Name: hybrid clear/blue native electrophoresis for the separation and analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes
Uploaded: 2019-05-19T14:00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes at JoVE.com

ويود المؤلفون ان يشكروا جينا روسي علي المساعدة التقنية ، والدكتور ميرييل خاتشو ، والدكتور ديفيد باتن ، والدكتور اوفال أنيل كومار لمناقشه مفيده اثناء تطوير هذه الطريقة. تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR) والمجلس الوطني للعلوم والهندسة في كندا (NSERC). AC هو المتلقي لجائزه الدكتوراه-فريدريك بانتينغ وتشارلز أفضل كندا المنح الدراسية العليا (CIHR).

1. SC استخراج
<ol><li>اعداد 100 مل من المخزن المؤقت استخراج (انظر الجدول 2) عن طريق حل أدتا في الماء. زيادة درجه الحموضة مع كوة حتى يذوب تماما ، ثم ضبط درجه الحموضة إلى 7.5 مع HCl. أضافه المكونات المتبقية إلى الحل ، واستكمال الحجم النهائي مع الماء ، والحفاظ علي الجليد. في أنبوب ، تذوب ديجيتونين في المخزن المؤقت الاستخراج لجعل 10 ٪ حل الأوراق المالية ، دوامه تماما حتى يذوب تماما ، والحفاظ علي الجليد. ملاحظه: يمكن اعداد المخزن المؤقت الاستخراج مقدما والاحتفاظ بها في 4 درجه مئوية لمده شهرين كحد اقصي. إذا العصابات المتموجة تبدا في الظهور في الجزء السفلي من هلام ، فانه يعني المخزن المؤقت الاستخراج قديمه جدا. عند اعداد الحل ديجيتونين 10 ٪ ، واعداد حجم الأسهم عد 500 μL لكل عينه في حاله استخدام الماوس الميتوكوندريا الكبد. ديجيتونين الذوبان يختلف علي المصدر والمنتج الكثير (انظر جدول المواد).</li>
	<li>الميتوكوندريا معزولة من الانسجه الحيوانية (القلب الماوس ، العضلات ، الكبد ؛ الفئران القلب) أو الخلايا (الإنسان الليفية) باستخدام البروتوكولات القياسية23،24،25 يمكن استخدامها لاستخراج SCs. وبمجرد الحصول علي الميتوكوندريا, كميه البروتين المحتوي باستخدام حمض bicinشونغينيك عده الفحص وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. تكمله الميتوكوندريا معزولة مع بروتينيه ومثبطات فوسفواسات في هذه الخطوة حسب الحاجة. ملاحظه: يمكن استخراج SCs اما علي الميتوكوندريا الطازجة أو المذابة. فمن المستحسن لاستخراج SCs من جميع العينات في نفس الوقت ، لضمان انها تعامل مع نفس الدفعات من الحلول وتحت نفس الشروط.</li>
	<li>استنادا إلى تركيز البروتين الميتوكوندريا التي تم الحصول عليها ، ونسبه الديجيتونين/البروتين النهائية المطلوبة ، حساب حجم المخزون ديجيتونين الحل والمخزن المؤقت الاستخراج المطلوبة وفقا للجدول 1. لاستخراج SC ، أضافه 1 μL من المخزن المؤقت استخراج (الجدول 2) التي تحتوي علي ديجيتونين لكل 10 ميكروغرام من بروتين الميتوكوندريا. يمكن ان تختلف نسبه ديجيتونين/البروتين من 2 إلى 8 غرام/غرام. وينبغي دائما ان يتم اجراء المعايرة الديجيتونينه لكل نوع جديد من العينات المستخدمة (انظر الشكل 2 للحصول علي مثال).</li>
	<li>بيليه الميتوكوندريا ، في أنبوب 1.5 mL بواسطة طرد في 16,000 x g ل 10 دقيقه في 4 °c.</li>
	<li>تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بيليه الميتوكوندريا في الحجم المحسوب من الجليد الباردة استخراج العازلة التي تحتوي علي ديجيتونين. وضع أنابيب علي المدورة أنبوب صغير واحتضان لمده 30 دقيقه في 4 درجه مئوية بسرعة دوران متوسطه. تاكد من ان العينات الحصول علي مختلطة بشكل صحيح.</li>
	<li>عينات الطرد المركزي في 20,400 x ز ل 45 دقيقه في 4 °c لأزاله شظايا insolubilized.</li>
	<li>نقل ماده طافي في أنبوب جديد علي الجليد وكميه البروتينات. هذا الكسر يمثل استخراج المجمعات التنفسية. إذا لم يتم تنفيذ الكهربائي في نفس اليوم ، وتخزين العينات في-80 درجه مئوية. ملاحظه: 1) تجنب دورات التجميد/ذوبان الجليد من استخراج ، لان هذا يعطل الترتيبات الجزيئية اعلي من SCs. عينه Aliquot قبل أول تجميد/ذوبان دوره إذا لزم الأمر. 2) لاجراء تجربه BN صفحه القياسية ، يجب أضافه CB إلى استخراج SCs في هذه الخطوة. وينبغي أضافه CB في نسبه 1g/8g بالنسبة لكميه المنظفات المستخدمة.</li>
</ol>2. التدرج هلام الصب والكهربائي
<ol><li>اعداد العازل المتدرج 3x والأسهم الاكريلاميد لصنع هلام التدرج ، aliquot ، وتخزين عند-20 درجه مئوية (انظر الجدول 3).</li>
	<li>اعداد الآنود والكاثود المخازن المؤقتة والحفاظ علي 4 درجه مئوية (انظر الجدول 5).</li>
	<li>فتح غرفه الصب ووضع لوحه الزجاج الخارجي (20 سم × 22 سم) في الغرفة. ضع مجموعه واحده من الفواصل (1.5 مم) باستخدام بطاقة المحاذاة لضمان انها جالسه بقوة ضد جانب وزوايا الغرفة. وضع لوحه الزجاج الداخلي (20 سم × 20 سم) علي راس الفواصل (وهذا يشكل ساندويتش هلام) ، ووضع ورقه فصل من البلاستيك علي راس لوحه الزجاج.</li>
	<li>كرر الخطوة 2.3 حتى يتم الوصول إلى العدد المطلوب من الهلام للادلاء. لهذا البروتوكول ، يتم casted 4 الهلام. نظام الصب الغرفة التي نستخدمها (انظر جدول المواد) يسمح الصب من الحد الأقصى من 10 الهلام في وقت. اتخاذ المتابعة المساحة المتبقية في الغرفة عن طريق أضافه العديد من كتل الأكريليك حسب الحاجة ، ومن ثم لوحات الزجاج إذا لزم الأمر. ملاحظه: المونتاج يجب ان تكون مختومه باحكام; يجب ان يكون هناك اي مساحة بين السندويشات هلام في الغرفة.</li>
	<li>وضع شريط من بارافيلم في الأخدود قبل الجلوس طوقا بحزم في الشق طوقا. وضع لوحه الختم علي الغرفة وتشديد جميع مسامير 6. الوقوف في غرفه الصب.</li>
	<li>وضع التدرج السابق علي لوحه ضجة مع الركاب المغناطيسي في "ضوء" غرفه الاختلاط. ربط أنابيب من غرفه الصب إلى التدرج السابق ، وتامين الأنابيب في الكاسيت من المضخة التمعجيه ، وتاكد من إغلاق الانحدار من التدرج السابق.</li>
	<li>ليلقي 4 الهلام ، واعداد 60 مل من 4 ٪ و 60 مل من حلول هلام 12 ٪ (انظر الجدول 4) في قارورة Erlenmeyer ودوامه جيدا لخلط. صب 60 مل من محلول هلام 4 ٪ في "ضوء" غرفه خلط ، و 60 مل من 12 ٪ في "الثقيلة" غرفه الخزان من التدرج السابق. تعيين سرعه تحريك لوحه ضجة في 350 لفه في الدقيقة. فتح محبس وتشغيل المضخة في 35 دوره في الدقيقة.</li>
	<li>وبمجرد ان يكون الكسر الخفيف اقل من الجزء الثقيل ، أوقف المضخة وافتح جذع الصمام بين الخزانات "الخفيفة" و "الثقيلة" ، واترك الكسور تتوازن الحجم ، واعد تشغيل المضخة. ملاحظه: من المهم ان لا فقاعات دخول النظام والحصول علي المحاصرين بين لوحات الزجاج. إذا حدث هذا ، فقم بالتراجع عن المونتاج والغسل والاعاده.</li>
	<li>مره واحده يتم سكب هلام التدرج تماما ، ووقف المضخة ، وتراكب المياه (حوالي 1 مل) علي كل ساندويتش هلام لمنع تجفيف هلام. دع تتبلمر لمده 2 ساعة.</li>
	<li>اعداد 25 مل هلام التراص في Erlenmeyer ودوامه لخلط جيدا. أزاله الماء وادراج 15 أمشاط جيدا في كل ساندويتش هلام. صب هلام التراص والسماح لتتبلمر 2 ح. ملاحظه: يمكن وضع الهلام والاحتفاظ بها في 4 درجه مئوية لمده أسبوع واحد.</li>
	<li>ادراج هلام في المشابك ساندويتش وأزاله المشط. مع لوحه الزجاج القصيرة التي تواجه أسفل ، ادراج ساندويتش هلام في لب التبريد. كرر علي الجانب الآخر ، ووضع الاساسيه في خزان الكهربائي.</li>
	<li>صب 300 مل من الكاثود الأزرق العازلة في الغرفة الداخلية للدبابات الكهربائي. صب 2 لتر من الآنود العازلة في الغرفة الخارجية للدبابات الكهربائي. ملاحظه: القطب الكهربائي يجب ان تكون مغمورة في المخزن المؤقت الكاثود ، والذي يتطلب ما يقرب من 300 mL.</li>
	<li>الحمل بين 75 ميكروغرام و 175 ميكروغرام من البروتين في البئر. تشغيل هلام في 150 V ل 1.5 h (أو حتى العينات قد دخلت كل هلام التدرج) في غرفه بارده (4 درجه مئوية). ملاحظه 1:1) الحد الأدنى من 75 ميكروغرام لكل بئر مطلوب لدقه جيده من نطاقات النشاط في هلام. تحميل أكثر من 175 ميكروغرام من البروتين سوف يؤدي إلى فقدان العصابات واضحة بسبب نشاط الانزيم المفرط. 2) وينبغي تحميل نسخ متماثلة من العينة في الآبار منفصلة لتمكين تحديد موازيه للانشطه في هلام وتحليل المناعة من المجمعات OXPHOS. التحديد الموازي لل IGA لCI ، والدراسات التحليلية ، والسيرة الذاتية يتطلب الحد الأدنى من 300 ميكروغرام. تحليل المناعية موازيه من CI ، والمبادرة الخاصة ، والتقدير والسيرة الذاتية يتطلب الحد الأدنى من 375 ميكروغرام.</li>
