Name: growth and characterization of irradiated organoids from mammary glands
Uploaded: 2019-05-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands at JoVE.com

Biz GFP ve dTomato etiketli RAW 264,7 macrofajlar sağlamak için Dr Laura L. Bronsart teşekkür ederiz. Bu araştırma NıH Grant #R00CA201304 tarafından mali olarak destekleniyordu.

Hayvan çalışmaları, Vanderbilt Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanan kurumsal yönergeler ve protokollere uygun olarak yapılmıştır.
1. fareler ve hücre alımı hazırlanması (Nguyen-Ngoc ve al.11uyarlanmıştır)
<ol><li>Co2 boğulma kullanarak atymic Nu/nu fareler (8-10 hafta eski) kurban servikal dislocation takip. 70% etanol kullanarak cildi temizleyin.</li>
	<li>Ön sterilize makas ve forseps kullan...

<ol>
	<li>Lautner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disparities+in+the+Use+of+Breast-Conserving+Therapy+Among+Patients+With+Early-Stage+Breast+Cancer.">Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer.</a> Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).</li><li>Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregional+recurrence+after+breast+cancer+surgery+a+systematic+review+by+receptor+phenotype.">Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).</li><li>Kim, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Self-Seeding+by+Circulating+Cancer+Cells.">Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells.</a> Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).</li><li>Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Circulating+Breast+Cancer+Cells+Is+Stimulated+by+Radiotherapy.">Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy.</a> Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).</li><li>Rafat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Promote+Circulating+Tumor+Cell-Mediated+Local+Recurrence+following+Radiotherapy+in+Immunosuppressed+Patients.">Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients.</a> Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+Experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li><li>Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interplay+of+matrix+metalloproteinases,+morphogens+and+growth+factors+is+necessary+for+branching+of+mammary+epithelial+cells.">The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells.</a> Development. 128, 3117-3131 (2001).</li><li>Shamir, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist1-induced+dissemination+preserves+epithelial+identity+and+requires+E-cadherin.">Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin.</a> Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).</li><li>Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+Epithelial+Migration+and+Cell+Rearrangements+Drive+Mammary+Branching+Morphogenesis.">Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis.</a> Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+microenvironment+regulates+collective+migration+and+local+dissemination+in+normal+and+malignant+mammary+epithelium.">ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. -. V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Culture+Assays+of+Murine+Mammary+Branching+Morphogenesis+and+Epithelial+Invasion.">3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion.</a> Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).</li><li>Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+mammary+organoids+for+long-term+time-lapse+imaging.">Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews. , (2018).</li><li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+Cells+Regulate+Pulmonary+Metastasis+of+Mammary+Carcinomas+by+Enhancing+Protumor+Properties+of+Macrophages.">CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages.</a> Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).</li><li>Plaks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+Immune+Regulation+of+Mammary+Postnatal+Organogenesis.">Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis.</a> Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).</li><li>Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Proteinase+and+Collagenase+Fromcl.+Histolyticum.">Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum.</a> The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).</li><li>Mandl, I., Zaffuto, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serological+Evidence+for+a+Specific+Clostridium+histolyticum+Geltinase.">Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase.</a> The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).</li><li>Bond, M. D., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Individual+Collagenases+from+Clostridium+histolyticum.">Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum.</a> Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+estrogen-responsive+mouse+mammary+organoids+from+single+Lgr5+cells.">Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells.</a> Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).</li><li>Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+human+breast+tissues+from+patient+cells+in+3D+hydrogel+scaffolds.">Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds.</a> Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).</li><li>Richert, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+mouse+mammary+gland+development.">An atlas of mouse mammary gland development.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).</li><li>Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathways+in+response+to+ionizing+radiation+and+their+targetability+for+tumor+radiosensitization.">Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).</li><li>LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Human+Reduction+Mammoplasty+and+Mastectomy+Tissues+for+Cell+Culture.">Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).</li><li>Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3-D+in+vitro+co-culture+model+of+mammary+gland+involution.">A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution.</a> Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).</li><li>Chanson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells.">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).</li><li>Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+roles+for+macrophages+in+ovarian+cycle-associated+development+and+remodelling+of+the+mammary+gland+epithelium.">Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium.</a> Development. 137, 4229-4238 (2010).</li><li>Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+Adipocyte+Differentiation.">Understanding Adipocyte Differentiation.</a> Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).</li><li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Methods+of+Adipogenic+Differentiation+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li><li>Gabry&#347;, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+Effects+on+the+Cytoskeleton+of+Endothelial+Cells+and+Endothelial+Monolayer+Permeability.">Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).</li><li>Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations+for+long-term+time-lapse+imaging+of+epithelial+morphogenesis+in+three-dimensional+organotypic+cultures.">Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+M1/M2+ratio+of+tumor-associated+macrophages+is+associated+with+extended+survival+in+ovarian+cancer+patients.">A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients.</a> Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).</li><li>Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+M1+form+of+tumor-associated+macrophages+in+non-small+cell+lung+cancer+is+positively+associated+with+survival+time.">The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time.</a> BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).</li></ol>

