Name: hybrid clear/blue native electrophoresis for the separation and analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes
Uploaded: 2019-05-19T14:00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes at JoVE.com

Yazarlar teknik yardım için Jenna Rossi teşekkür etmek istiyorum, ve Dr Mireille Khacho, Dr David Patten ve Dr. Ujval anil kumar yararlı tartışma için bu yöntemi geliştirirken. Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) ve Ulusal Bilimler ve Kanada Mühendislik Konseyi (NSERC) tarafından finanse edilmiştir. AC doktora Ödülü alıcı-Frederick Banting ve Charles En Iyi Kanada lisansüstü Burslar (CIR).

1. SC ekstraksiyon
<ol><li>Hazırlamak 100 mL ekstraksiyon tamponu (bkz. Tablo 2) EDTA suda çözünerek. Tamamen çözülmüş kadar KOH ile pH artırın, sonra HCl ile 7,5 pH ayarlayın. çözüme kalan bileşenleri ekleyin, su ile son hacmine doldurun ve buzda tutun. Bir tüpte,% 10 stok çözeltisi yapmak için ekstraksiyon tamponunun digitonini çözülür, tamamen çözülene kadar iyice girdap yapın ve buzun üzerine tutun. Not: ekstraksiyon tamponu önceden hazırlanabilir ve en fazla 2 ay boyunca 4 °C ' de tutulur. Eğer dalgalı bantları jel altında görünmeye başlar, bu ekstraksiyon tampon çok eski anlamına gelir. % 10 digitonin çözeltisi hazırlarken, fare karaciğeri mitokondri kullanıyorsanız, numune başına 500 μL sayma bir stok hacmi hazırlayın. Digitonin çözünürlüğü, madde ve ürün lot (bkz. malzeme tablosu) üzerine değişir.</li>
	<li>Hayvan dokusundan izole edilen mitokondri (fare kalbi, kas, karaciğer; sıçan kalbi) veya hücreler (Human fibroblast) standart protokolleri kullanarak23,24,25 SCs çıkarılması için kullanılabilir. Mitochondri elde edildikten sonra, üreticinin tavsiyelerine göre bikinkoninik asit tahlil kiti kullanarak protein içeriği ölçmek. Gerektiğinde bu adımda proteiler ve fosfatazlar inhibitörleri ile izole mitokondri takviyesi. Not: SCs ya taze veya çözülmüş mitokondri üzerinde ayıklanabilir. Aynı zamanda, aynı çözümleri ve aynı koşullar altında aynı toplu tedavi edilir emin olmak için, aynı anda tüm örneklerden SCs ayıklamak için tavsiye edilir.</li>
	<li>Elde edilen mitokondriyal protein konsantrasyonuna dayanarak, ve istenen son digitonin/protein oranı, Tablo 1başına olarak gerekli stok digitonin solüsyonu ve ekstraksiyon tamponunun hacmini hesaplayın. SC ekstraksiyon için, her 10 μg mitokondrial protein için digitonin içeren 1 μL ekstraksiyon tamponu (Tablo 2) ekleyin. Digitonin/protein oranı 2 ila 8 g/g arasında farklılık gösterebilir. Kullanılan her yeni örnek türü için digitonin titrasyonu her zaman yapılmalıdır (örnek için bkz . Şekil 2 ).</li>
	<li>Pellet mitokondri, bir 1,5 mL tüp santrifüjleme ile 16.000 x g 10 dk 4 °c ' de.</li>
	<li>Süpernatant atın ve digitonin içeren buz-soğuk ekstraksiyon tampon hesaplanan hacminde mitokondriyal Pelet yeniden askıya. Tüpleri Mini Tüp Rotator üzerine yerleştirin ve orta dönme hızında 4 °C ' de 30 dakika boyunca inküye yapın. Numunelerin düzgün karıştırıldığından emin olun.</li>
	<li>4 °C ' de 45 dk için 20.400 x g 'de santrifüjlenmiş parçacıkları çıkarın.</li>