	<li>أزاله الأزرق الكاثود العازلة مع ماصه pipet-x أو فراغ ، واستبدال بواسطة 300 mL كوماسي الأزرق خاليه الكاثود العازلة ، وتشغيل هلام في 200 V بين عشيه وضحيها (16-20 ساعة) في غرفه بارده (4 درجه مئوية). انتقل إلى الخطوة 3 أو 4 لقياس النشاط في هلام أو المناعي.</li>
</ol>3. في هلام النشاط للمجمعات الأول والثاني والرابع والسيرة الذاتية
<ol><li>قبل نهاية الكهربائي ، واعداد المخازن المؤقتة في النشاط هلام وفقا للجدول 6، وتبقي في الظلام في RT. 20 مل من المخزن المؤقت في النشاط هلام كافيه لثلاثه مسارات عينه. ملاحظه: يستند هذا الفحص السيرة الذاتية في جل النشاط علي النشاط العكسي من ATPsynthase (اي ATP التحلل) ، ويستخدم الكالسيوم كعامل مساعد ، الذي يعجل في هلام. الكالسيوم اقل ضررا من الرصاص المستخدم في البروتوكولات الأخرى. وعلاوة علي ذلك ، فان استخدام هذا البروتوكول لا يتطلب التنشيط المسبق/تكييف الهلام23.</li>
	<li>وقف الكهربائي واسترداد هلام. قطع الممرات ، إذا لزم الأمر ، ونقل الممرات هلام في أكياس بلاستيكية (3 قطع الجانبين ، وكيس من البلاستيك فتحت مثل كتاب). ختم 2 من الجانبين 3 مع سداده الحرارة. ملاحظه: لمقارنه تكوين العصابات SC بين المجموعات التجريبية ، فمن المستحسن تشغيل نفس العينات في نسخ متماثلة علي نفس الهلام. قطع الممرات لاحتضان كل تكرار في مختلف المخازن المؤقتة النشاط في هلام (CI ، الثاني ، الرابع ، الخامس). لتاكيد خصوصية المقايسات ، يمكن اعداد نسخ متماثلة اضافيه لتشغيل في أنشطه هلام في وجود مثبطات سلسله الجهاز التنفسي محدده.</li>
	<li>ل 3 عينات تجريبية (اي 3 ابار) ، أضافه 20 مل من النشاط في هلام العازلة ، وأزاله فقاعات ، وختم 4 الجانب من كيس من البلاستيك. ملاحظه: أضافه مثبطات في تجارب التحكم السلبية إذا تم تنفيذها: CI: Rotenone 1 μM; [ب]: صوديوم [ملوننت] 10 [م]; CIII: انتيمايسين-A 8 μM ؛ ال0.6: KCN مم. السيرة الذاتية: اوليغميسين 0.5 μM.</li>
	<li>احتضان الممرات هلام في 37 درجه مئوية في الظلام وتحقق كل 15 دقيقه. يختلف وقت الحضانة تبعا لكميه البروتين والمجمعات. ستتفاعل الاستجابة السريعة بشكل أسرع من المعدل الأقصى أو السيرة الذاتية. عاده ما يحدث تلطيخ الأمثل بعد 2 ح ل CI ، 4 ح لل الرابع والسادس و 6 ح لل والسيرة الذاتية.</li>
	<li>شطف الممرات هلام في الماء لوقف رد الفعل ، والصورة علي خلفيه بيضاء ل CI ، أو ، العام ، أو خلفيه سوداء لCV. ملاحظه: يمكن الاحتفاظ بالهلام في أكياس بلاستيكية في RT أو 4 درجه مئوية لعده أشهر.</li>
</ol>4. المناعية التنقيط
<ol><li>اعداد المخزن المؤقت نقل وفقا للجدول 7، والحفاظ علي Rt. اعداد tbst والحفاظ علي rt.</li>
	<li>ضع الهلام بأكمله ، أو الممرات المختارة ، في حاويه وأضف المخزن المؤقت للنقل المكمل مع SDS (0.25% النهائي في المخزن المؤقت للتحويل). وضع الحاوية علي الروك واحتضان لمده 1 ساعة.</li>
	<li>قطع غشاء PVDF (حجم المقابلة لحجم هلام) وتنشيط في 20 مل من الميثانول تحت الانفعالات لمده 2 دقيقه. استبدال 20 مل العازلة نقل ومكان تحت الانفعالات لمده 2 دقيقه.</li>
	<li>اعداد ساندويتش نقل ، من أسفل إلى اعلي ، والتاكد من عدم وجود فقاعه بين هلام وتنشيط غشاء PVDF: الجانب واضحة من كاسيت/اسود الإسفنج/ورقه التنقيط/غشاء/هلام/ورقه التنقيط/اسود الإسفنج/الجانب الأسود من الكاسيت. اغلق الكاسيت واقفله.</li>
	<li>وضع ساندويتش نقل في خزان نقل ، مع جانب واضح من شطيرة تواجه الجانب الأحمر من القطب ، وصب العازلة نقل لدمج هلام. توصيل نظام التبريد إلى خزان نقل وتعيين في 4 درجه مئوية. الاتصال بإمدادات الطاقة ، وتعيين في 40 mA ، وتشغيل لمده 24 ساعة.</li>
	<li>استرداد الاغشيه ، وكتله ل 1 ح في 5 ٪ جيش الصرب البوسنيين في TBST ، واحتضان في محلول الأجسام المضادة الاوليه التي أعدت في 5 ٪ من الجيش الصربي البوسني في TBST بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية. ملاحظه: انظر الجدول 8 للأجسام المضادة المستخدمة.</li>
	<li>شطف الاغشيه في TBST 3x لمده 10 دقيقه لكل منهما.</li>
	<li>احتضان الاغشيه في حلول الأجسام المضادة الثانوية التي أعدت في 5 ٪ بوسني في TBST لمده 2 ح في درجه حرارة الغرفة.</li>
	<li>شطف الاغشيه في TBST 3x لمده 10 دقيقه لكل منهما.</li>
	<li>أضافه محلول كيميائي لاغشيه وصوره.</li>
</ol>5-التحليل
<ol><li>يمكن استخدام صور فحص النشاط في الجل أو المناعة لتحليل SCs. لتحليل تكوين العصابات ، محاذاة النسخ المتماثلة والتحقق من المعقدة التي رد فعل إيجابيا لكل فرقه معينه.</li>
	<li>لتحليل توزيع المجمعات ، في مختلف الجمعيات الجزيئية ، والصور المفتوحة في ImageJ واستخدام أداه تحليل هلام (انظر الشكل 5 علي سبيل المثال).<ol>
<li>حدد الممرات باستخدام أداه المستطيل وممرات الرسم.</li>
		<li>رسم خطوط لإغلاق المنطقة تحت منحني كل العصابات من الاهتمام وانقر علي كل منطقه مع أداه عصا لتوليد جدول يحتوي علي المنطقة تحت قيم المنحني.</li>
		<li>لحساب توزيع المجمع ، ابلغ عن القيم الخاصة بكل نطاق بالنسبة للنطاق.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+Chain+Supercomplexes.">Respiratory Chain Supercomplexes.</a> IUBMB Life. 52 (3-5), 119-128 (2001).</li><li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes.">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li><li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Respiratory+Chain+Supercomplex+Formation+in+Response+to+Exercise+in+Human+Skeletal+Muscle.">Enhanced Respiratory Chain Supercomplex Formation in Response to Exercise in Human Skeletal Muscle.</a> Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).</li><li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ratio+of+oxidative+phosphorylation+complexes+I-V+in+bovine+heart+mitochondria+and+the+composition+of+respiratory+chain+supercomplexes.">The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (41), 37861-37867 (2001).</li><li>Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Enigma+of+the+Respiratory+Chain+Supercomplex.">The Enigma of the Respiratory Chain Supercomplex.</a> Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).</li><li>Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+the+respiratory+supercomplexes:+the+plasticity+model.">The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).</li><li>Vartak, R., Porras, C. A., Bai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+supercomplexes:+structure,+function+and+assembly.">Respiratory supercomplexes: structure, function and assembly.</a> Protein Cell. 4 (8), 582-590 (2013).</li><li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplex+Assembly+Determines+Electron+Flux+in+the+Mitochondrial+Electron+Transport+Chain.">Supercomplex Assembly Determines Electron Flux in the Mitochondrial Electron Transport Chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li><li>Lazarou, M., Smith, S. M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T., McKenzie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+nuclear+DNA-encoded+subunits+into+mitochondrial+complex+IV,+and+their+preferential+integration+into+supercomplex+forms+in+patient+mitochondria.">Assembly of nuclear DNA-encoded subunits into mitochondrial complex IV, and their preferential integration into supercomplex forms in patient mitochondria.</a> The FEBS Journal. 276 (22), 6701-6713 (2009).