Bu protokolde, ışınlanmış meme organoidlerin tekrarlanabilir büyümesi ve karakterize edilmesi için bir yöntem geliştirdik (Şekil 1). Tümör hücresi işe alma5' in vivo modellerinin önceki yansımaları Için 20 GY ışınlama dozu uygulandı. Meme bezlerinin ışınlanması ex vivo önce nevuslardır oluşumu bağışıklık hücrelerinin karşılık gelen infiltrasyon olmadan radyasyon hasar etkileri yalıtım için izin. Bir in vitro ışınlanmış no...

Üçlü negatif meme kanseri (TNBC) hastalarının yaklaşık% 60 ' i meme arıtma terapisi (BCT) tedavi formu olarak seçilir1. Bu tedavi modalitesi, meme dokusunun bir kısmını içeren tümör kaldırılır, ve çevredeki normal doku herhangi bir kalıntı tümör hücrelerini öldürmek için iyonlaştırıcı radyasyona maruz kalır. Tedavi meme kanseri nüfusunun çoğunu tekrarı azaltır; Ancak TNBC ile tedavi edilen hastaların yaklaşık% 13,5 ' si, bölgesel nüks2. Bu nedenle, radyasyonun nasıl dolaşabilir tümör hücrelerini (ctcs) araştırarak yerel nüks3,4içine önemli anlayışlar yol açacaktır.
Önceki çalışma normal doku radyasyonun çeşitli hücre türleri işe artırdığını göstermiştir5. TNBC 'nin klinik öncesi modellerinde, normal dokuların ışınlanması makrophaj ve sonra tümör hücresi alımı normal dokulara5' e yükseldi. İmmün durum bağışıklık sistemi etkilenen konularda gözlenen tümör hücre göç ile, ışınlanmış sitelere tümör hücre işe etkilediği. Meme bezlerinden elde edilen organoidleri kullanarak bu etkileşimlerin reapitasyonu, hücre göçü ve hücre-stromal etkileşimlerini gerçek zamanlı olarak mikroskopi ve canlı hücre görüntüleme ile gözlemlemek, radyasyon hasarının rolünü belirlemek için tümör hücre davranışı.
Fare meme organoids Meme bezinin gelişiminde önemli adımlar aydınlatmak yardımcı oldu. Bir meme nevuslardır, 50 μm6,7,8,9,10' dan daha büyük olan yalıtılmış meme epitelin bir çok hücreli, üç boyutlu yapısıdır. Primer epitelyal organoidleri kullanarak, Simian ve al. meme bezinde dallanma için gerekli faktörler değerlendirildi7. Shamir ve ark. yaygınlaştırma, epitelyal geçiş için epitel olmadan ortaya çıkabilir, metastaz Cascade8içine anlayış sağlayan keşfetti. Meme bezi dokusundan organoidlerin oluşturulması ve karakterize edilmesi için yöntemler iyi kurulmuştur6,11,12,13. Ancak, bilgimize, meme bezlerinden ışınlanmış organoidlerin büyüyen yöntemleri bildirilmemiştir. Radyasyon kaynaklı bağışıklık ve tümör hücresi işe alma reapitulating için bir protokol büyüyen ve ışınlanmış organoids karakterize için kritik bir adım olacaktır.
Bu yazıda, küre oluşumunu destekleyen bir hidrofilik polimer ile kaplı düşük yapışkanlık mikroplaklarda ışınlanmış meme epitelyal organoidleri büyüyen ve karakterize etmek için bir yöntem bildiriyoruz. Bu organoidler, immün hücre infiltrasyonu kinetiği incelemek için makrofajlar ile birlikte Kültürlenmiş. Bu çalışma, meme özellikleri, göğüs kanseri hücrelerinin tümör hücre işe alma görselleştirmek için adipoz hücreleri ile Co-kültürü organoids dahil etmek için genişletilebilir ve tümör-immün hücre etkileşimlerini incelemek için CD8 + T hücreleri. Daha önce kurulan protokoller ışınlanmış organoidleri değerlendirmek için kullanılabilir. Önceki modeller meme organoidleri ve bağışıklık hücrelerinin ortak