Name: growth and characterization of irradiated organoids from mammary glands
Uploaded: 2019-05-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands at JoVE.com

Vi tackar Dr Laura L. Bronsart för att ge GFP och dTomato-märkta RAW 264,7 makro Fager. Denna forskning stöddes ekonomiskt av NIH Grant #R00CA201304.

Djur studier har utförts i enlighet med de institutionella rikt linjer och protokoll som godkänts av Vanderbilt Universitys institution för djur omsorg och-användning.
1. beredning av möss och cell förvärv (anpassad från Nguyen-Ngoc et al.11)
<ol><li>Offra atymiska nu/nu möss (8-10 veckor gamla) med hjälp av co2 kvävning följt av cervikal Dislokation. Rengör huden med 70% etanol.</li>
	<li>Resect buk-och ljumsk bröst körtlar från möss med p...

<ol>
	<li>Lautner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disparities+in+the+Use+of+Breast-Conserving+Therapy+Among+Patients+With+Early-Stage+Breast+Cancer.">Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer.</a> Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).</li><li>Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregional+recurrence+after+breast+cancer+surgery+a+systematic+review+by+receptor+phenotype.">Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).</li><li>Kim, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Self-Seeding+by+Circulating+Cancer+Cells.">Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells.</a> Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).</li><li>Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Circulating+Breast+Cancer+Cells+Is+Stimulated+by+Radiotherapy.">Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy.</a> Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).</li><li>Rafat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Promote+Circulating+Tumor+Cell-Mediated+Local+Recurrence+following+Radiotherapy+in+Immunosuppressed+Patients.">Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients.</a> Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+Experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li><li>Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interplay+of+matrix+metalloproteinases,+morphogens+and+growth+factors+is+necessary+for+branching+of+mammary+epithelial+cells.">The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells.</a> Development. 128, 3117-3131 (2001).</li><li>Shamir, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist1-induced+dissemination+preserves+epithelial+identity+and+requires+E-cadherin.">Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin.</a> Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).</li><li>Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+Epithelial+Migration+and+Cell+Rearrangements+Drive+Mammary+Branching+Morphogenesis.">Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis.</a> Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+microenvironment+regulates+collective+migration+and+local+dissemination+in+normal+and+malignant+mammary+epithelium.">ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. -. V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Culture+Assays+of+Murine+Mammary+Branching+Morphogenesis+and+Epithelial+Invasion.">3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion.</a> Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).</li><li>Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+mammary+organoids+for+long-term+time-lapse+imaging.">Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews. , (2018).</li><li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+Cells+Regulate+Pulmonary+Metastasis+of+Mammary+Carcinomas+by+Enhancing+Protumor+Properties+of+Macrophages.">CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages.</a> Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).</li><li>Plaks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+Immune+Regulation+of+Mammary+Postnatal+Organogenesis.">Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis.</a> Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).</li><li>Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Proteinase+and+Collagenase+Fromcl.+Histolyticum.">Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum.</a> The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).</li><li>Mandl, I., Zaffuto, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serological+Evidence+for+a+Specific+Clostridium+histolyticum+Geltinase.">Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase.</a> The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).</li><li>Bond, M. D., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Individual+Collagenases+from+Clostridium+histolyticum.">Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum.</a> Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+estrogen-responsive+mouse+mammary+organoids+from+single+Lgr5+cells.">Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells.</a> Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).</li><li>Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+human+breast+tissues+from+patient+cells+in+3D+hydrogel+scaffolds.">Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds.</a> Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).</li><li>Richert, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+mouse+mammary+gland+development.">An atlas of mouse mammary gland development.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).</li><li>Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathways+in+response+to+ionizing+radiation+and+their+targetability+for+tumor+radiosensitization.">Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).</li><li>LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Human+Reduction+Mammoplasty+and+Mastectomy+Tissues+for+Cell+Culture.">Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).</li><li>Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3-D+in+vitro+co-culture+model+of+mammary+gland+involution.">A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution.</a> Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).</li><li>Chanson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells.">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).</li><li>Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+roles+for+macrophages+in+ovarian+cycle-associated+development+and+remodelling+of+the+mammary+gland+epithelium.">Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium.</a> Development. 137, 4229-4238 (2010).</li><li>Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+Adipocyte+Differentiation.">Understanding Adipocyte Differentiation.</a> Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).</li><li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Methods+of+Adipogenic+Differentiation+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li><li>Gabry&#347;, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+Effects+on+the+Cytoskeleton+of+Endothelial+Cells+and+Endothelial+Monolayer+Permeability.">Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).</li><li>Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations+for+long-term+time-lapse+imaging+of+epithelial+morphogenesis+in+three-dimensional+organotypic+cultures.">Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+M1/M2+ratio+of+tumor-associated+macrophages+is+associated+with+extended+survival+in+ovarian+cancer+patients.">A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients.</a> Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).</li><li>Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+M1+form+of+tumor-associated+macrophages+in+non-small+cell+lung+cancer+is+positively+associated+with+survival+time.">The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time.</a> BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).</li></ol>