</li><li>Sun, D., Li, B., Qiu, R., Fang, H., Lyu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Type-Specific+Modulation+of+Respiratory+Chain+Supercomplex+Organization.">Cell Type-Specific Modulation of Respiratory Chain Supercomplex Organization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (6), (2016).</li><li>D'Aurelio, M., Gajewski, C. D., Lenaz, G., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+chain+supercomplexes+set+the+threshold+for+respiration+defects+in+human+mtDNA+mutant+cybrids.">Respiratory chain supercomplexes set the threshold for respiration defects in human mtDNA mutant cybrids.</a> Human Molecular Genetics. 15 (13), 2157-2169 (2006).</li><li>Antoun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+and+supercomplex+assembly+in+rectus+abdominis+muscle+of+diabetic+obese+individuals.">Impaired mitochondrial oxidative phosphorylation and supercomplex assembly in rectus abdominis muscle of diabetic obese individuals.</a> Diabetologia. 58 (12), 2861-2866 (2015).</li><li>Kanaan, G. N., Patten, D. A., Redpath, C. J., Harper, M. -. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrial+Fibrillation+Is+Associated+With+Impaired+Atrial+Mitochondrial+Energetics+and+Supercomplex+Formation+in+Adults+With+Type+2+Diabetes.">Atrial Fibrillation Is Associated With Impaired Atrial Mitochondrial Energetics and Supercomplex Formation in Adults With Type 2 Diabetes.</a> Canadian Journal of Diabetes. , (2018).</li><li>Kuter, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+within+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+supercomplexes+and+membrane+viscosity+during+degeneration+of+dopaminergic+neurons+in+an+animal+model+of+early+Parkinson's+disease.">Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).</li><li>McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Respiratory+Chain+Supercomplexes+Are+Destabilized+in+Barth+Syndrome+Patients.">Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Are Destabilized in Barth Syndrome Patients.</a> Journal of Molecular Biology. 361 (3), 462-469 (2006).</li><li>Rosca, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+mitochondria+in+heart+failure:+decrease+in+respirasomes+and+oxidative+phosphorylation.">Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation.</a> Cardiovascular Research. 80 (1), 30-39 (2008).</li><li>Jang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+Mitochondrial+Electron+Transport+Chain+Supercomplexes+in+the+Heart+During+Ischemia-Reperfusion.">Elucidating Mitochondrial Electron Transport Chain Supercomplexes in the Heart During Ischemia-Reperfusion.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 27 (1), 57-69 (2017).</li><li>Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ageing+alters+the+supramolecular+architecture+of+OxPhos+complexes+in+rat+brain+cortex.">Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex.</a> Experimental Gerontology. 45 (7), 563-572 (2010).</li><li>Krause, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions+in+organellar+and+prokaryotic+proteomes+by+native+gel+electrophoresis:+(Membrane)+protein+complexes+and+supercomplexes.">Detection and analysis of protein-protein interactions in organellar and prokaryotic proteomes by native gel electrophoresis: (Membrane) protein complexes and supercomplexes.</a> Electrophoresis. 27 (13), 2759-2781 (2006).</li><li>Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Resolution+Clear+Native+Electrophoresis+for+In-gel+Functional+Assays+and+Fluorescence+Studies+of+Membrane+Protein+Complexes.">High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes.</a> Molecular Cell Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).</li><li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+PAGE.">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li><li>Jang, S., Javadov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Challenges+in+Elucidating+Respiratory+Supercomplexes+in+Mitochondria:+Methodological+Obstacles.">Current Challenges in Elucidating Respiratory Supercomplexes in Mitochondria: Methodological Obstacles.</a> Frontiers in Physiology. 9, 238-238 (2018).</li><li>Cuillerier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+hepatic+LRPPRC+alters+mitochondrial+bioenergetics,+regulation+of+permeability+transition+and+trans-membrane+ROS+diffusion.">Loss of hepatic LRPPRC alters mitochondrial bioenergetics, regulation of permeability transition and trans-membrane ROS diffusion.</a> Human Molecular Genetics. 26 (16), 3186-3201 (2017).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. 80, 3-44 (2007).</li><li>Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria-associated+membranes+and+mitochondria+from+animal+tissues+and+cells.">Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells.</a> Nature Protocols. 4, 1582 (2009).</li><li>Wittig, I., Sch&#228;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+limitations+of+clear-native+PAGE.">Advantages and limitations of clear-native PAGE.</a> PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).</li><li>Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Mitochondrial+Respiratory+Chain+Supercomplexes+Using+Blue+Native+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis+(BN-PAGE).">Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE).</a> Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).</li><li>Beutner, G., Porter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Supercomplexes+of+the+Mitochondrial+Electron+Transport+Chain+with+Native+Electrophoresis,+In-gel+Assays,+and+Electroelution.">Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55738 (2017).</li><li>Von Hagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proteomics Sample Preperation. , 485 (2008).</li><li>Couoh-Cardel, S. J., Uribe-Carvajal, S., Wilkens, S., Garc&#237;a-Trejo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+dimeric+F1F0-ATP+synthase.">Structure of dimeric F1F0-ATP synthase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36447-36455 (2010).</li><li>Strauss, M., Hofhaus, G., Schr&#246;der, R. R., K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimer+ribbons+of+ATP+synthase+shape+the+inner+mitochondrial+membrane.">Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane.</a> The EMBO Journal. 27 (7), 1154-1160 (2008).</li><li>Sch&#228;gger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria.">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> The EMBO Journal. 19 (8), 1777-1783 (2000).</li><li>Wittig, I., Sch&#228;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organization+of+mitochondrial+ATP+synthase.">Structural organization of mitochondrial ATP synthase.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1777 (7), 592-598 (2008).</li><li>Giorgio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimers+of+mitochondrial+ATP+synthase+form+the+permeability+transition+pore.">Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Stated of America. 110 (15), 5887 (2013).</li></ol>