	<li>Buz üzerinde yeni bir tüp süpernatant aktarmak ve proteinleri ölçmek. Bu kesir solunum süper kompleksleri özü temsil eder. Aynı gün Elektroforez gerçekleştirilmez ise-80 °C ' de mağaza örnekleri. Not: 1) önlemek dondurmak/çözülme döngüleri, bu SCs. aliquot örnek daha yüksek moleküler düzenlemeler bozar gibi ilk donma/çözme döngüsü gerekirse önce. 2) standart bir BN-PAGE deneyi yapmak için, bu adımda SCs ekstresi için CB eklenmesi gerekir. CB, kullanılan deterjan miktarına göre 1G/8g oranında eklenmelidir.</li>
</ol>2. degrade jel döküm ve Elektroforez
<ol><li>Degrade jeli, aliquot ve-20 °C ' de saklamak için 3x degrade tampon ve akrilamid stokları hazırlayın (bkz. Tablo 3).</li>
	<li>Anot ve katot tamponları hazırlayın ve 4 °C ' de tutun (bkz. Tablo 5).</li>
	<li>Döküm bölmesini açın ve odaya bir dış cam plaka (20 cm x 22 cm) yerleştirin. Hizalama kartını kullanarak bir set mesafe tutucular (1,5 mm) konumlandırın ve odanın yan ve köşelerine sıkıca oturmasını sağlayın. Mesafe tutucular (Bu form jel sandviç) üzerine bir iç cam plaka (20 cm x 20 cm) yerleştirin ve cam plaka üstüne bir plastik ayırma levha koydu.</li>
	<li>İstenilen sayıda jelin ulaşılana kadar 2,3 adımı yineleyin. Bu protokol için 4 jeller kaslanmış. Kullandığınız döküm odası sistemi (bkz. malzeme tablosu) bir defada en fazla 10 jeller döküm sağlar. İlk olarak gerekli olarak birçok akrilik blokları ekleyerek odasında kalan alanı alın ve sonra cam plakaları gerekirse. Not: montaj sıkıca mühürlü olmalıdır; Oda içinde jel sandviç arasında boşluk olmamalıdır.</li>
	<li>Conta çentik sıkıca conta oturma önce oluk Parafilm bir şerit yerleştirin. Sızdırmazlık plakasını Odaya yerleştirin ve 6 vidayı sıkın. Döküm odasına hazır olun.</li>
	<li>"Işık" karıştırma odasında bir manyetik karıştırıcı ile bir mix plaka üzerinde degrade eski yerleştirin. Degrade eski döküm odası tüp bağlayın, peristaltik pompa kasasında boru güvenli ve degrade eski stopkoku kapalı olduğundan emin olun.</li>
	<li>4 jeller cast için, hazırlamak 60 mL% 4 ve 60 mL 12% jel çözümleri ( Tablo 4) bir Erlenmeyer Flask ve girdap iyice karıştırın. Pour 60 mL 4% jel çözeltisi "ışık" karıştırma odası, ve 60 mL% 12 gradyan eski "ağır" rezervuar odasında. 350 RPM 'de karıştırma plakasının karıştırma hızını ayarlayın. Stopkoku açın ve 35 RPM 'de pompa açın.</li>
	<li>Işık fraksiyonu ağır fraksiyondan daha düşük bir kez, pompa duraklatın ve "ışık" ve "ağır" rezervuar arasında Vana kök açın, kesirler hacim equilibrate izin ve pompa yeniden başlatın. Not: hiçbir kabarcıklar sisteme girmek ve cam plakaları arasında sıkışıp almak önemlidir. Bu durumda, montaj, yıkama ve Yinele geri alın.</li>
	<li>Degrade jel tamamen döküldü sonra, pompa durdurun ve jel kurutma önlemek için her jel sandviç üzerinde (yaklaşık 1 mL) su bindirme. 2 h için polimerize edelim.</li>
	<li>Erlenmeyer 'de 25 mL istifleme jeli hazırlayın ve iyice karıştırın. Su çıkarın ve her jel sandviç 15 iyi taraklar takın. İstifleme jel dökün ve polimerize izin 2 h. Not: jeller 1 hafta boyunca 4 °C ' de tutulabilir.</li>
	<li>Sandviç kelepçeleri jel takın ve tarak çıkarın. Kısa cam plakalı aşağı bakacak şekilde, jel sandviçini soğutma çekirdeğine takın. Diğer tarafta tekrar edin ve çekirdeği Elektroforez tankına yerleştirin.</li>
	<li>Elektroforez tankının iç odasında 300 mL mavi katot tamponu dökün. Elektroforez tankının dış odasında 2 L anot tamponu dökün. Not: elektrot, yaklaşık 300 mL gerektiren katot tamponunun içinde daldırma olmalıdır.</li>