kültür metastaz ve yayma mekanizmaları ışık dökmeye. DeNardo ve al. bu CD4 + T hücre yönetmeliğinin ilişkili makrofajlar meme adenokarsinomların metastatik phenoype geliştirilmiş bulundu14. Co-kültür modelleri de biyolojik gelişim mekanizmaları aydınlatmak için kullanılmıştır. Plaks ve ark., meme organogenezi15' in aşağı regülatörleri olarak CD4 + T hücrelerinin rolünü açıklığa kavuşturuldu. Ancak, grubumuz normal doku ışınlarının bağışıklık hücresi davranışlarını nasıl etkilediğini görselleştirerek ilk kez bir prosedür oluşturmaktır. Çünkü normal doku ışınlama tümör hücre işe alma geliştirmek için gösterilmiştir5, bu protokol daha büyük bir anlayış önde gelen, normal doku ve hücrelerin radyasyon ile nasıl değişmiş tümör hücre davranışını analiz etmek için geliştirilmiş olabilir Kanser nüks.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 14</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab181595</td>
			<td>Lot: GR3200524-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Cadherin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>24E10</td>
			<td>Lot: 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td>green 
			Lot: GR3203000-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150080</td>
			<td>red 
			Lot: GR3192711-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>62249</td>
			<td>Lot: TG2611041</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (10 mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclon Sphera 96 well plates</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>174927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab176757</td>
			<td>Lot: GR3214582-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tight Junction Protein 1</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP1-85047</td>
			<td>Lot: C115428</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>27250-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growth and characterization of irradiated organoids from mammary glands

Sindirilmiş dokudan elde edilen organoidler çok hücreli üç boyutlu (3D) daha iyi hücre monolayerlere kıyasla vivo koşullarda özetlemek yapıları vardır. Tamamen içinde vivo karmaşıklık modeli olamaz rağmen, onlar orijinal organ bazı işlevselliği korumak. Kanser modellerinde, organoids yaygın tümör hücre istilası çalışmak için kullanılır. Bu protokol, normal dokularda radyasyon tepkisi değerlendirmek için normal ve ışınlanmış fare meme bezi dokusu organoids geliştirmek ve karakterize amaçlamaktadır. Bu organoidler, radyasyonlu organoidlerle tümör hücresi etkileşimlerini değerlendirmek için gelecekteki in vitro kanser çalışmalarına uygulanabilir. Mammary bezleri, 20 GY 'ye ışınlanmış ve kolajenaz VIII çözeltisi içinde sindirilmiş, rezeke edildi. Epitelyal organoidler Santrifüjlü farklılaşma yoluyla ayrıldı ve 96-iyi düşük yapışkanlık mikroplaklarda 3D organoidler geliştirilmiştir. Organoids karakteristik epitelyal Marker Sito 14 ifade. Ortak kültür deneylerinde organoidlerle makrophaj etkileşimi gözlenmiştir. Bu model tümör-stromal etkileşimleri, bağışıklık hücrelerinin infiltrasyonu ve radyasyonlu bir mikroçevre içinde makrophaj polarizasyon okumak için yararlı olabilir.