ويجري بنشاط دراسة المجمعات المتقدريه لتوضيح دورها الفسيولوجية, وأهميتها في التسبب في الامراض البشرية العديدة, ما إذا كانت المكتسبة أو امراض الميتوكوندريا الوراثية3,7 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14-ومن أجل الحصول علي نتائج موثوق بها ، يلزم النظر في عده جوانب. وقد تم اختبار هذا البروتوكول مع الميتوكوندريا الكبد الماوس, الماوس الميتوكوندريا الهيكل العظمي العضلات (النتائج لم تظهر), الميتوكوندريا القلب الفئران, والإنسان الميتوكوندريا الليفية (النتائج لم تظهر), ولكن يمكن بالتاكيد ان تتكيف مع مصادر أخرى معزولة الميتوكوندريا. وتجمع الطريقة المثلي بين مختلف جوانب بروتوكولات المليارات والصفحات التي تسمح بتقليل التعرض لمنظفات ومركبات الانيوني إلى الحد الأدنى مقارنه بالبروتوكولات المنشورة20و27و28.
اعداد العينات
يمثل اعداد العينات خطوه حاسمه للفصل الناجح بين المجموعات المنبوذة. وينبغي اختيار تكوين العازلة بعناية من أجل تحقيق الاذابه السليمة من البروتينات والبروتينات الجمعيات ، مع الحفاظ علي قدر الإمكان وظيفية والسلامة الهيكلية. القوه الايونيه ودرجه الحموضة في المخزن المؤقت للاستخراج هما عاملان هامان يجب مراعاتهما. تركيزات الملح التي هي منخفضه جدا (< 50 mM K-خلات أو كلوريد الصوديوم) سوف يؤدي إلى الذوبان الفقراء من البروتينات في وجود المنظفات غير الايونيه ، في حين ان تركيزات الملح فوق 500 mM سوف تعزز البروتين التراص/التجميع ، وهطول الامطار من CB البروتينات29. ولذلك يجب استخراج SCs باستخدام المخازن المؤقتة بالقرب من قوه الايونيه الفسيولوجية. وفيما يتعلق بدرجه الحموضة ، يوصي باستخدام درجه الحموضة الفسيولوجية القريبة.
نوع المنظفات والمنظفات/نسبه البروتين هي أيضا حاسمه لاستخراج SC الأمثل. للحفاظ علي القصوى من SCs الاصليه ، ويفضل ديجيتونين26. كما هو مبين في هذا البروتوكول وغيرها من الأساليب المنشورة23,30,31,32, هذا المنظفات معتدل يحافظ علي التركيب الجزيئي للجمعيات SC متعددة, وديميريك هيكل اوليغروماريك من ATPsynthase (الشكل 3 والشكل 4). المعايرة من العينات من الفائدة مع كميات مختلفه من ديجيتونين أمر بالغ الاهميه من أجل تحديد الظروف التي تسمح الذوبان الأمثل ، مع الحفاظ علي نشاط الانزيم وتفاعلات البروتين الفسيولوجية. وينبغي ان يتم المعايرة مع نسب تتراوح بين 2 و 8 ز/ز26. النتائج المثلي للكبد, الهيكل العظمي العضلات والقلب الميتوكوندريا يتم الحصول علي التوالي مع 4, 5, 6 ز ديجيتونين/ز البروتين. هو سوفت كنت لاحظت ان ديجيتونين يستطيع كنت استبدلت ب [تريتون] [اكس-100], اي تحت شروط مثاليه نتيجات في مماثله هجره و [سك] تركيب بما ان ان يلاحظ مع ديجيتونين2. ومع ذلك, وينبغي استخدام هذا المنظفات بحذر, منذ زيادة صغيره نسبيا في نسبه المنظفات/البروتين (علي سبيل المثال, من 1 إلى 1.5 ز/ز) يمكن ان يؤدي إلى تفكك كامل من الجمعيات SCs2, التي يمكن ان تؤدي إلى عدم تناسق التجريبية. بعد الاستخراج ، وتستكمل العينات تقليديا مع كوماسي Blue لإعطاء البروتينات تهمه عند تطبيقها علي هلام ، باستثناء التقليدية CN-صفحه20،26. من أجل تقليل التعرض للبروتين إلى الأزرق كوماسي والتفكك المحتمل للبروتينات عطوب ، لا تستكمل عينات مع الأزرق كوماسي في هذا البروتوكول.
كهربائي
وقد استخدمت كل من CN-الصفحة و BN-PAGE لدراسة مجمعات OXPHOS الميتوكوندريا ، كل واحد منهم وجود مزايا متميزة والقيود. الشروط الأكثر اعتدالا المستخدمة تحت CN-الصفحة (أساسا غياب CB ، الذي له تاثير المنظفات مثل) ، يسمح الحفاظ علي أفضل من ATP synthase في النشاط هلام ، ويحد من تفكك البروتينات عطوب في SCs الوزن الجزيئي عاليه و synthase ATP الجمعيات26. ومع ذلك ، فان عدم وجود صبغه انيوني في استخراج البروتين والمخازن المؤقتة الكهربائي يسبب البروتينات للهجرة علي أساس التهمه المتاصله ونقطه ايزوكهربائيه ، مما يقلل من التنقل الكهربي للبروتينات داخل هلام26. وعلاوة علي ذلك ، في غياب CB ، البروتينات مع تهمه سلبيه غير كافيه تميل إلى التجميع ، التالي الحد من القرار من مجمعات البروتين في هلام20،26. للالتفاف علي هذه القيود ، تم تطوير ما يسمي عاليه الدقة CN-صفحه من قبل Wittig و Schragger20. في هذا البروتوكول ، يتم أضافه وديوكسيتشولاتي الصوديوم (DOC) ومختلف المنظفات غير الايونيه خفيفه (DDM ، تريتون X100) إلى المخزن المؤقت الكاثود للحفاظ علي البروتينات الغشاء solubilized وفرض تحول الشحنة السالبة علي البروتينات ، مما يؤدي إلى تحسن كبير من القرار20.
ومن السمات المميزة للبروتوكول الهجين الحالي الخاص بالنظام المختلط انه يمكن التوصل إلى قرار مماثل بدون هذه المنظفات. أضافه لحظيه من CB إلى المخزن المؤقت الكاثود في بداية الكهربائي كافيه للحد من تراكم البروتين وتعزيز التنقل في هلام (الشكل 3 والشكل 4). ونتيجة لذلك ، تمكن هذه التقنية الهجينة دقه ممتازة من الجمعيات SC متميزة ومنخفضه جدا أو عدم التعرض للمنظفات. وجود كميات منخفضه من CB يسمح أيضا أفضل الحفاظ علي نشاط السيرة الذاتية ، وتحسين الحفاظ علي ديميريك والجمعيات السيرة الذاتية اوليغموريك (الشكل 3 و Wittig و شافغر 200526) ، والحد من الضوضاء الخلفية الزرقاء التي يمكن ان تعيق التقدير الكمي لأنشطه الهلام ، ولا سيما بالنسبة لكل من الجيل الثاني والتسعون (الشكل 2). وعلاوة علي ذلك ، فان عدم وجود CB في استخراج البروتين يحد من اضطراب التفاعلات بروتين عطوب داخل SCs. علي سبيل المثال ، الرابطة المادية لل ATP synthase مع ANT لتشكيل synthasome 33 أو مع المجففة بالتجميد-D لتنظيم المنظمة فتح 34 وينظر أفضل في غياب CB. التعرض اللحظي لCB خلال الكهربائي فقط قد يكون مفيدا للكشف عن تفاعلات البروتين الجديدة داخل SCs. عموما ، هذا الهجين CN/BN-صفحه بروتوكول يسمح بالتالي للجمع بين دقيقه وسريعة في قياسات النشاط هلام مع التحليلية التقنيات التي تنطوي علي الكهربائي 2D ، المناعية الكشف و/أو بروتينيه للتحليل المتقدم لل SCs. وتجدر الاشاره إلى انه مع تزايد الاهتمام بالمجموعات المنبوذة ، فان عددا متزايدا من الدراسات يستخدم الهلام الصغير 10 × 10 سم للصفحة الاصليه. وفي حين ان هذا النهج قد يكون كافيا لتحديد التغيرات الاجماليه في تجمعات SC الوفرة ، فان القدرة المنخفضة للفصل من الهلام الصغير من المرجح ان تقتصر علي حل الترتيبات الدقيقة أو قطع نطاقات مختلفه للتحليل البروتيني. وعلاوة علي ذلك ، أفادت العديد من الدراسات التي تستخدم الهلام أصغر ان التنفس يهاجر في نفس الحجم مثل dimer ATPsynthase ، مما يجعل من الصعب ان تناي بها22. ولذلك ، ينبغي تفضيل استخدام الهلام الكبير.