I detta protokoll har vi utvecklat en metod för reproducerbar tillväxt och karakterisering av bestrålade bröstorganoider (figur 1). En bestrålning dos av 20 Gy tillämpades för att spegla tidigare in vivo modeller av tumör cell rekrytering5. Bestrålning av bröst körtlar ex vivo före organoid bildning tillåtet för isolering av strålning skador effekter utan en motsvarande infiltration av immun celler. Utvecklingen av en in vitro bestrålad normal vävnads...

Cirka 60% av de trippel negativa bröst Cancer (TNBC) patienter väljer bröst-Conserving terapi (BCT) som en form av behandling1. I denna behandling modalitet, tumören som innehåller en del av bröst vävnaden avlägsnas, och omgivande normal vävnad utsätts för joniserande strålning att döda eventuella kvarvarande tumör celler. Behandling minskar recidiv i en stor del av bröst Cancer populationen; emellertid, cirka 13,5% av behandlade patienter med tnbc erfarenhet lokoregional upprepas2. Därför studerar hur strålning kan rekrytera cirkulerande tumör celler (ctcs) kommer att leda till viktiga insikter i lokal upprepning3,4.
Tidigare arbete har visat att strålning av normal vävnad ökar rekryteringen av olika cell typer5. I prekliniska modeller av TNBC, bestrålning av normal vävnad ökad makrofag och därefter tumör cell rekrytering till normala vävnader5. Immun status påverkade tumör cell rekrytering till bestrålade platser, med tumör cell migration observerades hos immunsupprimerade försöks personer. Recapitulating dessa interaktioner med organoider som härrör från bröst körtlar kommer att möjliggöra observation av cell migration och cell-stromal interaktioner i real tid med Mikroskopi och levande cell Imaging att avgöra vilken roll strålnings skador i att ändra tumör cells beteende.
Mus bröst organoider har hjälpt belysa viktiga steg i utvecklingen av bröst körtel. En bröst organoid är en multicellulär, tredimensionell konstruktion av isolerade bröst epitel som är större än 50 μm6,7,8,9,10. Med primära epiteliala organoider, Simian et al. utvärderade nödvändiga faktorer för förgrening i bröst körtel7. Shamir et al. upptäckte att spridning kan ske utan en epitelial till mesenkymala över gång, ger insikt i den metastaserade kaskad8. Metoder för att generera och karakterisera organoider från bröst körtel vävnad är väl etablerade6,11,12,13. Men, såvitt vi vet, metoder för att odla bestrålade organoider från bröst körtlar har inte rapporter ATS. Ett protokoll för att odla och karakterisera bestrålade organoider skulle vara ett kritiskt steg i rekapitulera strålnings-inducerad immun-och tumör cell rekrytering.
I detta dokument rapporterar vi en metod för att odla och karakterisera bestrålade bröst epiteliala organoider i låg vidhäftning Mikroplattor belagda med en hydrofil polymer som stöder bildandet av sfäroider. Dessa organoider var co-odlade med makro Fager att undersöka immun cell infiltration kinetik. Detta arbete kan utvidgas till att omfatta co-culturing organoider med fett celler att upprepa bröst egenskaper, Breast Cancer celler att visualisera tumör cell rekrytering, och CD8 + T-celler för att studera tumör-immun cell interaktioner. Tidigare upprättade protokoll kan användas för att utvärdera bestrålade organoider. Tidigare modeller co-culturing bröst organoider och immun celler har belysa mekanismerna för metastaser och spridning. DeNardo et al. fann att CD4 + T cell reglering av tumörassocierade makro Fager förstärkt en metastaserad fenotyp av bröst adenocarcinom14. Samkulturmodeller har också använts för att belysa mekanismerna för biologisk utveckling. Plaks et al. klargjort rollen av CD4 + T-celler som ner-regulatorer av bröst organogenesen15. Men vår grupp är den första att etablera ett förfarande för att visualisera hur normal vävnads bestrålning påverkar immun cellernas beteende. Eftersom normal vävnads bestrålning har visat sig förbättra tumör cell rekrytering5, detta protokoll kan vidareutvecklas för att analysera hur tumör cell beteende ändras genom bestrålning av normal vävnad och celler, vilket leder till en större förståelse för recidiverat cancer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 14</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab181595</td>
			<td>Lot: GR3200524-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Cadherin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>24E10</td>
			<td>Lot: 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td>green 
			Lot: GR3203000-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150080</td>
			<td>red 
			Lot: GR3192711-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>62249</td>
			<td>Lot: TG2611041</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (10 mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclon Sphera 96 well plates</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>174927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab176757</td>
			<td>Lot: GR3214582-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tight Junction Protein 1</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP1-85047</td>
			<td>Lot: C115428</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>27250-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growth and characterization of irradiated organoids from mammary glands