Radyasyonlu epitelyal meme organoidler, fare meme bezlerinden başarıyla elde edildi, işlenmiş ve düşük yapışkanlık plaklarda kültürlü (Şekil 1). Organoid verim farklı büyüme ortamlarında tohumlama ile test edildi (Şekil 2a-G). 10 cm hücreli plakalı tedavi edilen doku kültürünü doğrudan tohumlama hücreleri fibroblast hücrelerinin bir aşırı büyümesini sağladı. Fibroblastlar, organoidler olarak aynı odak düzleminde veya yakın faz kontrast m...

Watch this Scientific Journal Video about Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands at JoVE.com

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Fare meme bezlerinden geliştirilen organoidler ışınlanmış ve epitelyal özellikleri ve immün hücrelerle etkileşimleri değerlendirmek için karakterize edilmiştir. Işınlanmış organoids daha iyi radyal normal dokuda tümör hücre işe neden olabilir hücre hücre etkileşimleri değerlendirmek için kullanılabilir.

Mammary bezlerinden ışınlanmış Organoidlerin büyüme ve karakterizasyonu

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Bu protokol, iyonlaştırıcı radyasyonun tümör hücre alımını nasıl etkilediğini analiz etmek için kullanılabilir ve geliştirilebilir ve kanser nüksünün daha iyi anlaşılmasına yol açabilmektedir. Meme organoidleri güçlü modellerdir. Temel in vivo özelliklerini taklit ederler, ancak biyolojik değişkenlerin kolayca izole edilmesine izin verirler.Düşük yapışma plakalarının kullanımı protein matrisleri ile ilişkili iş akışı zorluklarını inkâr eder. Üçlü negatif meme kanseri hastaları tedavi sonrası daha yüksek oranlarda lokal bölgesel nüks yaşarlar. Radyasyonun tümör ve bağışıklık hücresi davranışını nasıl etkilediğinin araştırılması nüks mekanizmalarına ilişkin önemli içgörülere yol açacaktır.Organoidlerin konfokal mikroskopisini gösteren Javier Gomez, Silvera Batista laboratuvarında yüksek lisans öğrencisi. Bu prosedüre, metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği şekilde kurban edilen farelerden karın ve inguinal meme bezlerinin çıkarılması ile başlayın. Metin protokolünde açıklandığı gibi örneklerin ışınlama sonra 45 dakika, 35 milimetrelik steril hücre plakası ve neşter ile kıyma meme bezleri yerleştirin.Doku rahatlayana kadar yaklaşık 40 vuruş ile kıyma ve alan yaklaşık bir milimetre den büyük parçalar elde edilir. Şimdi 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde kollajenaz çözeltisine doku aktarın. Fare başına 10 mililitre kollajenaz çözeltisi kullanın.Örnek tüpleri 37 santigrat derecede 30 ila 60 dakika su banyosuna yerleştirin ve her 10 dakikada bir beş saniye girdap layın. Kollajenaz çözeltisi bulutlu olduğunda sindirim tamamlanır. Sindirilmiş çözeltiyi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 450-g'de aşağı doğru çevirin.Şimdi üç katman gözlenmektedir. Supernatant yağ oluşur, orta tabaka sulu bir çözümdür, ve alt bir pelet olduğunu. Pellet kırmızı görünür, epitel hücreleri bir karışımı olarak, bireysel stromal hücreler, ve kırmızı kan hücreleri.BSA çözeltisinin eklenmesi ve çıkarılması ile temas tan önce tüm pipetleri, pipet uçlarını ve Santrifüj tüplerini BSA solüsyonu ile ön katlayın. BSA çözümü yeniden kullanılabilir, ancak her denemeden önce steril filtreuygulanmalıdır. Ek kurtarma için, yeni bir BSA kaplı 15 mililitrelik tüp supernatant aktarın.Pipet yukarı ve aşağı şiddetle yağ tabakası dağıtmak için. Numuneyi 450-0-G'de oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj edin. Süpernatant aspire, hücre pelet aspire önlemek için tüp içinde medya küçük bir miktar bırakarak.