الميتوكوندريا إنتاج الطاقة من خلال فوسفولات الاكسده ، حيث المجمعات التنفسية الأول-الثاني-الثالث-IV أكسده ركائز ونقل الكترونات إلى الأكسجين ، وتوليد التدرج الذي يسمح فوسفولات ADP بواسطة synthase ATP (CV). في السنوات الماضية ، أظهرت الدراسات المستفيضة ان المجمعات التنفسية لا تدمج فقط بطريقه خطيه في غشاء الميتوكوندريا الداخلي ، بل يتم تنظيمها أيضا في ترتيبات المجمعات الفائقة (SCs)1،2. في الميتوكوندريا الثدييات ، توجد SCs في ستويتشيوميتريس متفاوتة: CI/CIII2/1-4 المركز المذكور (الذي يسمي التنفس ، والتي هي قادره علي nadh: O2 الاختزال في المختبر)2، ci/ciii2، و ciii2 /1-2العدد 3،4. وعلاوة علي ذلك ، توزع المجمعات التنفسية تحت نسب مختلفه بين شكلها الحر وترتيبات SCs. ولذلك ، فانه يقدر ان 85 ٪-100 ٪ من CI ، 55 ٪-65 ٪ من CIII ، و 15 ٪-25 ٪ من المركز العام للمرطبات وجدت في SCs4. ويعتقد ان هذه الهياكل الجزيئية لخفض إنتاج الروس ، استقرار أو مساعده في تجميع المجمعات الفردية ، وتنظيم النشاط سلسله الجهاز التنفسي ، ومنع تراكم البروتين في البروتين الغنية غشاء الميتوكوندريا الداخلية5 ،6،7،8. ويجري التحقيق في قدرتها علي أعاده النمذجة علي الاختلاف في الطلب علي الطاقة وأهميتها في التسبب في الامراض في عده مختبرات3،7،9،10، 11 , 12 , 13 , 14. وقد أظهرت الدراسات ان التغيرات المرضية في الجمعية SCs موجودة في مجموعه متنوعة من الاضطرابات ، بما في ذلك ، ولكن لا تقتصر علي ، عيب وراثي في التوليف cardiolipin15، فشل القلب16، نقص التروية-ضخ17، السكري12، والشيخوخة18.
وتستخدم علي نطاق واسع الكهربائية المحلية والمناعية في الدراسات SCs لحل المجمعات oxphos الترتيبات الرباعية2,19,20,21. ويمكن كذلك ان يتم الجمع بين الكهربائي الأصلي مع محدده في اختبارات النشاط هلام أو 2d-SDS الصفحة لتمكين التحديد الجزيئي الدقيق لمختلف الجمعيات SCs1,19. القدرة علي دراسة SCs يعتمد بشكل حاسم علي ظروف الاستخراج ، بما في ذلك نوع وتركيز المنظفات المستخدمة ، والقوه الايونيه ودرجه الحموضة ، وكذلك علي ظروف الهجرة الكهربائية ، والتي تشمل تكوين العازلة ، وجود CB ، هلام الحجم ، ونسبه الاكريلاميد2.
البروتوكولات والنطاق SCs القرار تختلف اختلافا كبيرا بين الأوراق ، مما يجعل المقارنة بين الدراسات صعبه والتكيف مع الأساليب الصعبة22. ولذلك ، تقترح هذه الورقة بروتوكول قوي والأمثل لاستخراج SCs من الميتوكوندريا معزولة من مصادر مختلفه مع ديجيتونين المنظفات غير الايونيه ، ولحل العصابات SCs الوزن الجزيئي عاليه. تركيز المنظفات الأمثل ، وتكوين المخزن المؤقت الاستخراج ، وعدم وجود كوماسي Blue في اعداد العينة تقليل تعطيل مجمعات البروتين. هذا البروتوكول (انظر الشكل 1 للحصول علي نظره عامه) يجمع بين CN-الصفحة و BN-الصفحة للحصول علي الأمثل الجمعيات SCs القرار علي هلام كبير ، ومتوافق مع اختبارات النشاط في هلام السماح أفضل التصور من العصابات التفاعلية ، مع استخدام المناعي لتحليل مفصل ترتيبات SCs وتكوينها.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-amino caproic acid</td>
			<td>sigma</td>
			<td>A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>sigma</td>
			<td>A3377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14730</td>
			<td>Lot number GR3174539-12, RRID AB_301438</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SDHA antibody [2E3GC12FB2AE2]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14715</td>
			<td>Lot number GR3235943-1, RRID AB_301433</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-UQCRC2 antibody [13G12AF12BB11]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14745</td>
			<td>Lot number GR304308-3, RRID AB_2213640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis N,N&#39;-Methylene-Bis-Acrylamide</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue G</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COX4 Monoclonal Antibody (1D6E1A8)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>459600</td>
			<td>Lot number TI2637158, RRID AB_2532240</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c from equine heart</td>
			<td>sigma</td>
			<td>C7752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand FH100M Multichannel Peristaltic Pumps</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13-310-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inner Glass Plates. Pkg of 2, 20 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with outer plate</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1651823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 485 Gradient Former. 40-175 ml acrylamide gradient former, includes valve stem and tubing kit, for use with Mini-PROTEAN multi-casting chamber systems</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1654120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDUFA9 Monoclonal Antibody (20C11B11B11)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>459100</td>
			<td>Lot number TD2536591, RRID AB_2532223</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrotetrazolium Blue chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outer Glass Plates. Pkg of 2, 22.3 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with inner plate</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1651824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl floride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerpack 1000</td>
			<td>Biorad</td>
			<td colspan="2">Serial Number 286BR 07171</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROTEAN II Sandwich Clamps. Pkg of 2, clamps for running gels, for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell, 1 left and 1 right</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1651902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROTEAN II xi Cell. Large format vertical electrophoresis cell, 16 x 20 cm gel size, 4 gel capacity, spacers and combs</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1651811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROTEAN II xi Comb. Pkg of 1, 15-well, 1.5 mm, comb for PROTEAN II xi electrophoresis cell</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1651873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROTEAN II xi Multi-Gel Casting Chamber. Multi-gel casting chamber, 20 x 20 cm gel size, for up to ten 1.5 mm thick gels, includes sealing plate, gasket, separation sheets, acrylic blocks, PROTEAN II XL alignment cards</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1652025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROTEAN II xi Spacers. Pkg of 4, 1.5 mm, spacers for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1651849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCIENCEWARE Utility Bags (10 x 12&#34;) 4 mil, Bel-Art, Box of 100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>11215-388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick Blot Paper. Pkg of 25 sheets, 15 x 20 cm, absorbent filter paper, for use with Trans-Blot cassette</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1703956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Cell With Plate Electrodes and Super Cooling Coil. Transfer cell and cooling coil (#170-3912), includes 2 gel holder cassettes, buffer tank, lid with cables, fiber pads, 1 pack blot paper</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1703939</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hybrid clear/blue native electrophoresis for the separation and analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes

المجمعات من آلات فوسفولات الاكسده شكل البروتين الجزيئي ترتيبات المسمية المجمعات (SCs) ، والتي يعتقد ان تضفي المزايا الهيكلية والوظيفية إلى الميتوكوندريا. وقد تم تحديد المجموعات المنبوذة في العديد من الأنواع ، من الخميرة إلى الثدييات ، وعدد متزايد من الدراسات التقرير عن تعطيل تنظيمها في الامراض الوراثية والمكتسبة البشرية. ونتيجة لذلك ، فان عددا متزايدا من المختبرات مهتمة بتحليل المجموعات المنبوذة ، التي يمكن ان تكون صعبه من الناحية المنهجية. تقدم هذه المقالة بروتوكول الأمثل الذي يجمع بين مزايا الأزرق-و الصفحات الاصليه مسح أساليب لحل وتحليل SCs بطريقه فعاله من حيث الوقت. مع هذا الهجين CN/BN-صفحه الأسلوب ، يتم تعريض المنبوذين الميتوكوندريا المستخرجة مع الكميات المثلي من ديجيتونين المنظفات معتدل لفتره وجيزة إلى صبغ انييوني كوماسي الأزرق (CB) في بداية الكهربائي ، دون التعرض لغيرها من المنظفات. هذا التعرض القصير إلى CB يسمح لفصل وحل SCs بشكل فعال كما هو الشان مع أساليب BN-PAGE التقليدية ، مع تجنب التاثير السلبي لمستويات CB عاليه علي اختبارات النشاط في هلام ، والتفاعلات البروتين والبروتين عطوب داخل SCs. مع هذا البروتوكول فمن الممكن الجمع بين دقيق وسريع في قياسات النشاط هلام مع التقنيات التحليلية التي تنطوي علي 2D الكهربائي ، والكشف عن المناعة ، و/أو بروتينيه للتحليل المتقدم من SCs.