Organoider som härrör från smält vävnad är flercelliga tredimensionella (3D) konstruktioner som bättre upprepa in vivo villkor än cell monolayers. Även om de inte helt kan modellera in vivo komplexitet, behåller de vissa funktioner i orginal orgeln. I cancer modeller, organoider används ofta för att studera tumör cell invasion. Detta protokoll syftar till att utveckla och karakterisera organoider från den normala och bestrålade mus bröst körtel vävnaden för att utvärdera strålnings reaktionen i normala vävnader. Dessa organoider kan tillämpas på framtida in vitro-cancer studier för att utvärdera tumör cell interaktioner med bestrålade organoider. Bröst körtlar återförvisades, bestrålades till 20 Gy och smälts i en kollagenas VIII-lösning. Epiteliala organoider separerades via centrifugaldifferentiering, och 3D organoider utvecklades i 96-brunn låg vidhäftning Mikroplattor. Organoider uttryckte den karakteristiska epiteliala markören cytokeratin 14. Macrophage interaktion med organoider observerades i Co-Culture experiment. Denna modell kan vara användbart för att studera tumör-stromal interaktioner, infiltration av immun celler, och makrofag polarisering inom en bestrålad mikromiljö.

Bestrålade epiteliala bröst organoider framgångs rikt erhållits från mus bröst körtlar, bearbetas, och odlade på låg friktion plattor (figur 1). Organoid avkastning testades genom sådd i olika tillväxt miljöer (figur 2A-G). Seedning celler direkt på vävnad kultur behandlas 10 cm cell plattor gav en överväxt av fibroblast celler. Fibroblaster identifierades under fas kontrast mikroskopi i eller nära samma plan av fokus som organoider, och de växte snabbt ut ...

Watch this Scientific Journal Video about Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands at JoVE.com

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Organoider som utvecklats från mus bröst körtlar bestrålades och karakteriserades för att bedöma epiteliala egenskaper och interaktioner med immun celler. Bestrålade organoider kan användas för att bättre utvärdera cell-cell interaktioner som kan leda till tumör cell rekrytering i bestrålade normal vävnad.