Şimdi orijinal pelet ile tüpten sulu tabaka aspire. Orijinal peletle tüpe 10 mililitre DMEM/F12 ekleyin ve ikinci tüpe aktarın. Pipet şiddetle birleştirmek ve iki pelet yeniden askıya almak.Oda sıcaklığında 10 dakika 450-kat-G santrifüj ettikten sonra, supernatant aspire ve tüp emme/F12 dört mililitre ekleyin. Süspansiyona 40 mikrolitre deoksiribonükle azmverin ve oda sıcaklığında 2-5 dakika hafifçe elle titretin. Altı mililitre DMEM/F12 ve pipeti iyice ekleyin.Tüpü oda sıcaklığında 10 dakika 450-kat-G'de santrifüj ettikten sonra, süpernatant'ı 0,5 mililitrelik işaretine kadar aspire edin. Peleti 10 mililitre DMEM/F12 ve pipette iyice yeniden askıya alın. Şimdi tüpü 450 kat-G'ye kadar titreşerek ve bu hıza ulaştıktan sonra dört saniye durdurarak santrifüj edin.Santrifüj farklılaşması ile organoidleri arındırmak için yıkama adımlarını üç kez daha tekrarlayın. Pelet artık sadece epitel organoidlerden oluşan beyaz olmayan bir renk olmalıdır. Peleti 10 mililitre DMEM/F12'de yeniden askıya alın.Pipet iyice homojen bir çözüm oluşturmak için. 50 mikrolitreyi 30 milimetrelik Petri kabına aktarın ve 20X'te faz kontrastlı mikroskop altında görüntüleyin. Bir sayım sayacı ile organoidlerin sayısını sayMak.Pipet 50 mikrolitre organoidin her bir kuyuya düşük yapışma plakası. 200 mikrolitre toplam çalışma hacmi getirmek için organoid orta 150 mikrolitre ekleyin. Dikkatle her iki günde bir orta değiştirin.%10 FPS ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenen DMEM ortamlarında GFP veya D-domates etiketli ham 264,7 makrofajları koruyun. İstenilen yoğunlukta hücreleri organoid ortama tohum. Zaman içinde makrofaj infiltrasyon izlemek için canlı hücre faz kontrastı ve floresan görüntüleme kullanın.Dikkatlice keserek kuyulardan organoid ortamı çıkarın. Numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %10 nötr tamponlu formalin ile düzeltin. 1X PBS'de sabit organoidleri beş dakika boyunca üç kez yıkayın.İstenirse, sabit numuneler daha fazla boyama için bir hafta boyunca dört santigrat derecede saklanabilir. Yıkamadan sonra, beş dakika boyunca sabit organoidler permeabilize. Sabit organoidleri %0.1 PBST'de %5 normal keçi serumu ile oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edin ve pbs ile beş dakika boyunca üç kez yıkanın.Sabit organoidleri anti-sitokeratin-14, E-kadherin veya sıkı bağlantı proteini olan, PBST'de %1 NGS'de oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Sonra PBST beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Şimdi oda sıcaklığında bir saat boyunca% 1 NGS PBST ile keçi anti-tavşan ikincil antikor ile organoidler kuluçka.Hafif maruz kalmamak için folyo ile kaplayın. Daha önce olduğu gibi yıkadıktan sonra, yaklaşık yarım saat çekirdekleri leke lemek için nükleer boya kullanın. Lekeli organoidleri PBS'de beş dakika üç kez yıkayın.Bir oda slayt kullanıyorsanız, bir kapak kayma ile monte. Folyoya sarılmış organoidleri dört santigrat derecede iki haftaya kadar saklayın. Işınlanmış organoidler düşük yapışma plakalarında veya bazal membran içinde kültürlenebilir, ancak en hızlı büyüme düşük yapışma plakalarında meydana gelmiştir.Organoidler meme bezi özelliklerini recapitulated. Kanal ve loblara morfolojik olarak benzeyen yapılar gözlendi. Büyüme eğilimleri, organoidlerin sindirim ve sıralamadan sonra hemen tohumlandığında, ışınlanmamış organoidlerin ışınlanmış organoidlerden daha hızlı büyüdüğünü, büyük olasılıkla DNA hasar onarım mekanizmalarından kaynaklanan hücre büyümesi nedeniyle ortaya çıktıklarını göstermiştir.Organoidler