухоли клеток набора, и CD8 + т-клеток для изучения опухоли иммунных взаимодействий клеток. Ранее установленные протоколы могут использоваться для оценки облученных органоидов. Более ранние модели совместного культивирования молочных органоидов и иммунных клеток проливают свет на механизмы метастазов и распространения. Денардо и др. обнаружили, что CD4 + т-клеточной регуляции опухоли связанных макрофагов расширенной метастатического фенотипа молочной аденокарциномы14. Для выяснения механизмов биологического развития использовались также модели сокультуры. Плакс и др. уточнили роль CD4 + т-клеток в качестве регуляторов молочной оргагенеза15. Тем не менее, наша группа является первой, чтобы установить процедуру визуализации, как нормальное облучение тканей влияет на поведение иммунной клетки. Потому что нормальное облучение ткани было показано, что увеличить набор опухолевых клеток5, этот протокол может быть дополнительно разработан, чтобы проанализировать, как поведение опухолевых клеток изменяется путем облучения нормальных тканей и клеток, что приводит к большему пониманию рецидива рака.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 14</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab181595</td>
			<td>Lot: GR3200524-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Cadherin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>24E10</td>
			<td>Lot: 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td>green 
			Lot: GR3203000-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150080</td>
			<td>red 
			Lot: GR3192711-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>62249</td>
			<td>Lot: TG2611041</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (10 mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclon Sphera 96 well plates</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>174927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab176757</td>
			<td>Lot: GR3214582-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tight Junction Protein 1</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP1-85047</td>
			<td>Lot: C115428</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>27250-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growth and characterization of irradiated organoids from mammary glands

Органоиды, получаемые из переваренной ткани, представляют собой многоклеточные трехмерные (3D) конструкции, которые лучше повторяют условия естественных условий, чем моноайеры клеток. Хотя они не могут полностью моделировать в естественных условиях сложности, они сохраняют некоторую функциональность оригинального органа. В моделях рака, органоиды обычно используются для изучения вторжения опухолевых клеток. Этот протокол направлен на разработку и характеристику органоидов из нормальной и облученных мышей молочной железы ткани для оценки радиационной реакции в нормальных тканях. Эти органоиды могут быть применены к будущему в пробирке рака исследований для оценки взаимодействия опухолевых клеток с облученных органоидов. Молочные железы были resected, облученных до 20 гр и усваивается в коллагеназы VIII раствора. Эпителиальные органоиды были отделены через центробежные дифференцировки, и 3D органоиды были разработаны в 96-хорошо низкой адгезии микропластин. Органоиды выразили характерный эпителиальный маркер цитокератина 14. Взаимодействие макрофагов с органоидами наблюдалось в экспериментах со-культуры. Эта модель может быть полезна при изучении опухолей-стромальных взаимодействий, инфильтрации иммунных клеток и поляризации макрофагов в облученном микроокружении.

Облученных эпителиальных молочных органоидов были успешно получены из молочных желез мыши, обработанные, и культивировали на низко-адгезии пластин (рис. 1). Урожайность оргадоидов была протестирована посевом в различных средах роста (рисунок 2A-G). Посев клеток н...

Watch this Scientific Journal Video about Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands at JoVE.com

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Органоиды, разработанные из молочных желез мышей были облучены и характеризуется для оценки эпителиальных признаков и взаимодействий с иммунными клетками. Облученных органоиды могут быть использованы для более эффективного оценки клеточных взаимодействий клеток, которые могут привести к набору опухолевых клеток в облучении нормальной ткани.