Tillväxt och karakterisering av bestrålade Organoider från bröst körtlar

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Detta protokoll kan användas och vidareutvecklas för att analysera hur joniserande strålning påverkar tumörcellsrekrytering, vilket leder till en större förståelse för att cancer återkommer. Mammary organoider är kraftfulla modeller. De efterliknar grundläggande in vivo-egenskaper, men de möjliggör enkel isolering av biologiska variabler.Användning av låg-adhesion plattor negerar arbets-flöde utmaningar i samband med protein matriser. Trippelnegativa bröstcancerpatienter upplever lokala regionala återkommande i högre takt efter behandling. Att studera hur strålning påverkar tumör och immuncellsbeteende kommer att leda till viktiga insikter i återkommande mekanismer.Visar konfokalmikroskopi av organoider är Javier Gomez, en doktorand i Silvera Batista labbet. Börja detta förfarande med avlägsnande av buken och inguinal bröstkörtlar från offrade möss som beskrivs i textprotokollet. 45 minuter efter bestrålning av proverna enligt beskrivningen i textprotokollet, placera bröstkörtlar i en 35-millimeters steril cellplatta och färs med skalpell.Färs med cirka 40 slag tills vävnaden slappnar av och bitar erhålls som inte är större än ungefär en kvadratmillimeter i området. Nu överföra vävnaden till kollagenaslösning i en 50-milliliter centrifugrör. Använd 10 milliliter kollagenaslösning per mus.Placera provrören i ett vattenbad i 30 till 60 minuter vid 37 grader Celsius, virvelning i fem sekunder var 10:e minut. Matsmältningen är klar när kollagenlösningen är grumlig. Snurra ner den smälta lösningen i 450-gånger-G i 10 minuter vid rumstemperatur.Nu observeras tre lager. Supernatanten är sammansatt av fett, mellanskiktet är en vattenlösning, och botten är en pellet. Pelleten verkar röd, eftersom det är en blandning av epitelceller, enskilda stromalceller och röda blodkroppar.Förlackera alla pipetter, pipettspetsar, och centrifugrör med BSA-lösning före kontakt genom addition och borttagning av BSA-lösning. BSA-lösning kan återanvändas, även om den bör steril-filtreras före varje experiment. För ytterligare återhämtning, överför supernatanten till ett nytt BSA-överdragna 15-milliliterrör.Pipett upp och ner kraftigt för att skingra fettskiktet. Centrifugera provet vid 450-gånger-G i 10 minuter vid rumstemperatur. Aspirera supernatanten och lämna en liten mängd media i röret för att undvika att aspirera cellpelletsen.Nu aspirera vattenskiktet från röret med den ursprungliga pelleten. Tillsätt 10 milliliter DMEM/F12 till röret med den ursprungliga pelleten, och överför till det andra röret. Pipette kraftfullt att kombinera och återanvända de två pellets.Efter centrifugering vid 450-gånger-G i 10 minuter vid rumstemperatur, aspirera supernatanten och tillsätt fyra milliliter DMEM/F12 till röret. Tillsätt 40 mikroliter av deoxyribonuclease till suspensionen och skaka försiktigt för hand i två till fem minuter vid rumstemperatur. Tillsätt sex milliliter DMEM/F12 och pipetten noggrant.Efter centrifugering röret vid 450-gånger-G i 10 minuter vid rumstemperatur, aspirera supernatanten till 0,5-millilitermärket. Resuspend pelleten i 10 milliliter av DMEM/F12 och pipett grundligt. Nu centrifugera röret genom att pulsera till 450-gånger-G och stoppa fyra sekunder efter att ha nått den hastigheten.Upprepa tvättstegen tre gånger till för att rena organoider via centrifugaldifferentiering. Pelleten ska nu vara en off-white färg som består av endast epitelial organoider. Resuspend pelleten i 10 milliliter av DMEM/F12.Pipetten noggrant för att skapa en homogen lösning. Överför 50 mikroliter till en 30-millimeters Petriskål och visa under ett faskontrastmikroskop vid 20X. Räkna antalet organoider med en stämmer räknare.Pipett 50 mikroliter av organoider i varje brunn av en låg-vidhäftningsplatta. Lägg till 150 mikroliter av organoid medium för att få den totala arbetsvolymen till 200 mikroliter. Byt försiktigt ut mediet varannan dag.Underhåll GFP eller D-tomat-märkt rå 264,7 makrofager i DMEM media kompletteras med 10%FPS och 1%penicillin-streptomycin. Kärna ur cellerna i det organoida mediet vid önskad densitet. Använd live cell faskontrast och fluorescerande avbildning för att övervaka makrofag infiltration över tiden.Ta bort organoid medium från brunnarna genom att försiktigt aspirera. Fixera proverna med 10%neutral-buffrad formalin i 15 minuter vid rumstemperatur. Tvätta de fasta organoiderna tre gånger i fem minuter i 1X PBS.Om så önskas kan fasta prover förvaras vid fyra grader Celsius i en vecka för ytterligare färgning. Efter tvätt, permeabilisera de fasta organoiderna i fem minuter. Blockera de fasta organoiderna med 5%normal getserum i 0,1%PBST i en timme i rumstemperatur innan du