Name: hybrid clear/blue native electrophoresis for the separation and analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes
Uploaded: 2019-05-19T14:00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes at JoVE.com

De auteurs willen bedanken Jenna Rossi voor technische bijstand, en Dr. Mireille Tina, Dr. David Patten en Dr. Joeri Anil Kumar voor nuttige discussie, terwijl de ontwikkeling van deze methode. Dit werk werd gefinancierd door de Canadese instituten van het onderzoek van de gezondheid (CIHR) en de nationale wetenschappen en techniek Raad van Canada (NSERC). AC is een ontvanger van Doctoral Award-Frederick Banting en Charles Best Canada Graduate beurzen (CIHR).

1. SC extractie
<ol><li>Bereid 100 mL extractiebuffer (Zie tabel 2) door EDTA in water op te lossen. Verhoog de pH met KOH tot volledig opgelost, dan pH aan te passen aan 7,5 met HCl. Voeg de resterende onderdelen aan de oplossing, compleet met het uiteindelijke volume met water, en houden op ijs. In een buis, los digitonin in extractiebuffer om een 10% voorraad oplossing te maken, Vortex grondig tot volledig opgelost, en houden op ijs. Opmerking: extractiebuffer kan vooraf worden bereid en bij 4 °C worden gehouden voor maximaal 2 maanden. Als golvende bands beginnen te verschijnen aan de onderkant van de gel, het betekent extractiebuffer is te oud. Bij de voorbereiding van de 10% digitonin oplossing, bereiden een voorraad volume tellen 500 µ L per monster bij gebruik van muis lever mitochondria. Digitonin oplosbaarheid varieert op basis van herkomst en product lot (Zie tabel van materialen).</li>
	<li>Mitochondriën geïsoleerd van dierlijk weefsel (muis hart, spier, lever; rat hart) of cellen (humaan fibroblast) met behulp van standaardprotocollen23,24,25 kunnen worden gebruikt voor de extractie van SCs. Zodra mitochondria worden verkregen, kwantificeren eiwitgehalte met behulp van de bicinchoninic acid assay kit volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Supplement geïsoleerde mitochondriën met proteasen en fosfatasen remmers bij deze stap als nodig is. Opmerking: SCs kan worden geëxtraheerd op zowel verse of ontdooide mitochondriën. Het wordt aanbevolen om SCs uit alle monsters op hetzelfde moment, om te verzekeren dat ze worden behandeld met dezelfde partijen van oplossingen en onder dezelfde voorwaarden.</li>
	<li>Op basis van de mitochondriale eiwitconcentratie verkregen, en de uiteindelijke digitonin/eiwit ratio gewenst, bereken het volume van de voorraad digitonin oplossing en extractiebuffer vereist volgens tabel 1. Voor SC extractie, voeg 1 µ L van extractiebuffer (tabel 2) met digitonin voor elke 10 µ g van mitochondriale eiwit. De digitonin/eiwit verhouding kan variëren van 2 tot 8 g/g. Een digitonin titratie moet altijd worden uitgevoerd voor elk nieuw type monster dat wordt gebruikt (Zie Figuur 2 voor een voorbeeld).</li>
	<li>Pellet mitochondriën, in een 1,5 mL buis door centrifugeren bij 16.000 x g voor 10 min bij 4 °c.</li>
	<li>Gooi bovendrijvende en re-Suspend de mitochondriale pellet in het berekende volume van ijskoude extractiebuffer met digitonin. Plaats buizen op een mini buis Rotator en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C bij een gemiddelde rotatiesnelheid. Zorg ervoor dat de monsters worden steeds goed gemengd.</li>
	<li>Centrifugeer monsters bij 20.400 x g voor 45 min bij 4 °c om insolubilized fragmenten te verwijderen.</li>
	<li>Overdracht bovendrijvende in een nieuwe buis op ijs en kwantificeren eiwitten. Deze fractie staat voor het extract van de Ademhalings supercomplexen. Als de elektroforese niet op de zelfde dag wordt uitgevoerd, bewaar steekproeven bij-80 °C. Opmerking: 1) Vermijd Freeze/ontdooicycli van het extract, omdat dit verstoort hogere moleculaire regelingen van SCs. monster vóór de eerste vorst/ontdooicyclus indien nodig. 2) voor het uitvoeren van een standaard BN-pagina experiment, CB moet worden toegevoegd aan de SCs uittreksel bij deze stap. CB moet worden toegevoegd in een 1g/8g verhouding ten opzichte van de hoeveelheid wasmiddel gebruikt.</li>
</ol>2. Gradient gel gieten en elektroforese
<ol><li>Bereid 3x gradiënt buffer en acrylamide voorraden voor het maken van de gradiënt gel, hoeveelheid, en op te slaan bij-20 ° c (Zie tabel 3).</li>
	<li>Bereid anode-en kathode buffers voor en houd deze bij 4 °C (Zie tabel 5).</li>
	<li>Open de giet kamer en plaats een buitenste glazen plaat (20 cm x 22 cm) in de kamer. Plaats een set van afstandhouders (1,5 mm) met behulp van de uitlijning kaart om ervoor te zorgen dat ze stevig zitten tegen de zijkant en hoeken van de kamer. Plaats een binnenste glazen plaat (20 cm x 20 cm) op de top van de afstandhouders (dit vormt de gel sandwich), en zet een plastic scheidings blad op de top van de glazen plaat.</li>
	<li>Herhaal stap 2,3 tot het gewenste aantal gels te werpen is bereikt. Voor dit protocol worden 4 gels gegoten. De casting kamersysteem dat we gebruiken (Zie tabel van materialen) kan het gieten van een maximum van 10 gels per keer. Take-up van de resterende ruimte in de kamer door eerst toe te voegen zo veel acryl blokken als nodig is, en vervolgens glazen platen indien nodig. Opmerking: de montage moet strak worden afgedicht; Er mag geen ruimte tussen de gel sandwiches in de kamer.</li>
	<li>Plaats een strook van Parafilm in de groef alvorens de pakking stevig in de pakking inkeping te plaatsen. Plaats de afsluitplaat op de kamer en draai alle 6 schroeven vast. Tribune de gietende kamer.</li>
	<li>Plaats gradiënt voormalige op een roer plaat met een magneetroerder in de "lichte" mengkamer. Sluit de slang van de casting kamer aan de gradiënt voormalige, veilig de slang in de cassette van de peristaltische pomp, en zorg ervoor dat de wegkraan van de gradiënt voormalige is gesloten.</li>
	<li>Voor het gieten van 4 gels, bereid 60 mL van 4% en 60 mL van 12% gel-oplossingen (Zie tabel 4) in een erlenmeyer kolf en wervelen grondig te mengen. Giet 60 mL van 4% gel oplossing in de "lichte" mengkamer, en 60 mL van 12% in de "zware" reservoir kamer van de gradiënt voormalige. Stel de roer snelheid van de roer plaat op 350 rpm. Open de wegkraan en zet de pomp op 35 rpm.</li>
	<li>Zodra de lichte fractie lager is dan de zware Fractie, pauzeren de pomp en open de klepstam tussen "licht" en "zware" reservoirs, laat fracties volume equilibrate, en herstart de pomp. Opmerking: het is belangrijk dat er geen bubbels het systeem in te voeren en vast komen te zitten tussen glasplaten. Als dit gebeurt, ongedaan maken montage, wassen, en opnieuw.</li>
	<li>Zodra de gradiënt gel is volledig gegoten, stop de pomp, en overlay water (ongeveer 1 mL) op elke gel sandwich om het drogen van de gel te voorkomen. Laat polymeriseren voor 2 uur.</li>
	<li>Bereid 25 mL stapelen gel in Erlenmeyer en Swirl om grondig te mengen. Verwijder water en plaats 15 goed kammen in elke gel sandwich. Giet stapelen gel en laat polymeriseren voor 2 uur. Let op: gels kunnen worden gegoten en bewaard bij 4 ° c voor 1 week.</li>
	<li>Steek de gel in de sandwich klemmen en verwijder de kam. Met de korte glazen plaat naar beneden, plaatst u de gel sandwich in de koeling kern. Herhaal aan de andere kant, en plaats kern in de elektroforese tank.</li>
	<li>Giet 300 mL blauwe kathode buffer binnen kamer van de elektroforese tank. Giet 2 L van de anode buffer in de buitenste kamer van de elektroforese tank. Opmerking: de elektrode moet worden ondergedompeld in kathode buffer, die ongeveer 300 mL vereist.</li>