Рост и характеристика облученных органоидов из молочных желез

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Этот протокол может быть использован и далее разработан для анализа того, как ионизирующее излучение влияет на набор опухолевых клеток, что приводит к более широкому пониманию рецидива рака. Органоиды молочной железы являются мощными моделями. Они имитируют основные характеристики in vivo, но позволяют легко от изоляции биологических переменных.Использование низкоагезионых пластин сводит на нет проблемы рабочего потока, связанные с матрицами белка. Тройной отрицательный рак молочной железы пациенты испытывают местные региональные рецидивы с более высокими темпами после терапии. Изучение влияния радиации на опухоль и поведение иммунных клеток приведет к важному пониманию механизмов рецидивов.Демонстрируя конфокаловую микроскопию органоидов, Хавьер Гомес, аспирант лаборатории Silvera Batista. Начните эту процедуру с удаления брюшной и паховой молочных желез от принесенных в жертву мышей, как описано в текстовом протоколе. Через 45 минут после облучения образцов, как описано в текстовом протоколе, поместите молочные железы в 35-миллиметровую стерильную клеточную пластину и фарш скальпелями.Фарш с примерно 40 ударов, пока ткань расслабляется и куски получены, которые не больше, чем примерно один квадратный миллиметр в области. Теперь перенесите ткань в раствор коллагеназы в 50-миллилитровую центрифугу. Используйте 10 миллилитров раствора коллагеназы на мышь.Поместите пробные трубки в водяную баню на 30-60 минут при 37 градусах цельсия, вихревая в течение пяти секунд каждые 10 минут. Пищеварение завершено, когда раствор коллагеназы мутный. Спин вниз усваивается раствор в 450 раз-G в течение 10 минут при комнатной температуре.Сейчас наблюдаются три слоя. Супернатант состоит из жира, средний слой является aqueous раствор, а дно гранулы. Гранулы появляются красные, так как это смесь эпителиальных клеток, отдельных стромальных клеток и красных кровяных телец.Предварительно покрыть все пипетки, пипетки советы, и центрифуги трубки с решением BSA до контакта путем добавления и удаления решения BSA. Решение BSA может быть использовано повторно, хотя оно должно быть стерилизован перед каждым экспериментом. Для дополнительного восстановления перенесите супернатант в свежую 15-миллилитровую трубку с покрытием BSA.Pipette вверх и вниз энергично, чтобы разогнать жировой слой. Центрифуга образца в 450 раз-G в течение 10 минут при комнатной температуре. Аспирировать супернатант, оставляя небольшое количество средств массовой информации в трубке, чтобы избежать аспирации гранулы клетки.Теперь аспирировать aqueous слой из трубки с оригинальной гранулы. Добавьте 10 миллилитров DMEM/F12 в трубку с оригинальной гранулой и перенесите во вторую трубку. Pipette энергично объединить и повторно использовать две гранулы.После центрифугирования при 450-времени-G в течение 10 минут при комнатной температуре, аспирировать супернатант и добавить четыре миллилитров DMEM/F12 в трубку. Добавьте 40 микролитров дезоксирибонуклеазы в подвеску и аккуратно пожмите вручную в течение двух-пяти минут при комнатной температуре. Добавьте шесть миллилитров DMEM/F12 и пипетки тщательно.После центрифугирования трубки в 450 раз-G в течение 10 минут при комнатной температуре, аспирировать супернатант до 0,5-миллилитровой отметки. Переусердуйте гранулы в 10 миллилитров DMEM/F12 и пипетки тщательно. Теперь центрифуга трубки, пульсирует до 450 раз-G и остановки четыре секунды после достижения этой скорости.Повторите мытье шаги еще три раза, чтобы очистить органоиды с помощью центробежной дифференциации. Гранулы теперь должны быть небелого цвета, состоящий только из эпителиальных органоидов. Переусердуйте гранулы в 10 миллилитров DMEM/F12.Pipette тщательно создать однородное решение. Перенесите 50 микролитров в 30-миллиметровую чашку Петри и просмотрите под фазо-контрастным микроскопом в 20X. Подсчитайте количество органоидов с счетчиком.Pipette 50 микролитров органоидов в каждый колодец с низким содержанием пластины. Добавьте 150 микролитров органоидной среды, чтобы довести общий рабочий объем до 200 микролитров. Тщательно замените носитель каждые два дня.Поддержание GFP или D-помидор помечены сырья 264,7 макрофагов в DMEM средств массовой информации дополняется 10%FPS и 1%пенициллин-стрептомицин. Семя клеток в органоидной среде при желаемой плотности. Используйте контраст фазы живых клеток и флуоресцентные изображения для мониторинга проникновения макрофагов с течением времени.Удалите органоидную среду из скважин, тщательно аспирируя. Исправьте образцы с 10%neutral-буферным формалином в течение 15 минут при комнатной температуре. Вымойте фиксированные органоиды три раза в течение пяти минут в 1X PBS.При желании, фиксированные образцы могут храниться при четырех градусах по Цельсию в течение одной недели для дальнейшего окрашивания. После мытья, permeabilize фиксированных органоидов в течение пяти минут. Блок фиксированных органоидов с 5%нормальной сыворотки козы в 0,1%PBST в течение одного часа при комнатной температуре перед стиркой три раза в течение пяти минут с PBS.