	<li>75 μg ve 175 μg protein arasında her iyi yük. 1,5 h için 150 V 'de jel çalıştırın (veya numune tüm degrade jeli girinceye kadar) soğuk odada (4 °C). DIPNOT 1:1) içinde-jel aktivite bantları iyi çözünürlüğü için en az 75 μg iyi gereklidir. 175 üzerinden yükleme μg protein aşırı enzim aktivitesi nedeniyle net bantları kaybına yol açacaktır. 2) numunenin çoğaltır içinde-jel faaliyetleri ve OXPHOS kompleksleri immünoblot Analizi paralel belirlenmesi sağlamak için ayrı kuyular yüklenmelidir. CI, CII, CıV ve CV için IgA paralel belirlenmesi en az 300 μg gerektirir. CI, CII, CII, CıV ve CV 'nin paralel immünoblot analizi en az 375 μg gerektirir.</li>
	<li>Mavi katot tamponu pipet veya vakum ile çıkarın, 300 mL Coomassie mavi ücretsiz katot tamponu ile değiştirin ve 200 V 'de bir gecede (16 – 20 saat) soğuk odada (4 °C) jel çalıştırın. İn-jel aktivite ölçümü veya İmmünoblotting için adım 3 veya 4 ' e geçin.</li>
</ol>3. ı, II, IV ve CV kompleksler için jel aktivitesi
<ol><li>Elektroforez bitmeden önce, Tablo 6' ya göre jel aktivite tamponları HAZıRLAYıN ve RT. 20 ml in-jel aktivite tamponunda karanlıkta tutun 3 örnek şerit için yeterlidir. Not: Bu CV-jel aktivite tahlil ATPsynthase ters aktivite dayanmaktadır (yani, ATP hidroliz), ve bir ortak faktör olarak kalsiyum kullanır, hangi jel çökelir. Kalsiyum diğer protokollerde kullanılan kurşun daha az zararlı. Ayrıca, bu protokolün kullanımı, jel23ön aktivasyon/Klima gerektirmez.</li>
	<li>Elektroforezi durdurun ve jeli alın. Kesme şeritleri, gerekirse ve plastik torbalarda jel şeritleri transfer (3 taraf kesilmiş, ve plastik torba bir kitap gibi açıldı). 3 tarafın 2 ' sini bir ısı mühürleyici ile mühürleyin. Not: Deneysel gruplar arasında SC bantları bileşimi karşılaştırmak Için aynı jel üzerinde çoğaltır aynı örnekleri çalıştırmak için tavsiye edilir. Farklı jel aktivite tamponları (CI, II, IV, V) her çoğaltır kulvarmak için kesme şeritleri. Özgüllüğü onaylamak için, ek çoğaltır özel solunum zinciri inhibitörleri varlığında jel etkinliklerinde çalışacak şekilde hazırlanabilir.</li>
	<li>3 deneysel numune (i.e. 3 kuyular) için, 20 mL in-jel aktivite tampon eklemek, kabarcıklar kaldırmak ve plastik torba 4TH tarafı mühür. Not: gerçekleştirildiğinde negatif kontrol deneylerinde inhibitörler ekleyin: CI: Rotenone 1 μM; CII: Sodyum MALONATE 10 mM; Cııı: Antimicin-A 8 μM; CıV: KCN 0,6 mM; CV: Oligomisin 0,5 μM.</li>
	<li>37 °C ' de jel şeritleri karanlıkta ve her 15 dakikada bir kontrol edin. Kuluçdak süresi protein ve kompleksleri miktarına bağlı olarak değişir. CI, CıV veya CV 'den daha hızlı tepki verecektir. optimum boyama genellikle sonra oluşur 2 CI için h, 4 CıG için h ve 6 CII ve CV için h.</li>
	<li>Reaksiyonu durdurmak için su içinde jel şeritleri durulayın, ve CV için beyaz bir arka plan üzerinde görüntü, CII, CıV, veya özgeçmiş için siyah arka plan. Not: jeller birkaç ay boyunca RT veya 4 °C ' de plastik torbalarda tutulabilir.</li>
</ol>4. İmmünoblotting
<ol><li>Transfer arabelleğini Tablo 7' ye göre HAZıRLAYıN ve RT 'de tutun. Tbst 'i HAZıRLAYıN ve RT 'de tutun.</li>