	<li>Lading tussen 75 μg en 175 μg van proteïne per put. Run gel op 150 V voor 1,5 h (of totdat de monsters zijn allemaal opgenomen de gradiënt gel) in koude kamer (4 ° c). Opmerking 1:1) een minimum van 75 μg per well is vereist voor een goede resolutie van de in-gel activiteit bands. Het laden van meer dan 175 μg eiwit zal leiden tot een verlies van duidelijke banden als gevolg van overmatige enzymactiviteit. 2) replica van het monster moet worden geladen in afzonderlijke putten om parallelle bepaling van de in-gel activiteiten en immunoblot analyse van OXPHOS complexen mogelijk te maken. Parallelle bepaling van IGA voor CI, CII, CIV en CV vereist een minimum van 300 µ g. parallelle immunoblot analyse van CI, CII, CII, CIV en CV vereist een minimum van 375 µ g.</li>
	<li>Verwijder blauwe kathode buffer met pipet of vacuüm, vervang door 300 mL Coomassie blauw-vrije kathode buffer, en run gel op 200 V 's nachts (16-20 h) in koude kamer (4 ° c). Ga verder met stap 3 of 4 voor in-gel activiteit meting of immunoblotting.</li>
</ol>3. in-gel activiteit voor complexen I, II, IV en CV
<ol><li>Vóór het eind van elektroforese, bereid in-gel activiteit buffers volgens lijst 6voor, en houd in Dark bij RT. 20 ml van de in-gel activiteit buffer is voldoende voor 3 monster Lanes. Opmerking: deze CV in-gel activiteit assay is gebaseerd op de omgekeerde activiteit van ATPsynthase (dat wil zeggen, ATP hydrolyse), en maakt gebruik van calcium als een co-factor, die precipitaten in de gel. Calcium is minder schadelijk dan het lood dat in andere protocollen wordt gebruikt. Bovendien is het gebruik van dit protocol niet vereist een pre-activatie/conditionering van de gel23.</li>
	<li>Stop elektroforese en herstellen gel. Snij rijstroken, indien nodig, en de overdracht gel rijstroken in plastic zakken (3 zijden knippen, en plastic zak geopend als een boek). Seal 2 van de 3 zijden met een Heat sealer. Opmerking: om de samenstelling van SC-banden tussen experimentele groepen te vergelijken, is het raadzaam om dezelfde samples uit te voeren in replica's op dezelfde gel. Snijd rijstroken te bebroeden elke repliceren in verschillende in-gel activiteit buffers (CI, II, IV, V). Om de specificiteit van de analyses te bevestigen, kunnen extra replicaties worden bereid om in gel-activiteiten in aanwezigheid van specifieke ademhalingsketen inhibitors te lopen.</li>
	<li>Voor 3 experimentele monsters (dwz 3 Wells), Voeg 20 mL van de in-gel activiteit buffer, verwijder bubbels, en Seal 4th kant van plastic zak. Nota: Voeg inhibitors in negatieve controle experimenten toe indien uitgevoerd: CI: rotenon 1 µ M; CII: natrium malonaat 10 mM; CIII: Antimycin-A 8 µ M; CIV: KCN 0,6 mM; CV: Oligomycin 0,5 µ M.</li>
	<li>Incubeer gel rijstroken bij 37 °C in het donker en controleer elke 15 min. incubatietijd varieert afhankelijk van de hoeveelheid eiwitten en complexen. CI reageert sneller dan CIV of CV. optimale kleuring treedt meestal op na 2 uur voor CI, 4 h voor CIV en 6 u voor CII en CV.</li>
	<li>Spoel gel rijstroken in het water om de reactie te stoppen, en het beeld op een witte achtergrond voor CI, CII, CIV, of zwarte achtergrond voor CV. Let op: gels kunnen gedurende enkele maanden in plastic zakken bij RT of 4 °C bewaard worden.</li>
</ol>4. immunoblotting
<ol><li>Bereid Transfer buffer volgens tabel 7, en houden op rt. bereid TBST en houden bij RT.</li>
	<li>Plaats de hele gel, of geselecteerde rijstroken, in een container en voeg de overdracht buffer aangevuld met SDS (0,25% Final in Transfer buffer). Plaats de container op rocker en incubeer voor 1 uur.</li>
	<li>Snij PVDF membraan (grootte die overeenkomt met de grootte van de gel) en activeer in 20 mL methanol onder agitatie gedurende 2 minuten. Vervang door 20 mL overdrachts buffer en plaats onder agitatie gedurende 2 minuten.</li>
	<li>Bereid Transfer sandwich, van onder naar boven, zorg ervoor dat er geen zeepbel tussen gel en geactiveerd PVDF membraan: duidelijke kant van de cassette/zwarte spons/bevloeien papier/membraan/gel/Vloeipapier/zwarte spons/zwarte kant van de cassette. Sluit en vergrendel de cassette.</li>
	<li>Plaats Transfer sandwich in Transfer tank, met duidelijke kant van de sandwich geconfronteerd met de rode kant van de elektrode, en giet de overdracht buffer om de gel te imfusen. Sluit het koelsysteem aan op de transport tank en stel deze in op 4 °C. Verbind met de machtslevering, die bij 40 mA wordt geplaatst, en looppas voor 24 h.</li>
	<li>Ophalen membranen, blok voor 1 h in 5% BSA in TBST, en incubeer in primaire antilichaam oplossing bereid in 5% BSA in TBST overnachting bij 4 ° c. Opmerking: Zie tabel 8 voor gebruikte antilichamen.</li>
	<li>Spoel membranen in TBST 3x voor 10 min elk.</li>
	<li>Incubeer membranen in secundaire antilichaam oplossingen bereid in 5% BSA in TBST voor 2 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Spoel membranen in TBST 3x voor 10 min elk.</li>
	<li>Voeg chemiluminescentie oplossing voor membranen en beeld.</li>
</ol>5. analyse
<ol><li>In-gel activiteit assay beelden of immunoblots kan worden gebruikt om SCs te analyseren. Voor het analyseren van de samenstelling van bands, align repliceert en valideren welke complex positief reageerde voor elke bepaalde band.</li>
	<li>Voor het analyseren van de verdeling van complexen, in verschillende supramoleculaire assemblages, open afbeeldingen in ImageJ en gebruik de gel analyse tool (Zie Figuur 5 voor een voorbeeld).<ol>
<li>Selecteer rijstroken met de rechthoek gereedschap, en plot rijstroken.</li>
		<li>Teken lijnen om het gebied onder de kromme van elke banden van belang te sluiten en op elk gebied met het toverstokje te klikken om een lijst te produceren die het gebied onder de kromme waarden bevat.</li>
		<li>Voor de berekening van de verdeling van het complex, het verslag van de waarden voor elke band ten opzichte van die van het monomeer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+Chain+Supercomplexes.">Respiratory Chain Supercomplexes.</a> IUBMB Life. 52 (3-5), 119-128 (2001).</li><li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes.">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li><li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Respiratory+Chain+Supercomplex+Formation+in+Response+to+Exercise+in+Human+Skeletal+Muscle.">Enhanced Respiratory Chain Supercomplex Formation in Response to Exercise in Human Skeletal Muscle.</a> Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).</li><li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ratio+of+oxidative+phosphorylation+complexes+I-V+in+bovine+heart+mitochondria+and+the+composition+of+respiratory+chain+supercomplexes.">The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (41), 37861-37867 (2001).</li><li>Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Enigma+of+the+Respiratory+Chain+Supercomplex.">The Enigma of the Respiratory Chain Supercomplex.</a> Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).</li><li>Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+the+respiratory+supercomplexes:+the+plasticity+model.">The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).</li><li>Vartak, R., Porras, C. A., Bai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+supercomplexes:+structure,+function+and+assembly.">Respiratory supercomplexes: structure, function and assembly.</a> Protein Cell. 4 (8), 582-590 (2013).