Инкубировать фиксированные органоиды с анти-цитокератин-14, E-кадерин, или плотно-соединения белка один, в 1%NGS в PBST в течение одного часа при комнатной температуре. Затем мыть три раза в течение пяти минут в PBST. Теперь инкубировать органоиды с козой анти-кролик вторичного антитела с 1%NGS PBST в течение одного часа при комнатной температуре.Накройте фольгой, чтобы избежать воздействия света. После мытья, как и прежде, используйте ядерный краситель для окрашивания ядер в течение примерно получаса. Вымойте окрашенных органоидов в течение пяти минут в PBS три раза.При использовании камерного слайда, смонтировать с крышкой скольжения. Храните органоиды, завернутые в фольгу при четырех градусах по Цельсию в течение двух недель. Облученное органоиды можно было бы обуделить в пластинах с низким содержанием адгезии или в мембране подвала, но наиболее быстрый рост произошел в низкоадезионное покрытие пластин.Органоиды повторили характеристики молочной железы. Наблюдались конструкции, морфологически похожие на протоки и доли. Тенденции роста показали, что, когда органоиды были немедленно посеяны после пищеварения и сортировки, необлученные органоиды росли быстрее, чем облученные органоиды, скорее всего, из-за ареста роста клеток в результате механизмов восстановления повреждения ДНК.Органоиды выражали эпителиальные характеристики, которые оценивались с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания. Облученые органоиды выражали эпителиальные маркеры. Цитокератин-14, маркер миепителия, был сильно выражен на поверхности облученных органоидов.Дополнительно, E-кадерин и туго-соединение протеин одно были выражены внутри клетчатые соединения organoids. Эти белки необходимы для правильной клеточной адгезии. После облучения органоиды продолжали сохранять свои эпителиальные характеристики.Флуоресцентное окрашивание органоидов можно визуализировать в низкой адгезионой пластине с помощью флуоресцентной микроскопии. Однако самая ясная визуализация была получена с помощью конфокальные микроскопии. Исправлена общая интенсивность флуоресценции путем вычитания фона и нормализации по органоидной области.Выращивание органоидов в 96-ну низкой адгезии пластин также упрощенные эксперименты совместной культуры. При сеяных в концентрациях, типичных в молочной железе, макрофаг колокализация увеличивается с облученными органоидами. При выполнении этой процедуры, самое главное помнить, чтобы не переваривать органоиды, и надлежащим образом очистить центробежной дифференциации.После этой процедуры могут быть проведены дополнительные эксперименты по совместной культуре. Органоиды могут быть совместно культурированы с опухолевыми клетками, другими иммунными клетками и стромальными клетками для воссоздания облученной микроокноронности, связанной с рецидивом. Этот метод будет иметь важное значение для оценки того, как нормальное повреждение тканей конкретно влияет на динамику иммунных клеток, и в конечном итоге будет использоваться для понимания механизмов набора опухолевых клеток.Органоиды молочной железы прояснены механизмы развития молочной железы, и надежно recapitulated рака молочной железы в пробирке. Мы надеемся, что наша модель дает представление о вербовке опухолевых клеток, вызванных радиацией.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Axon Stretch Рост: механотрансдукции нейронных рост

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Создание и восстановление β-клетки сфероидов Из Шаг рост PEG-пептида Гидрогели

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

Гормон проблематику 3D Культура модель человеческого эпителия молочной железы

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Intraductal Delivery to the Rabbit Mammary Gland

Внутрипротокового Доставка в Кролика МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and ...

Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

Подготовка и характеристика новых HDL-имитирующих наночастиц для инкапсуляции фактора роста нервов

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Microfluidic подложке для инженерных васкуляризированной ткани и Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

Изготовление и характеристика фантомы оптических ткани, содержащие макроструктуры

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Обнаружения эндотоксинов в нано составов с помощью анализов Lysate (Лал) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Focused Ion Beam Lithography to Etch Nano-architectures into Microelectrodes

Сосредоточенная литография Ионного Луча для наноархитектур etch в микроэлектроды

With advances in electronics and fabrication technology, intracortical microelectrodes have undergone substantial improvements enabling the production of ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Масштабируемое поколение зрелых мозжечковых органоидов из плюрипотентных стволовых клеток человека и характеристика иммуностимулированием

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...