tvättar tre gånger i fem minuter med PBS.Inkubera de fasta organoiderna med anticytokeratin-14, E-cadherin, eller tight-junction protein en, i 1%NGS i PBST i en timme vid rumstemperatur. Tvätta sedan tre gånger i fem minuter i PBST. Nu inkubera organoiderna med get anti-kanin sekundär antikropp med 1%NGS PBST i en timme vid rumstemperatur.Täck med folie för att undvika ljusexponering. Efter tvätt som tidigare, använd kärnämne för att färga kärnor i ungefär en halvtimme. Tvätta de färgade organoiderna i fem minuter i PBS tre gånger.Om du använder en kammarrutschbana, montera med en täcksli. Förvara organoiderna insvept i folie i fyra grader Celsius i upp till två veckor. Bestrålade organoider kunde odlas i låg-vidhäftning plattor, eller inom källaren membran, men den mest snabba tillväxten inträffade i låg-vidhäftning plattor.Organoider rekapitulated bröstkörtel egenskaper. Konstruktioner som är morfologiskt liknar kanaler och lober observerades. Tillväxt trender anges att när organoider var omedelbart seedade efter matsmältningen och sortering, icke-bestrålade organoider växte snabbare än bestrålade organoider, troligen på grund av celltillväxt gripande till följd av mekanismer för DNA-skador reparation.Organoider uttryckt epitelial egenskaper, som utvärderades genom immunofluorescerande färgning. Bestrålade organoider uttryckta epitelmarkörer. Cytokeratin-14, en markör för myoepithelium, uttrycktes starkt på ytan av bestrålade organoider.Dessutom, E-cadherin och tight-junction protein en uttrycktes inom cellulära korsningar av organoider. Dessa proteiner är nödvändiga för korrekt celladhesion. Efter bestrålning fortsatte organoider att behålla sina epiteliska egenskaper.Fluorescerande färgning av organoider kan visualiseras inom låg-vidhäftning plattor med fluorescens mikroskopi. Den tydligaste visualiseringen erhölls emellertid via confocal microscopy. Korrigerade totala fluorescens intensitet beräknades genom att subtrahera bakgrunden, och normalisera genom organoid område.Växande organoider i 96-brunnsplattorna med låg vidhäftning förenklade också samkulturexperiment. När sådd vid koncentrationer typiska i bröstkörteln, makrofag colocalization ökade med bestrålade organoider. När du utför detta förfarande, de viktigaste sakerna att komma ihåg är att inte över-smälta organoiderna, och att på lämpligt sätt rena centrifugal differentiering.Efter denna procedur kan ytterligare samkultur experiment utföras. Organoider kan samkultureras med tumörceller, andra immunceller och stromalceller för att återskapa den bestrålade mikromiljö som är associerad med återkommande. Denna metod kommer att vara viktigt för att utvärdera hur normala vävnadsskador specifikt påverkar immuncelldynamiken, och kommer så småningom att användas för att förstå tumörcellsrekryteringsmekanismer.Mammary organoider har klarlagt mekanismer för bröstkörtel utveckling, och har robust rekapitulerade bröstcancer in vitro. Vi hoppas att vår modell ger insikter om strålningsinducerad tumörcellsrekrytering.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Axon Stretch Tillväxt: Den Mechanotransduction av neuronala tillväxt

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generering och återvinning av β-cell sfäroider från steg-tillväxt PEG-peptid Hydrogeler

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

Ett hormon känslig 3D Kultur av humana bröstkörteln epitel

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Intraductal Delivery to the Rabbit Mammary Gland

Intraduktal Leverans till kaninen bröstkörteln

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and ...

Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

Framställning och karaktärisering av nya HDL-imiterande nanopartiklar för nervtillväxtfaktorkapsling

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Simuleras Bioprinting för Engineering vaskulariserad vävnad och Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

Tillverkning och karakterisering av optiska vävnad fantomer som innehåller Makrostrukturell

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Påvisande av Endotoxin i Nano-formuleringar använder Limulus immobiliserat Lysate (LAL) analyser

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Focused Ion Beam Lithography to Etch Nano-architectures into Microelectrodes

Fokuserad jonstråle litografi till etch nano-arkitekturer i mikroelektroder

With advances in electronics and fabrication technology, intracortical microelectrodes have undergone substantial improvements enabling the production of ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Skalbar Generation av Mogna Cerebellar Organoids från Mänskliga Pluripotenta stamceller och karakterisering av Immunfärgning

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...