</li><li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplex+Assembly+Determines+Electron+Flux+in+the+Mitochondrial+Electron+Transport+Chain.">Supercomplex Assembly Determines Electron Flux in the Mitochondrial Electron Transport Chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li><li>Lazarou, M., Smith, S. M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T., McKenzie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+nuclear+DNA-encoded+subunits+into+mitochondrial+complex+IV,+and+their+preferential+integration+into+supercomplex+forms+in+patient+mitochondria.">Assembly of nuclear DNA-encoded subunits into mitochondrial complex IV, and their preferential integration into supercomplex forms in patient mitochondria.</a> The FEBS Journal. 276 (22), 6701-6713 (2009).</li><li>Sun, D., Li, B., Qiu, R., Fang, H., Lyu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Type-Specific+Modulation+of+Respiratory+Chain+Supercomplex+Organization.">Cell Type-Specific Modulation of Respiratory Chain Supercomplex Organization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (6), (2016).</li><li>D'Aurelio, M., Gajewski, C. D., Lenaz, G., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+chain+supercomplexes+set+the+threshold+for+respiration+defects+in+human+mtDNA+mutant+cybrids.">Respiratory chain supercomplexes set the threshold for respiration defects in human mtDNA mutant cybrids.</a> Human Molecular Genetics. 15 (13), 2157-2169 (2006).</li><li>Antoun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+and+supercomplex+assembly+in+rectus+abdominis+muscle+of+diabetic+obese+individuals.">Impaired mitochondrial oxidative phosphorylation and supercomplex assembly in rectus abdominis muscle of diabetic obese individuals.</a> Diabetologia. 58 (12), 2861-2866 (2015).</li><li>Kanaan, G. N., Patten, D. A., Redpath, C. J., Harper, M. -. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrial+Fibrillation+Is+Associated+With+Impaired+Atrial+Mitochondrial+Energetics+and+Supercomplex+Formation+in+Adults+With+Type+2+Diabetes.">Atrial Fibrillation Is Associated With Impaired Atrial Mitochondrial Energetics and Supercomplex Formation in Adults With Type 2 Diabetes.</a> Canadian Journal of Diabetes. , (2018).</li><li>Kuter, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+within+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+supercomplexes+and+membrane+viscosity+during+degeneration+of+dopaminergic+neurons+in+an+animal+model+of+early+Parkinson's+disease.">Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).</li><li>McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Respiratory+Chain+Supercomplexes+Are+Destabilized+in+Barth+Syndrome+Patients.">Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Are Destabilized in Barth Syndrome Patients.</a> Journal of Molecular Biology. 361 (3), 462-469 (2006).</li><li>Rosca, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+mitochondria+in+heart+failure:+decrease+in+respirasomes+and+oxidative+phosphorylation.">Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation.</a> Cardiovascular Research. 80 (1), 30-39 (2008).</li><li>Jang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+Mitochondrial+Electron+Transport+Chain+Supercomplexes+in+the+Heart+During+Ischemia-Reperfusion.">Elucidating Mitochondrial Electron Transport Chain Supercomplexes in the Heart During Ischemia-Reperfusion.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 27 (1), 57-69 (2017).</li><li>Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ageing+alters+the+supramolecular+architecture+of+OxPhos+complexes+in+rat+brain+cortex.">Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex.</a> Experimental Gerontology. 45 (7), 563-572 (2010).</li><li>Krause, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions+in+organellar+and+prokaryotic+proteomes+by+native+gel+electrophoresis:+(Membrane)+protein+complexes+and+supercomplexes.">Detection and analysis of protein-protein interactions in organellar and prokaryotic proteomes by native gel electrophoresis: (Membrane) protein complexes and supercomplexes.</a> Electrophoresis. 27 (13), 2759-2781 (2006).</li><li>Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Resolution+Clear+Native+Electrophoresis+for+In-gel+Functional+Assays+and+Fluorescence+Studies+of+Membrane+Protein+Complexes.">High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes.</a> Molecular Cell Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).</li><li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+PAGE.">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li><li>Jang, S., Javadov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Challenges+in+Elucidating+Respiratory+Supercomplexes+in+Mitochondria:+Methodological+Obstacles.">Current Challenges in Elucidating Respiratory Supercomplexes in Mitochondria: Methodological Obstacles.</a> Frontiers in Physiology. 9, 238-238 (2018).</li><li>Cuillerier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+hepatic+LRPPRC+alters+mitochondrial+bioenergetics,+regulation+of+permeability+transition+and+trans-membrane+ROS+diffusion.">Loss of hepatic LRPPRC alters mitochondrial bioenergetics, regulation of permeability transition and trans-membrane ROS diffusion.</a> Human Molecular Genetics. 26 (16), 3186-3201 (2017).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. 80, 3-44 (2007).</li><li>Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria-associated+membranes+and+mitochondria+from+animal+tissues+and+cells.">Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells.</a> Nature Protocols. 4, 1582 (2009).</li><li>Wittig, I., Sch&#228;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+limitations+of+clear-native+PAGE.">Advantages and limitations of clear-native PAGE.</a> PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).</li><li>Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Mitochondrial+Respiratory+Chain+Supercomplexes+Using+Blue+Native+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis+(BN-PAGE).">Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE).</a> Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).</li><li>Beutner, G., Porter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Supercomplexes+of+the+Mitochondrial+Electron+Transport+Chain+with+Native+Electrophoresis,+In-gel+Assays,+and+Electroelution.">Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55738 (2017).</li><li>Von Hagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proteomics Sample Preperation. , 485 (2008).</li><li>Couoh-Cardel, S. J., Uribe-Carvajal, S., Wilkens, S., Garc&#237;a-Trejo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+dimeric+F1F0-ATP+synthase.">Structure of dimeric F1F0-ATP synthase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36447-36455 (2010).</li><li>Strauss, M., Hofhaus, G., Schr&#246;der, R. R., K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimer+ribbons+of+ATP+synthase+shape+the+inner+mitochondrial+membrane.">Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane.</a> The EMBO Journal. 27 (7), 1154-1160 (2008).</li><li>Sch&#228;gger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria.">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> The EMBO Journal. 19 (8), 1777-1783 (2000).</li><li>Wittig, I., Sch&#228;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organization+of+mitochondrial+ATP+synthase.">Structural organization of mitochondrial ATP synthase.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1777 (7), 592-598 (2008).</li><li>Giorgio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimers+of+mitochondrial+ATP+synthase+form+the+permeability+transition+pore.">Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Stated of America. 110 (15), 5887 (2013).</li></ol>