Watch this Scientific Journal Video about Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes at JoVE.com

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

هنا نقدم بروتوكولا لاستخراج وحل وتحديد المجمعات الميتوكوندريا التي تقلل من التعرض للمنظفات و كوماسي Blue. هذا البروتوكول يوفر التوازن الأمثل بين القرار, والحفاظ علي أنشطه الانزيم, مع التقليل من خطر فقدان التفاعلات بروتين البروتينية العطوب.

الهجين واضح/الأزرق الكهربائي الأصلي للفصل وتحليل المجمعات التنفسية الميتوكوندريا السلسلة الفائقة

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

التراكبات الفائقة هي جمعيات فوق مركّبة على الجهاز التنفسي تتكون من سلسلة من المركبات التنفسية في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا. ويعتقد أن تشكيل هذه supercomplexes لمنح العديد من المزايا الهيكلية والوظيفية، والتي تشمل انخفاض إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية، والاستقرار وتجميع أكثر فعالية من مجمعات سلسلة التنفس الفردية، وتنظيم نشاط سلسلة التنفس، ومنع تجميع البروتين في البيئة الغنية بالبروتين من الغشاء الداخلي. التغيرات في تجميع وتكوين supercomplexs هي ديناميكية، وتظهر على نحو متزايد أن تكمن وراء التغيرات في وظيفة الميتوكوندريا لوحظت أثناء التكيف الفسيولوجية، فضلا عن مجموعة متنوعة من الأمراض الوراثية والمكتسبة.يعرض هذا الفيديو بروتوكول PAGE الأصلي /الأزرق المختلط لحل وتحليل التراكبات بطريقة دقيقة وفعالة للوقت. والميزة الرئيسية لهذا الهجين واضحة / الأزرق الأصلي طريقة PAGE هو أنه يجمع على النحو الأمثل بين جوانب مختلفة من بروتوكولات صفحة التقليدية الزرقاء والمسحية الأصلية ، والتي تسمح للحد من التعرض للمنظفات والمركبات anionic إلى أدنى حد ممكن مقارنة بالبروتوكولات المنشورة. ويتحقق الفصل الأمثل وتحليل supercomplexs على المواد الهلامية تدرج كبير.يتضمن هذا الإجراء عدة خطوات دقيقة تتطلب مهارات يدوية وتنفيذ دقيق. يوفر الدعم المرئي للبروتوكول المكتوب نصائح هامة تسهل تنفيذ هذه التقنية. مما يدل على الإجراء هو الإسكندرية، وهو طالب دكتوراه من مختبري.للبدء، الطرد المركزي الميتوكوندريا معزولة عن الأنسجة الحيوانية في أنبوب 1.5 ملليلتر في 16، 000 مرة-G لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. تجاهل supernatant وإضافة الحجم المحسوب من الجليد الباردة استخراج العازلة التي تحتوي على digitonin إلى أنبوب لإعادة ربط بيليه الميتوكوندريا. ضع الأنابيب على دوار أنبوب صغير واحتضان لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية بسرعة دوران متوسطة.عينات من أجهزة الطرد المركزي في 20، 400 مرة-G لمدة 45 دقيقة في أربع درجات مئوية لإزالة الشظايا غير المُحلة. نقل المُندفع إلى أنبوب جديد على الجليد. إذا لم يتم إجراء الكهرباء في نفس اليوم، تخزين العينات في ناقص 80 درجة مئوية.افتح غرفة الصب. ضع 20 سنتيمترًا × 22 سنتيمترًا في اللوحة الزجاجية الخارجية في الغرفة. ضع مجموعة واحدة من الفواصل 1.5 ملليلتر باستخدام بطاقة المحاذاة لضمان جلوسها بقوة ضد جانب وزوايا الغرفة.وضع لوحة زجاجية داخلية على رأس الفواصل لتشكيل شطيرة هلام، ووضع ورقة فصل من البلاستيك على رأس لوحة زجاجية. ترتيب ثلاثة أكثر هلام ساندويتش الجمعية. إضافة المزيد من كتل الاكريليك أو لوحات الزجاج إذا لزم الأمر لتولي المساحة المتبقية في الغرفة.وضع شريط من parafilm في الأخدود قبل الجلوس طوقا بحزم في الشق طوقا. ضع لوحة السقف على الغرفة وشد جميع مسامير الستة. الوقوف على غرفة الصب.ضع التدرج السابق على لوحة ضجة مع مُحرك مغناطيسي في غرفة الخلط الخفيفة. توصيل أنابيب من غرفة الصب إلى الانحدار السابق، وتأمين الأنابيب في الكاسيت من مضخة ال peristaltic. تأكد من إغلاق stopcock من الانحدار السابق.لإلقاء أربعة هلام, إعداد 60 ملليلتر من 4٪ و 60 ملليلتر من حلول هلام 12٪ في اثنين من قارورة Erlenmeyer, ودوامة تماما لخلط. صب حل هلام 4٪ في غرفة الخلط الخفيفة، و 12٪ في غرفة الخزان الثقيلة من الانحدار السابق. تعيين سرعة اثارة لوحة اثارة في 350 دورة في الدقيقة.ثم افتح الـ stopcock وقم بتشغيل المضخة عند 35 دورة في الدقيقة. مرة واحدة في مستوى حل الكسر الضوء هو أقل من الكسر الثقيل، وقفة المضخة وفتح الجذعية صمام بين الخزانات الخفيفة والثقيلة. السماح كسور اكويرات حجم وإعادة تشغيل المضخة.تأكد من عدم إدخال أي فقاعات النظام والحصول على المحاصرين بين لوحات الزجاج. بمجرد صب جل التدرج بالكامل ، أوقف المضخة وتراكب الماء على كل شطيرة هلام لمنع تجفيف الجل. دعها تُتَمَرّر لمدة ساعتينإعداد 25 ملليلتر التراص هلام في قارورة Erlenmeyer ودوامة لخلط دقيق. عكس بدقة المونتاج لإزالة الماء، وإدراج 15-جيدا أمشاط في كل شطيرة هلام. صب هلام التراص والسماح لها البلمرة لمدة ساعتين.بعد ذلك، إدراج جل ومشابك شطيرة وإزالة مشط. مع لوحة زجاجية قصيرة تواجه لأسفل، إدراج شطيرة هلام في الأساسية التبريد. كرر على الجانب الآخر ووضع الأساسية في خزان الكهرباء.صب 300 ملليلتر من العازلة الكاثود الأزرق في الغرفة الداخلية للدبابات الكهرباء. مع ماصة ونصائح التحميل، تحميل 75 إلى 175 ميكروغرام من البروتين في البئر. في غرفة باردة في أربع درجات مئوية، قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية في إمدادات الطاقة وتحويلها إلى 150 فولت، وتشغيل هلام لمدة ساعة ونصف، أو حتى عينات دخلت كل هلام التدرج.