	<li>Tüm jeli veya seçilen şeritleri bir konteynerin içine yerleştirin ve SDS ile tamamlayıcı transfer arabelleği ekleyin (% 0,25 transfer tamponunun Final). Rocker üzerinde konteyner yerleştirin ve 1 h için inkük.</li>
	<li>Cut PVDF membranı (jel boyutuna karşılık gelen boyut) ve 2 dakika boyunca ajitasyon altında 20 mL metanol içinde etkinleştirin. 20 mL transfer tampon ve 2 dakika boyunca ajitasyon altında yer değiştirin.</li>
	<li>Hazırlama transfer sandviç, aşağıdan üstüne, emin orada jel ve aktif PVDF membran arasında kabarcık yoktur: kaset/siyah sünger/Blot kağıt/membran/jel/Blot kağıt/siyah sünger/siyah yan kaset açık tarafı. Kaseti kapatıp kilitle.</li>
	<li>Transfer haznesine transfer sandviç yerleştirin, sandviçin net tarafı elektrot kırmızı tarafına bakmaktadır ve jeli karıştırmak için transfer tamponunu dökün. Soğutma sistemini transfer tankına bağlayın ve 4 °C ' de ayarlayın. 40 mA 'da ayarlanan güç kaynağına bağlanın ve 24 saat boyunca çalıştırın.</li>
	<li>Membran alın, TBST 'de% 5 BSA 'da 1 h için blok yapın ve 4 °C ' de gece TBST 'de% 5 BSA 'da hazırlanan primer antikor çözeltisi içinde inküye yapın. Not: bkz. Tablo 8 antikorlar için kullanılır.</li>
	<li>Her biri 10 dakika boyunca TBST 3x 'de membran durulayın.</li>
	<li>TBST 'de% 5 BSA 'da oda sıcaklığında 2 saat boyunca hazırlanan ikincil antikor çözeltileri içinde membranlara inküye yapın.</li>
	<li>Her biri 10 dakika boyunca TBST 3x 'de membran durulayın.</li>
	<li>Membranlar ve görüntü için kemiluminesans çözüm ekleyin.</li>
</ol>5. analiz
<ol><li>In-jel aktivite assay görüntüleri veya immünoblots SCs analiz etmek için kullanılabilir. Bantların bileşimi çözümlemek için çoğaltır hizalayın ve hangi karmaşık her verilen bant için olumlu tepki doğrular.</li>
	<li>Kompleksleri, çeşitli Supramoleküler Montajlarda, ımagej 'de açık görüntüleri analiz etmek ve jel analiz aracını kullanmak için (örneğin Şekil 5 ' e bakın).<ol>
<li>Dikdörtgen aracıyla şeritleri seçin ve şerit çizin.</li>
		<li>İlgi her bandın eğrisi altında alanı kapatmak için çizgiler çizin ve eğri değerleri altında alanı içeren bir tablo oluşturmak için Değnek aracı ile her alanı tıklayın.</li>
		<li>Karmaşık dağılımı hesaplamak için her bant için değerleri monomer göreli olarak rapor.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+Chain+Supercomplexes.">Respiratory Chain Supercomplexes.</a> IUBMB Life. 52 (3-5), 119-128 (2001).</li><li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes.">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li><li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Respiratory+Chain+Supercomplex+Formation+in+Response+to+Exercise+in+Human+Skeletal+Muscle.">Enhanced Respiratory Chain Supercomplex Formation in Response to Exercise in Human Skeletal Muscle.</a> Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).</li><li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ratio+of+oxidative+phosphorylation+complexes+I-V+in+bovine+heart+mitochondria+and+the+composition+of+respiratory+chain+supercomplexes.">The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (41), 37861-37867 (2001).</li><li>Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Enigma+of+the+Respiratory+Chain+Supercomplex.">The Enigma of the Respiratory Chain Supercomplex.</a> Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).