Mitochondriale supercomplexen worden actief bestudeerd om hun fysiologische rol te verhelderen, en hun belang in de pathogenese van tal van menselijke ziekten, of ze zijn verworven of genetische mitochondriale ziekten3,7 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. om betrouwbare resultaten te behalen, moeten verschillende aspecten in overweging worden genomen. Dit protocol is getest met muis lever mitochondriën, muis skeletspier mitochondria (resultaten niet getoond), rat Heart mitochondria, en de menselijke fibroblast mitochondriën (resultaten niet getoond), maar kan zeker worden aangepast aan andere bronnen van geïsoleerde Mitochondria. De methode combineert verschillende aspecten van bn-en CN-pagina protocollen, die het mogelijk maken de blootstelling aan detergenten en anionische verbindingen tot een minimum te beperken ten opzichte van de gepubliceerde protocollen20,27,28.
Monstervoorbereiding
Monstervoorbereiding is een cruciale stap voor een succesvolle scheiding van SCs. buffer samenstelling moet zorgvuldig worden geselecteerd om een goede oplosbaar maken van eiwitten en eiwitten samenstellingen te bereiken, met behoud van zoveel mogelijk hun functionele en structurele integriteit. Ionische sterkte en pH van de extractiebuffer zijn twee belangrijke factoren te overwegen. Zoutconcentraties die te laag zijn (< 50 mM K-acetaat of NaCl) zal resulteren in een slechte oplosbaar maken van eiwitten in aanwezigheid van niet-ionische detergenten, terwijl de zoutconcentraties boven 500 mM zal bevorderen eiwit stapelen/aggregatie, en neerslag van CB en proteïnen29. SCs moet daarom worden geëxtraheerd met behulp van buffers in de buurt van fysiologische Ionische sterkte. Met betrekking tot pH, wordt het gebruik van een dichtbijgelegen fysiologische pH geadviseerd.
Wasmiddel type en detergent/eiwit ratio zijn ook van cruciaal belang voor een optimale SC extractie. Voor het maximale behoud van native SCs, digitonin heeft de voorkeur26. Zoals blijkt uit het huidige protocol en andere gepubliceerde methoden23,30,31,32, dit milde wasmiddel behoudt de supramoleculaire samenstelling van meerdere SC assemblages, en de dimeer en Oligomere structuur van ATPsynthase (Figuur 3 en Figuur 4). De titratie van de steekproeven van belang met diverse hoeveelheden van digitonin is kritiek om de voorwaarden te identificeren die optimale oplosbaar maken, terwijl het bewaren van enzymactiviteit en fysiologische eiwitinteractie toelaten. Titratie moet worden uitgevoerd met ratio's variërend tussen 2 en 8 g/g26. Optimale resultaten voor lever, skeletspieren en cardiale mitochondriën zijn respectievelijk verkregen met 4,5, en 6 g digitonin/g eiwit. Opgemerkt moet worden dat digitonin kan worden vervangen door Triton X-100, die in optimale omstandigheden resulteert in soortgelijke migratie en SC samenstelling als die waargenomen met digitonin2. Echter, dit wasmiddel moet worden gebruikt met de nodige voorzichtigheid, omdat relatief kleine stijging van het wasmiddel/eiwit ratio (bijvoorbeeld van 1 tot 1,5 g/g) kan resulteren in een volledige dissociatie van SCs assemblies2, wat kan resulteren in experimentele inconsistenties. Na extractie, worden de steekproeven traditioneel aangevuld met Coomassie blauw om proteïnen een last te geven wanneer toegepast op de gel, behalve traditionele CN-pagina20,26. Om eiwit blootstelling aan Coomassie blauw en potentiële scheiding van labiele proteïnen te minimaliseren, worden de steekproeven niet aangevuld met Coomassie blauw in dit protocol.
Elektroforese
Zowel CN-PAGE en BN-pagina zijn gebruikt om mitochondriale OXPHOS complexen studie, elk van hen met verschillende voordelen en beperkingen. De mildere voorwaarden die onder CN-pagina worden gebruikt (hoofdzakelijk het ontbreken van CB, die een detergens-als effect heeft), staat beter behoud van ATP synthase in-gel activiteit toe, en beperkt de scheiding van labiele proteïnen in hoog moleculair gewicht SCs en ATP synthase samenstellingen26. Nochtans, veroorzaakt de afwezigheid van de anionic kleurstof CB in het eiwit uittreksel en de elektroforese buffers de proteïnen om te migreren gebaseerd op hun intrinsieke last en ISO punt, dat de elektroforetische mobiliteit van proteïnen binnen gel26vermindert. Bovendien, in de afwezigheid van CB, eiwitten met onvoldoende negatieve lading de neiging om aggregaat, waardoor de resolutie van eiwitcomplexen in de gel20,26. Om deze beperkingen te omzeilen, is de zogeheten hoge-resolutie CN-pagina ontwikkeld door Wittig en Schragger20. In dit protocol, natrium deoxycholate (DOC) en diverse milde niet-ionische detergenten (DDM, Triton X100) worden toegevoegd aan de kathode buffer te houden membraaneiwitten solubilized en een negatieve lading verschuiving op te leggen eiwitten, wat resulteert in een aanzienlijke verbetering van resolutie20.
Een onderscheidend kenmerk van het huidige hybride CN/BN-protocol is dat zonder deze detergenten een vergelijkbare resolutie kan worden bereikt. Kortstondige toevoeging van CB aan de kathode buffer aan het begin van de elektroforese volstaat om eiwit aggregatie te beperken en de mobiliteit in de gel te verbeteren (Figuur 3 en Figuur 4). Als gevolg hiervan, deze hybride techniek maakt een uitstekende resolutie van verschillende SC assemblages en zeer lage of geen blootstelling aan detergenten. De aanwezigheid van lage bedragen van CB maakt het ook mogelijk een betere bewaring van CV-activiteit, een betere bewaring van dimeer en oligomere CV samenstellingen (Figuur 3 en Wittig en Schägger 200526), en een vermindering van de blauwe achtergrondgeluid dat kan de kwantificering van de gel-activiteiten belemmeren, met name voor CII en CIV (Figuur 2). Bovendien beperkt de afwezigheid van CB in het eiwit extract de verstoring van labiele-Eiwitinteracties binnen SCs. Bijvoorbeeld, fysieke vereniging van de ATP synthase met ANT om de synthasome 33 of met Cyclophilin-D te vormen om PTP opening 34 te reguleren zijn beter te zien in afwezigheid van CB. Kortstondige blootstelling aan CB tijdens elektroforese slechts kan daarom nuttig zijn om nieuwe eiwitinteractie binnen SCs te openbaren. in het algemeen maakt dit hybride CN/BN-pagina Protocol het mogelijk om nauwkeurige en snelle gel-activiteit metingen te combineren met analytische technieken die 2D elektroforese, immuun-opsporing en/of Proteomics voor geavanceerde analyse van SCs impliceren. Opgemerkt moet worden dat met de groeiende belangstelling voor SCs, een toenemend aantal studies gebruik kleine 10 x 10 cm gels voor native pagina. Hoewel deze aanpak kan voldoende zijn om grove veranderingen in de overvloed SC assemblages te identificeren, de lagere scheiding capaciteit van kleine gels is waarschijnlijk beperkt tot subtiele herschikkingen op te lossen of om verschillende bands gesneden voor Proteomic analyse. Bovendien, verschillende studies met behulp van kleinere gels hebben gemeld dat de respirasome migreert op dezelfde grootte als de ATPsynthase dimeer, waardoor het moeilijk is om ze te scheiden22. Daarom moet het gebruik van grote gels worden begunstigd.