immünoresan boyama yoluyla değerlendirilen epitel özelliklerini ifade ettiler. Işınlanmış organoidler epitel belirteçlerini ifade ettiler. Sitokeratin-14, miyoepitelyum bir belirteç, güçlü ışınlanmış organoidlerin yüzeyinde ifade edildi.Ayrıca, E-kadherin ve sıkı kavşak protein bir organoidlerin hücresel kavşakiçinde ifade edildi. Bu proteinler uygun hücre yapışması için gereklidir. Işınlama dan sonra, organoidler epitel özelliklerini korumaya devam ettiler.Organoidlerin floresan boyama floresan mikroskopi kullanılarak düşük yapışma plakaları içinde görselleştirilebilir. Ancak en net görüntüleme konfokal mikroskopi ile elde edilerek elde edilebildi. Düzeltilmiş toplam floresan yoğunluğu arka plan çıkarılarak ve organoid alan tarafından normale döndürülerek hesaplandı.96 kuyulu düşük yapışma plakalarında büyüyen organoidler de ortak kültür deneylerini basitleştirdi. Meme bezinde tipik konsantrasyonlarda tohumlandığında, ışınlanmış organoidlerle makrofaj kolokalizasyonu artmıştır. Bu işlemi gerçekleştirirken hatırlanması gereken en önemli şey organoidleri aşırı sindirmemek ve santrifüj farklılaşmasını uygun şekilde arındırmak.Bu yordamı takiben, ek ortak kültür deneyleri yapılabilir. Organoidler tümör hücreleri ile birlikte kültürolabilir, diğer bağışıklık hücreleri, ve stromal hücreleri nüks ile ilişkili ışınlanmış mikroortamı yeniden oluşturmak için. Bu yöntem, normal doku hasarının özellikle bağışıklık hücre dinamiklerini nasıl etkilediğini değerlendirmek için önemli olacak ve sonunda tümör hücre işe alım mekanizmalarını anlamak için kullanılacaktır.Meme organoidleri meme bezi gelişimi mekanizmaları açıklanmış var, ve in vitro sağlam recapitulated meme kanseri var. Biz modelradyasyona bağlı tümör hücre alımı hakkında anlayışlar sağlar umuyoruz.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Akson Streç Büyüme: Nöronal Büyüme Mechanotransduction

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Adım büyüme PEG-peptid Hidrojeller kaynaktan β-hücre sferoidlerin Üretimi ve Kurtarma

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

İnsan Meme Bezi Epitelinin Bir Hormon duyarlı 3D Kültür Modeli

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Intraductal Delivery to the Rabbit Mammary Gland

Rabbit Meme Bezi için İntraduktal Teslimat

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and ...

Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

Sinir Büyümesi Faktörü Kapsüllemesi için Yeni HDL&#39;yi taklit eden Nanopartiküllerin Hazırlanması ve Karakterizasyonu

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Mikrosıvısal Bioprinting mühendisliği için doku ve Organoids skarların

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

İmalat ve Macrostructure içeren optik doku hayaletler karakterizasyonu

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Nano-formülasyonları endotoksin tespiti Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) deneyleri kullanarak

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Focused Ion Beam Lithography to Etch Nano-architectures into Microelectrodes

Etch Nano mimarilerine mikroelektrotlara odaklanmış iyon ışını Litografisi

With advances in electronics and fabrication technology, intracortical microelectrodes have undergone substantial improvements enabling the production of ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Olgun Serebellar Organoidlerin Ölçeklenebilir Üretimi ve İmmünboyama ile Karakterizasyonu

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...