تحميل تكرارات من العينة في آبار منفصلة لتمكين تحديد موازي للأنشطة في هلام وتحليل مناعي من مجمعات OXPHOS. إزالة العازلة الكاثود الأزرق مع ماصة. استبدال 300 ملليلتر من Coomassie الأزرق الحر الكاثود العازلة، وتشغيل هلام في 200 فولت بين عشية وضحاها في غرفة باردة.قبل نهاية الكهرباء، قم بإعداد مخازن النشاط في الجل وفقا للمخطوطة، والاحتفاظ بها في الظلام في درجة حرارة الغرفة. وقف الكهرباء واسترجاع هلام. قطع كيس من البلاستيك بحيث يمكن فتحه مثل كتاب.قطع الممرات ونقل الممرات هلام في أكياس بلاستيكية. استخدام مسيل الحرارة لختم اثنين من الجوانب الثلاثة. إذا تم إجراء تجارب التحكم السلبية، أضف مثبطات إلى مخازن الفحص.لثلاث عينات تجريبية، أضف 20 ملليلتر من عازل النشاط في هلام. إزالة فقاعات وختم الجانب الرابع من كيس من البلاستيك. احتضان الممرات هلام في 37 درجة مئوية في الظلام والتحقق من كل 15 دقيقة.وقت الحضانة يختلف تبعاً لكمية البروتين والمجمعات. بعد الحضانة، وشطف الممرات هلام في الماء لوقف رد الفعل، وصورة على خلفية بيضاء لـ I معقدة، II معقدة، IV معقدة، أو خلفية سوداء لV.for هذا المثال، تم تنفيذ نشاط IV في هلام معقدة لتصور supercomplexes معزولة عن الميتوكوندريا الكبد الماوس الطازجة. المبلغ الأمثل من digitonin لهذه العينة هو أربعة غرامات في الغرام الواحد، كما أنه يوفر دقة جيدة من الرابع مجمع أحادية اللون، وارتفاع الوزن الجزيئي supercomplexes.في نسبة أقل، العصابات ليست واضحة وحل في مسحة خلال electrophoresis، في حين أن استخدام نسبة أعلى من digitonin يؤدي إلى تعطيل supercomplexes الوزن الجزيئية العالية. تم التعامل مع الميتوكوندريا الكبد معزولة من فأر واحد مع كمية الأمثل من digitonin لاستخراج supercomplexes الجهاز التنفسي. يتم تقليل الحركة الكهربائية للمجمعات أوكسفوس قليلا عندما يتم فصل البروتينات باستخدام شروط الصفحة الأصلية الهجينة واضحة / زرقاء، مقارنة مع الصفحة الأصلية القياسية، وذلك بسبب انخفاض كمية الأزرق Coomassie.هذا التحول التنقل أكبر للمونومات الرابع المعقدة، تليها أحادية V معقدة، والخلفية I.The الزرقاء المعقدة أقل في صفحة أصلية أصلية/ زرقاء مختلطة واضحة مقارنة بصفحة أصلية زرقاء. مستويات خلفية عالية بعد الأزرق الأصلي PAGE أقنعة تماما في هلام النشاط تلطيخ لII معقدة، ويعزز الضوضاء الخلفية المرتبطة بنشاط dimers الرابع المعقدة. لهذا البروتوكول، المعايرة من العينات من الفائدة مع كميات مختلفة من digitonin أمر بالغ الأهمية من أجل تحديد الظروف التي تسمح solubilization الأمثل، مع الحفاظ على نشاط الانزيم والتفاعلات البروتين الفسيولوجية.وينبغي أن تؤدي جميع الخطوات المتعلقة صب هلام بدقة لتشكيل التدرج الأمثل لفصل العينة السليمة. وينبغي أيضا توخي الحذر الشديد للتلاعب في هذه المواد الهلامية الكبيرة والهشة. عقد دائما لهم مع عدة أصابع باستخدام نهاية نسبة عالية من هلام.مع هذا الهجين واضحة / الأزرق الأصلي طريقة PAGE، يتم فقط يتعرض عينات لفترة وجيزة إلى صبغة anionic Coomassie الأزرق في بداية الكهرباء دون التعرض لأية منظفات أخرى. وهذا يسمح لفصل وحل supercomplexes على نحو فعال كما هو الحال مع أساليب الصفحة الأصلية الزرقاء التقليدية، مع تجنب التأثير السلبي لمستويات Coomassie الزرقاء العالية على مقايسات النشاط في هلام وتفاعلات البروتين البروتينية في إطار supercomplexes. مع هذا البروتوكول، فمن الممكن بالتالي الجمع بين قياسات النشاط في هلام دقيقة وسريعة مع التقنيات التحليلية التي تنطوي على الكهربائي 2D، المناعي، و / أو تحليل البروتيوميات المشار إليها من supercomplexes.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Mitochondria and Energy Production

SCIENTISTS IN ACTION

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

الشعرية الكهربائي فصل حيدة النسيلة الأجسام المضادة الإسوية باستخدام الشعرية محايد

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

تحليل سوبيركومبلكسس من سلسلة النقل الإلكترون الميتوكوندريا مع الكهربائي الأصلي، في هلام فحوصات، والكهرباء

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

سبليت-بيويد-تحليل البروتين مجمعات البروتين محددة السياق في بيئتها الخلوية الأصلية

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

تحليل AtHIRD11 اضطرابات جوهرية وملزمة تجاه أيونات المعادن بالتفريد جل الشعرية وتقارب التفريد الشعرية

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

تحليل الغشاء ثايلاكويد البروتين المجمعات بالتفريد جل الأصلي الأزرق

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

التبادل الأيوني اللوني (المستوى) بالإضافة إلى تشتت الضوء زاوية المتعددة (مالس) لفصل البروتين وتوصيف

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

في الوقت الحقيقي ، وشبه التلقائي قياس الفلورسنت من الدرجة الهوائية السائل سطح المجري الجوي للخلايا الاساسيه الإنسان الظهاريه

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

تحليل سلسلة يوبيكيتين من خلال رصد التفاعل الموازي

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

غشاء الخلية الأصلية نظام الجسيمات النانوية لتحليل التفاعل البروتينية الغشاء

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...