Mitochondriën produceren energie door middel van oxidatieve phosphorylation, waar respiratoire complexen I-II-III-IV oxideren substraten en de overdracht elektronen naar zuurstof, het genereren van een gradiënt die het mogelijk maakt phosphorylation van ADP door de ATP synthase (CV). In de afgelopen jaren hebben uitgebreide studies aangetoond dat ademhalingsketen complexen niet uitsluitend lineair in het binnenste mitochondriale membraan zijn verwerkt, maar ook in supercomplexen (SCs) arrangementen1,2zijn ingedeeld. In de mitochondria van zoogdieren, SCs bestaan in verschillende stoichiometries: CI/CIII2/CIV1-4 (die wordt genoemd de respirasome, en die in staat is Nijhuis: O2 oxidoreduction in vitro)2, CI/CIII2, en CIII2 /CIV1-23,4. Bovendien worden Ademhalings complexen verdeeld onder verschillende verhoudingen tussen hun vrije vorm en SCs regelingen. Daarom wordt geschat dat 85%-100% van CI, 55%-65% van de CIII, en 15%-25% van de CIV zijn te vinden in SCs4. Deze supramoleculaire structuren worden verondersteld om de productie van ROS te verminderen, te stabiliseren of in de assemblage van individuele complexen te helpen, de ademhalingsketen activiteit regelen, en eiwit samenvoeging in het eiwitrijke binnen mitochondrial membraan te verhinderen5 ,6,7,8. Hun hermodellering vermogen op variatie in de vraag naar energie en hun belang in de pathogenese van ziekten wordt onderzocht in verschillende laboratoria3,7,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. studies hebben aangetoond dat pathologische veranderingen in de SCs assemblage aanwezig zijn in een verscheidenheid van aandoeningen, met inbegrip van, maar niet beperkt tot, genetische defect in cardiolipin synthese15, hartfalen16, ischemie-reperfusie17, diabetes12, en het verouderen18.
De inheemse elektroforese en immunodetection worden wijd gebruikt in de studies van SCs om OXPHOS complexen quaternaire regelingen2,19,20,21op te lossen. De inheemse elektroforese kan verder met specifiek in de tests van de gel-activiteit of 2D-sds-pagina worden gecombineerd om nauwkeurige moleculaire bepaling van diverse SCs assemblage1,19toe te laten. De mogelijkheid om SCs te bestuderen is kritisch afhankelijk van de extractie condities, waaronder type en concentratie van wasmiddel, Ionische sterkte en pH, alsmede op elektroforetische migratie omstandigheden, die bestaan uit buffer samenstelling, aanwezigheid van CB, gel grootte, en acrylamide percentage2.
Protocollen en SCs band resolutie variëren sterk onder de papieren, waardoor de vergelijking tussen de studies moeilijk en aanpassing van de methoden uitdagende22. Daarom, dit document stelt een robuust en optimaal protocol om SCs uittreksel uit geïsoleerde mitochondriën van verschillende bronnen met de niet-ionische wasmiddel digitonin, en het oplossen van hoge moleculair gewicht SCs bands. De geoptimaliseerde detergent concentratie, de samenstelling van de extractiebuffer, en de afwezigheid van Coomassie blauw in steekproefvoorbereiding minimaliseren verstoring van eiwitcomplexen. Dit protocol (Zie Figuur 1 voor een overzicht) combineert CN-pagina en bn-pagina voor een optimale SCs assemblage resolutie over grote gel, en is compatibel met in-gel activiteit assays waardoor een betere visualisatie van reactieve bands, samen met het gebruik van immunodetection voor een gedetailleerde analyse SCs regelingen en samenstelling.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-amino caproic acid</td>
			<td>sigma</td>
			<td>A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>sigma</td>
			<td>A3377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14730</td>
			<td>Lot number GR3174539-12, RRID AB_301438</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SDHA antibody [2E3GC12FB2AE2]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14715</td>
			<td>Lot number GR3235943-1, RRID AB_301433</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-UQCRC2 antibody [13G12AF12BB11]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14745</td>
			<td>Lot number GR304308-3, RRID AB_2213640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis N,N&#39;-Methylene-Bis-Acrylamide</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue G</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COX4 Monoclonal Antibody (1D6E1A8)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>459600</td>
			<td>Lot number TI2637158, RRID AB_2532240</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c from equine heart</td>
			<td>sigma</td>
			<td>C7752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand FH100M Multichannel Peristaltic Pumps</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13-310-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inner Glass Plates. Pkg of 2, 20 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with outer plate</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1651823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 485 Gradient Former. 40-175 ml acrylamide gradient former, includes valve stem and tubing kit, for use with Mini-PROTEAN multi-casting chamber systems</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1654120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDUFA9 Monoclonal Antibody (20C11B11B11)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>459100</td>
			<td>Lot number TD2536591, RRID AB_2532223</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrotetrazolium Blue chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outer Glass Plates. Pkg of 2, 22.3 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with inner plate</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1651824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl floride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerpack 1000</td>
			<td>Biorad</td>
			<td colspan="2">Serial Number 286BR 07171</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROTEAN II Sandwich Clamps. Pkg of 2, clamps for running gels, for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell, 1 left and 1 right</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1651902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROTEAN II xi Cell. Large format vertical electrophoresis cell, 16 x 20 cm gel size, 4 gel capacity, spacers and combs</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1651811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROTEAN II xi Comb. Pkg of 1, 15-well, 1.5 mm, comb for PROTEAN II xi electrophoresis cell</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1651873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROTEAN II xi Multi-Gel Casting Chamber. Multi-gel casting chamber, 20 x 20 cm gel size, for up to ten 1.5 mm thick gels, includes sealing plate, gasket, separation sheets, acrylic blocks, PROTEAN II XL alignment cards</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1652025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROTEAN II xi Spacers. Pkg of 4, 1.5 mm, spacers for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1651849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCIENCEWARE Utility Bags (10 x 12&#34;) 4 mil, Bel-Art, Box of 100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>11215-388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick Blot Paper. Pkg of 25 sheets, 15 x 20 cm, absorbent filter paper, for use with Trans-Blot cassette</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1703956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Cell With Plate Electrodes and Super Cooling Coil. Transfer cell and cooling coil (#170-3912), includes 2 gel holder cassettes, buffer tank, lid with cables, fiber pads, 1 pack blot paper</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1703939</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hybrid clear/blue native electrophoresis for the separation and analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes

Complexen van de oxidatieve phosphorylation machines vorm supramoleculaire eiwit regelingen genaamd supercomplexen (SCs), die worden verondersteld om structurele en functionele voordelen te verlenen aan mitochondria. SCs zijn geïdentificeerd in vele soorten, van gist tot zoogdier, en een toenemend aantal studies rapporteren verstoring van hun organisatie in genetische en verworven ziekten van de mens. Als gevolg daarvan is een toenemend aantal laboratoria geïnteresseerd in het analyseren van SCs, die kan worden methodologisch uitdagend. Dit artikel bevat een geoptimaliseerd protocol dat de voordelen van Blue-en Clear-native pagina methoden combineert om SCs op een tijd-effectieve manier op te lossen en te analyseren. Met deze hybride CN/BN-pagina methode, mitochondrial SCs geëxtraheerd met optimale hoeveelheden van de milde wasmiddel digitonin worden kort blootgesteld aan de anionische kleurstof Coomassie blauw (CB) aan het begin van de elektroforese, zonder blootstelling aan andere wasmiddelen. Deze korte blootstelling aan CB maakt het mogelijk om SCs te scheiden en op te lossen zo effectief als met traditionele BN-pagina methoden, terwijl het vermijden van de negatieve impact van hoge CB niveaus op in-gel activiteit assays, en labiele eiwit-Eiwitinteracties binnen SCs. Met dit protocol is het dus mogelijk om nauwkeurige en snelle in de metingen van de gel-activiteit met analytische technieken te combineren die 2D elektroforese, immuun-opsporing, en/of Proteomics voor geavanceerde analyse van SCs impliceren.

Figuur 2 toont de resultaten van een digitonin titratie experiment gericht op het identificeren van de juiste hoeveelheid digitonin die nodig is voor de extractie van SCs. Dit bedrag zal variëren afhankelijk van het type weefsel/cel en of het monster is bevroren of niet. Voor dit experiment werd een CIV in-gel activiteit uitgevoerd om te visualiseren SCs geïsoleerd van verse muis lever mitochondriën. De verhoudingen van 2/1 tot 10/1 g digitonin/g van proteïne werden getest. De optimale hoeveelheid digitonin voor dit monster is 4 g/g, want het biedt een goede resolutie van monomeer CIV, en een hoog moleculair gewicht SCs. Bij een lagere verhouding, zijn de banden niet duidelijk en lossen in een vlek tijdens elektroforese op, terwijl het gebruik van hogere verhouding van digitonin tot verstoring van hoog moleculair gewicht SC leidt.
Figuur 3 en Figuur 4 tonen de resultaten van een volledig experiment uitgevoerd op een voorbereiding van de muis lever mitochondriën geëxtraheerd met 4 g digitonin/g eiwit. De proteïnen werden gescheiden gebruikend hybride BN/CN-pagina, standaard BN-pagina, of CN-pagina. Alle drie gels werden gegoten op hetzelfde moment en de rijstroken werden geladen met replica's van dezelfde steekproef. Na elektroforese, werden de individuele stegen gesneden en werden verwerkt voor in de meting van de gel activiteit (CI, CII, CIV en CV op Figuur 3) en IMMUNOBLOTTING (CI, CII, CIII, CIV, CV op Figuur 4).
De toevoeging van CB of snel voorbijgaand in kathode buffer (d.w.z. hybride CN/BN-pagina) of in steekproef en kathode buffer door elektroforese (d.w.z. BN-pagina), verbetert aanzienlijk de mobiliteit en de resolutie van SC banden, en individuele Ademhalings complexen vergeleken met de GN-pagina (Figuur 3). Bands zijn gemakkelijk te onderscheiden met de hybride techniek of BN-pagina na in-gel activiteit voor CIV, terwijl in hetzelfde monster opgelost door CN-PAGE, SCs en monomeer CIV reactieve bands niet kunnen worden geïdentificeerd.
Figuur 3 en Figuur 4 tonen aan dat de resolutie en het band patroon van OXPHOS monomeren en supramoleculaire samenstellingen kwalitatief vergelijkbaar zijn tussen de hybride CN/BN-pagina en bn-pagina. Er bestaan echter opmerkelijke verschillen. Ten eerste, de elektroforetische mobiliteit van OXPHOS complexen is licht verminderd wanneer eiwitten worden gescheiden met behulp van hybride CN/BN-pagina voorwaarden VS standaard bn-pagina, als gevolg van verminderde hoeveelheid CB. Deze mobiliteitsverschuiving is groter voor de CIV-monomeren, gevolgd door CV-monomeren, en CI (Figuur 3 en Figuur 4). Ten tweede, de blauwe achtergrond is lager in de hybride CN/BN-pagina ten opzichte van BN-pagina (Figuur 3, left Lanes). Als gevolg hiervan, hoge achtergrondniveaus na BN-pagina volledig maskeert de in-gel activiteit kleuring voor CII, en verbetert de achtergrondgeluid in verband met de activiteit van de CIV dimeers (Figuur 3). Ten derde, de activiteit van CV is hoger wanneer monsters worden uitgevoerd onder hybride CN/BN-pagina voorwaarden ten opzichte van BN-pagina (Figuur 3), als gevolg van de verminderde hoeveelheid CB, waarvan bekend is dat interfereren met de CV-katalytische activiteit. 26 CN/bn-pagina maakt het ook mogelijk een betere bewaring van CV supramoleculaire samenstellingen, zoals blijkt uit een groter deel van de totale CV-activiteit wordt GEASSOCIEERD met CV dimeer (Figuur 3). Bovendien zijn CV oligomeren zichtbaar onder de GN/BN-pagina, terwijl ze volledig gescheiden zijn onder BN-pagina voorwaarden. Interessant is dat de verschillende bands die de CV-activiteit tonen ook worden waargenomen tussen CV-monomeren en dimeers, wanneer monsters worden uitgevoerd onder GN/BN-pagina (Figuur 2).
Figuur 5 toont een representatieve analyse van OXPHOS complexe distributie in supramoleculaire assemblages. Het beeld toont CI in gel activiteit van monsters verkregen uit 4 verschillende gezonde muis lever mitochondria preparaten. Densitometry analyse maakt het mogelijk om het gebied te meten onder de curve van CI-reactieve bands, en de relatieve verdeling van de C1-activiteit in de monomeer (I1) en supramoleculaire vormen (i1III2, i1III2IV te presenteren 1, I1III2IVn). Soortgelijke analyse kan worden uitgevoerd na immunoblot.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59294/59294fig1.jpg"> Figuur 1: assay workflow. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59294/59294fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59294/59294fig2.jpg"> Figuur 2: Digitonin titratie om supercomplexen uittreksel uit verse muis lever mitochondria. Dit voorbeeld toont de hoeveelheid muis lever mitochondria, geïsoleerd van een dier dat werd behandeld met toenemende hoeveelheden van digitonin te halen respiratoire supercomplexen. Monsters werden vervolgens opgelost door hybride CN/BN pagina, en in-gel activiteit van CIV werd bepaald. CIV1: complexe IV monomeren; CIV2: complexe IV dimeer; SC: supercomplexen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59294/59294fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59294/59294fig3.jpg"> Figuur 3: in-gel activiteit van OXPHOS complexen na hybride CN/bn-pagina, bn-pagina of CN-pagina. Lever mitochondriën geïsoleerd van de ene muis werden behandeld met digitonin (4 g/g verhouding digotonin/eiwit) om respiratoire supercomplexen te halen. De hoeveelheid van dit monster werd vervolgens op meerdere putten in drie verschillende gels geladen en naar GN/BN-pagina, BN-pagina of CN-pagina gezonden. Elke herhaling rijstrook binnen elke gel werd vervolgens gesneden en onmiddellijk gebruikt voor in-gel activiteit assays (gelabeld CI, CII, CIV en CV). Één steeg werd gebruikt als controle om achtergrond (geëtiketteerde BG) te tonen bevlekt met Coomassie blauw. OXPHOS complexen en supramoleculaire samenstellingen worden geïdentificeerd met behulp van de standaard nomenclatuur, met getallen in indices met vermelding van de moleculaire stoichiometrie van elk OXPHOS complex. Opgemerkt moet worden dat de positie van CIII-bevattende supramoleculaire assemblages is gebaseerd op immunodetection, omdat in-gel activiteit voor CIII werd niet uitgevoerd in dit specifieke experiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59294/59294fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59294/59294fig4.jpg"> Figuur 4: immunoblot analyse van OXPHOS complexen na hybride CN/bn-pagina of bn-pagina. Repliceert van de experimenten beschreven in de Figuur 3 legende werden Electro-overgedragen op een enkel membraan. Na overdracht, werden de individuele stegen gesneden en werden uitgebroed met specifieke antilichamen die CI, CII, CIII, CIV, en CV erkennen. OXPHOS complexen en supramoleculaire assemblages worden geïdentificeerd met behulp van de standaard nomenclatuur, met cijfers in indices met vermelding van de moleculaire stoichiometrie van elk OXPHOS complex. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59294/59294fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59294/59294fig5.jpg"> Figuur 5: kwantificering van de CI-verdeling in monomeer en supramoleculaire assemblages. (A) CI in-gel activiteit bepaald na hybride CN/bn-pagina van in de lever mitochondria SC extracten verkregen uit 4 muizen. BDensitograms verkregen met behulp van de gel-analyse tool van ImageJ met verschillende pieken die overeenkomen met de CI-monomeren (i1) en diverse CI-bevattende supramoleculaire-complexen (i1III2, i1III2IV1 , en I1III2IVn). Ckwantificering van de relatieve verdeling van de C1-activiteit. De gegevens vertegenwoordigen betekenen en SEM van de 4 muizen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59294/59294fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Digitonin/eiwit verhouding (g/g)</td>
			<td>2 g/g</td>
			<td>4 g/g</td>
			<td>6 g/g</td>
			<td>8 g/g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume van de extractiebuffer (µ L)</td>
			<td>400</td>
			<td>300</td>
			<td>200</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume van 10% voorraad digitonin (µ L)</td>
			<td>100</td>
			<td>200</td>
			<td>300</td>
			<td>400</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totale extractiebuffer volume (µ L)</td>
			<td>500</td>
			<td>500</td>
			<td>500</td>
			<td>500</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: volumes die nodig zijn om SCs te halen uit 5 mg mitochondriale eiwitten met behulp van verschillende digitonin/eiwit ratio's.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Samengestelde</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA, pH 7,5</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>30 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kaliumacetaat</td>
			<td>150 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycerol</td>
			<td>12</td>
		</tr>
<tr>
<td>6-aminocaproic zuur</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: SC extractiebuffer (eindconcentraties). Houd bij 4 °C voor een maximum van 3 maanden.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Samengestelde</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
3X gel buffer: Hoeveelheid en houd bij-20 °c, pH 7,5
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Imidazool/HCl pH-7,0</td>
			<td>75 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>6-aminocaproic zuur</td>
			<td>1,5 M</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
Acrylamide buffer: Hoeveelheid en houd bij-20 °c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acrylamide</td>
			<td>99,5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bis-acrylamide</td>
			<td>3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: gel voorraad buffers.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Voor 2 gels:</td>
			<td>4% (60 mL)</td>
			<td>12% (60 mL)</td>
			<td>Stapelen (4%) (25 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>3X gel buffer</td>
			<td>19,8 mL</td>
			<td>19,8 mL</td>
			<td>8,25 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acrylamide buffer</td>
			<td>4,8 mL</td>
			<td>14,4 mL</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>35 mL</td>
			<td>13,1 mL</td>
			<td>14,6 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycerol</td>
			<td>-</td>
			<td>12 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>APS 10%</td>
			<td>360 l</td>
			<td>60 l</td>
			<td>150 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>TEMED</td>
			<td>24 l</td>
			<td>12 l</td>
			<td>10 l</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 4:4% – 12% gradiënt gel.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Samengestelde</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Anode buffer: Houd bij 4 °C, pH 7,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Imidazool</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Kathode buffer: Houd bij 4 °C, pH 7,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tricine</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Imidazool</td>
			<td>7,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Met of zonder Coomassie blauw (G250)</td>
			<td>0,022%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 5: elektroforese buffers.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Samengestelde</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Complexe I activiteit buffer: bereiden vers in 5 mM TRIS-HCl pH 7,4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nitrotetrazolium blauw</td>
			<td>3 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NIKS</td>
			<td>14 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Complex II activiteit buffer: bereiden vers in 5 mM TRIS-HCl pH 7,4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Succinaat</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>PMSF</td>
			<td>0,2 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nitrotetrazolium blauw</td>
			<td>3 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Complex IV activiteit buffer: bereiden vers in 50 mM na-fosfaat pH 7,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cytochroom Callebaut</td>
			<td>0,05 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Diaminobenzidine</td>
			<td>2,3 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">ATPsynthase activiteit buffer: bereiden vers in het water, aan te passen pH tot 8 met KOH</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycine</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>30 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Atp</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 6: in-gel activiteit assay buffers.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Samengestelde</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Overdracht buffer</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris base</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycine</td>
			<td>192 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sds</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Methanol</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">TBST</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris base</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>137 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tween 20</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 7: immunoblotting buffers.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Complexe</td>
			<td>Subunit</td>
			<td>Kloon</td>
		</tr>
<tr>
<td>I</td>
			<td>NDUFA9</td>
			<td>20C11B11B11</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ii</td>
			<td>SDHA</td>
			<td>2E3GC12FB2AE2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Iii</td>
			<td>UQCRC2</td>
			<td>13G12AF12BB11</td>
		</tr>
<tr>
<td>Iv</td>
			<td>COX4</td>
			<td>1D6E1A8</td>
		</tr>
<tr>
<td>V</td>
			<td>ATPB</td>
			<td>3D5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 8: antilichamen gebruikt voor immunoblotting te detecteren respiratoire keten SC. Zie tabel met materialen voor bedrijven en lotnummers.

Watch this Scientific Journal Video about Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes at JoVE.com

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Hier presenteren we een protocol te halen, op te lossen en te identificeren mitochondriale supercomplexen die blootstelling aan detergenten en Coomassie blauw minimaliseert. Dit protocol biedt een optimaal evenwicht tussen resolutie, en behoud van enzymactiviteiten, terwijl het minimaliseren van het risico om labiele proteïne-eiwitinteractie te verliezen.

Hybride duidelijke/blauwe inheemse elektroforese voor de scheiding en de analyse van mitochondrial Ademhalingsketen supercomplexen

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Supercomplexen zijn supramoleculaire samenstellingen gevormd door ademhalingsketencomplexen in het binnen-mitochondriale membraan. De vorming van deze supercomplexen wordt verondersteld om verscheidene structurele en functionele voordelen te verlenen, die verminderde productie van reactieve zuurstofsoorten, stabilisatie en efficiëntere assemblage van individuele ademhalingskettingcomplexen, de regeling van de ademhalingskettingactiviteit, en preventie van eiwitaggregatie in de eiwitrijke milieu van het binnenmembraan omvatten. Veranderingen in de assemblage en samenstelling van supercomplexen zijn dynamisch en blijken steeds meer ten grondslag te liggen aan veranderingen in de mitochondriale functie die tijdens fysiologische aanpassing worden waargenomen, evenals een verscheidenheid aan genetische en verworven ziekten.Deze video presenteert een hybride helder /blauw native PAGE-protocol om supercomplexen op een nauwkeurige en tijdsrenorde op te lossen en te analyseren. Het belangrijkste voordeel van deze hybride heldere / blauwe native PAGE methode is dat het optimaal combineert verschillende aspecten van traditionele blauwe en duidelijke native PAGE protocollen, die het mogelijk maakt om de blootstelling aan detergentia en anionische verbindingen te verminderen tot een minimum in vergelijking met gepubliceerde protocollen. Optimale scheiding en analyse van supercomplexen wordt bereikt op grote gradiëntgels.Deze procedure omvat een aantal delicate stappen die handmatige vaardigheden en zorgvuldige uitvoering vereisen. Visuele ondersteuning van het geschreven protocol geeft belangrijke tips die de implementatie van de techniek vergemakkelijken. Demonstreren van de procedure is Alexandrië, een promovendus uit mijn laboratorium.Om te beginnen, centrifugeren de mitochondriën geïsoleerd uit het dierlijke weefsel in een 1,5-milliliter buis op 16, 000-keer-G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg en voeg het berekende volume van de ijskoude extractiebuffer met digitonin toe aan de buis om de mitochondriale pellet opnieuw op te zetten. Plaats buizen op een mini buis rotator en incubeer gedurende 30 minuten op vier graden Celsius bij een gemiddelde rotatiesnelheid.Centrifugemonsters op 20, 400 keer-G gedurende 45 minuten bij vier graden Celsius om onoplosbare fragmenten te verwijderen. Breng de supernatant in een nieuwe buis op ijs. Als elektroforese niet op dezelfde dag wordt uitgevoerd, bewaar monsters bij min 80 graden Celsius.Open de gietkamer. Plaats een 20 centimeter keer 22 centimeter buiten glasplaat in de kamer. Plaats een set van 1,5 milliliter afstandhouders met behulp van de uitlijningskaart om ervoor te zorgen dat ze stevig tegen de zijkant en hoeken van de kamer zitten.Plaats een binnenglasplaat op de ruimters om de gel sandwich te vormen, en leg een plastic scheidingsplaat op de top van de glasplaat. Schik nog drie gel sandwich assemblage. Voeg meer acrylblokken of glasplaten toe indien nodig om de resterende ruimte in de kamer in te nemen.Plaats een strook van parafilm in de groef alvorens de pakking stevig in de pakkinginkt te plaatsen. Plaats de plafondplaat op de kamer en draai alle zes schroeven aan. Ga door de gietkamer.Plaats gradiënt eerst op een roerplaat met een magnetische roerder in de lichtmengkamer. Sluit de slang van de gietkamer aan op de gradiënt eerstgenoemde en bevestig de slang in de cassette van de peristaltische pomp. Zorg ervoor dat de stopcock van het verloop eerstgenoemde gesloten is.Om vier gels te werpen, bereid 60 milliliter van 4% en 60 milliliter van 12% geloplossingen in twee Erlenmeyer-kolven en draai grondig om te mengen. Giet de 4%gel oplossing in de licht mengkamer, en de 12%in de zware reservoirkamer van de gradiënt voormalige. Stel de roersnelheid van de roerplaat in op 350 tpm.Open vervolgens de stopcock en zet de pomp aan bij 35 rpm. Zodra het oplossingsniveau van de lichtfractie lager is dan de zware fractie, pauzeer de pomp en open de klepsteel tussen lichte en zware reservoirs. Laat breuken volume equilibrate en start de pomp opnieuw.Zorg ervoor dat er geen bellen in het systeem en vast komen te zitten tussen glasplaten. Zodra de gradiënt gel volledig is gegoten, stop de pomp en overlay een milliliter water op elke gel sandwich om te voorkomen dat het drogen van de gel. Laat het twee uur polymeriseren.Bereid 25 milliliter stapelen gel in Erlenmeyer kolf en wervel om grondig te mengen. Delicaat omkeren van de montage om water te verwijderen, en voeg 15-well kammen in elke gel sandwich. Giet stapelen gel en laat het polymeriseren voor twee uur.Daarna steek je gel en sandwichklemmen in en verwijder je de kam. Met de korte glasplaat naar beneden, steek de gel sandwich in de koelkern. Herhaal aan de andere kant en plaats de kern in de elektroforese tank.Giet 300 milliliter blauwe kathodebuffer in de binnenkamer van de elektroforesetank. Met een pipet en laadtips laad je 75 tot 175 microgram eiwit per put. In koude ruimte op vier graden Celsius, sluit de elektroden in de voeding en zet het op 150 volt, en lopen gel voor anderhalf uur, of totdat monsters zijn allemaal in de gradiënt gel.Laadrepliceert van het monster in afzonderlijke putten om parallelle bepaling van in-gel activiteiten en immunoblot analyse van OXPHOS complexen mogelijk te maken. Verwijder blauwe kathodebuffer met pipet. Vervang door 300 milliliter Coomassie blauwe gratis kathode buffer, en lopen gel op 200 volt 's nachts in de koude kamer.Bereid voor het einde van elektroforese in-gel activiteitsbuffers volgens het manuscript en bewaar ze in het donker bij kamertemperatuur. Stop met elektroforese en haal gel op. Snijd de plastic zak, zodat het kan worden geopend als een boek.Snijd rijstroken door en breng gelbanen over in plastic zakken. Gebruik een warmteafdichter om twee van de drie zijden te verzegelen. Als er negatieve controle-experimenten worden uitgevoerd, voegt u remmers toe aan de testbuffers.Voor drie experimentele monsters, voeg 20 milliliter in-gel activiteit buffer. Verwijder bubbels en verzegel de vierde kant van plastic zak. Incubeer gel lanes op 37 graden Celsius in het donker en controleer elke 15 minuten.De incubatietijd varieert afhankelijk van de hoeveelheid eiwitten en complexen. Na incubatie, spoel gel rijstroken in water om reactie te stoppen, en beeld op een witte achtergrond voor complexe I, complex II, complex IV, of zwarte achtergrond voor complexe V.Voor dit voorbeeld werd een complexe IV in-gel activiteit uitgevoerd om supercomplexen geïsoleerd van verse muis lever mitochondriën visualiseren. De optimale hoeveelheid digitonin voor dit monster is vier gram per gram, omdat het een goede resolutie van monomeercomplex IV en supercomplexen met een hoog moleculair gewicht biedt.Bij een lagere verhouding zijn banden niet duidelijk en verdwijnen ze in een uitstrijkje tijdens elektroforese, terwijl het gebruik van een hogere verhouding van digitonin leidt tot verstoring van supercomplexen met een hoog moleculair gewicht. Lever mitochondriën geïsoleerd van een muis werden behandeld met de optimale hoeveelheid digitonine om ademhalingssupercomplexen te extraheren. De elektrofororetische mobiliteit van OXPHOS complexen wordt iets verminderd wanneer eiwitten worden gescheiden met behulp van hybride clear / blue native PAGE voorwaarden, in vergelijking met standaard native PAGE, als gevolg van verminderde hoeveelheid Coomassie blauw.Deze mobiliteitsverschuiving is groter voor complexe IV monomeren, gevolgd door complexe V monomeren, en complexe I.The blauwe achtergrond is lager in de hybride clear native / blue native PAGE in vergelijking met blue native PAGE. Hoge achtergrondniveaus na blauwe native PAGE maskeert de in-gel activiteitskleuring voor complex II volledig en verbetert het achtergrondgeluid dat gepaard gaat met de activiteit van complexe IV-dimers. Voor dit protocol is titratie van de monsters van belang met verschillende hoeveelheden digitonine van cruciaal belang om de omstandigheden te identificeren die een optimale oplosking mogelijk maken, met behoud van enzymactiviteit en fysiologische eiwitinteracties.Alle stappen met betrekking tot de gelgietsel moeten zorgvuldig worden uitgevoerd om een optimale helling voor een goede monsterscheiding te vormen. Er moet ook uiterste zorg worden genomen voor de manipulatie van deze grote en fragiele gels. Houd ze altijd met meerdere vingers met behulp van het hoge percentage van de gel.Met deze hybride clear/blue native PAGE-methode worden monsters slechts kort blootgesteld aan de anionische kleurstof Coomassie blauw aan het begin van elektroforese zonder blootstelling aan andere detergentia. Dit maakt het mogelijk om supercomplexen net zo effectief te scheiden en op te lossen als met traditionele blue native PAGE-methoden, terwijl het negatieve effect van hoge Coomassie-blauwe niveaus op in-gel-activiteitstesten en labiele eiwit-eiwitinteracties binnen supercomplexen worden vermeden. Met dit protocol is het daarom mogelijk om nauwkeurige en snelle in-gel activiteitsmetingen te combineren met analytische technieken met 2D-elektroforese, immunodetection en/of proteomics-analyse van supercomplexen.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Mitochondria and Energy Production

SCIENTISTS IN ACTION

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Capillaire Elektroforese Scheiding van monoklonaal antilichaam isovormen gebruiken een neutrale capillair

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Analyse van supercomplexen van de Mitochondrial Electron Transport Chain met Native Electrophoresis, In-gel Assays, en Electroelution

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteoom analyse van Context-specifieke eiwitcomplexen in hun inheemse cellulaire omgeving

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Analyse van intrinsieke wanorde van de AtHIRD11 en bindende naar metaalionen door capillaire gelelektroforese en affiniteit capillaire elektroforese

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analyse van eiwitcomplexen thylakoïde membraan door blauwe inheemse gelelektroforese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Ionenwisselingschromatografie (IEX) gekoppeld aan meerdere hoek lichtverstrooiing (MALS) voor eiwit scheiding en karakterisering

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-time, semi-geautomatiseerde fluorescerende meting van de luchtweg oppervlak vloeibare pH van primaire menselijke luchtweg epitheelcellen

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Ubiquitin-ketenanalyse door parallelle reactiemonitoring

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Native Cell Membrane Nanodeeltjes Systeem voor Membraan Eiwit-Eiwit Interactie Analyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...