</li><li>Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+the+respiratory+supercomplexes:+the+plasticity+model.">The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).</li><li>Vartak, R., Porras, C. A., Bai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+supercomplexes:+structure,+function+and+assembly.">Respiratory supercomplexes: structure, function and assembly.</a> Protein Cell. 4 (8), 582-590 (2013).</li><li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplex+Assembly+Determines+Electron+Flux+in+the+Mitochondrial+Electron+Transport+Chain.">Supercomplex Assembly Determines Electron Flux in the Mitochondrial Electron Transport Chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li><li>Lazarou, M., Smith, S. M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T., McKenzie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+nuclear+DNA-encoded+subunits+into+mitochondrial+complex+IV,+and+their+preferential+integration+into+supercomplex+forms+in+patient+mitochondria.">Assembly of nuclear DNA-encoded subunits into mitochondrial complex IV, and their preferential integration into supercomplex forms in patient mitochondria.</a> The FEBS Journal. 276 (22), 6701-6713 (2009).</li><li>Sun, D., Li, B., Qiu, R., Fang, H., Lyu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Type-Specific+Modulation+of+Respiratory+Chain+Supercomplex+Organization.">Cell Type-Specific Modulation of Respiratory Chain Supercomplex Organization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (6), (2016).</li><li>D'Aurelio, M., Gajewski, C. D., Lenaz, G., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+chain+supercomplexes+set+the+threshold+for+respiration+defects+in+human+mtDNA+mutant+cybrids.">Respiratory chain supercomplexes set the threshold for respiration defects in human mtDNA mutant cybrids.</a> Human Molecular Genetics. 15 (13), 2157-2169 (2006).</li><li>Antoun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+and+supercomplex+assembly+in+rectus+abdominis+muscle+of+diabetic+obese+individuals.">Impaired mitochondrial oxidative phosphorylation and supercomplex assembly in rectus abdominis muscle of diabetic obese individuals.</a> Diabetologia. 58 (12), 2861-2866 (2015).</li><li>Kanaan, G. N., Patten, D. A., Redpath, C. J., Harper, M. -. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrial+Fibrillation+Is+Associated+With+Impaired+Atrial+Mitochondrial+Energetics+and+Supercomplex+Formation+in+Adults+With+Type+2+Diabetes.">Atrial Fibrillation Is Associated With Impaired Atrial Mitochondrial Energetics and Supercomplex Formation in Adults With Type 2 Diabetes.</a> Canadian Journal of Diabetes. , (2018).</li><li>Kuter, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+within+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+supercomplexes+and+membrane+viscosity+during+degeneration+of+dopaminergic+neurons+in+an+animal+model+of+early+Parkinson's+disease.">Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).</li><li>McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Respiratory+Chain+Supercomplexes+Are+Destabilized+in+Barth+Syndrome+Patients.">Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Are Destabilized in Barth Syndrome Patients.</a> Journal of Molecular Biology. 361 (3), 462-469 (2006).</li><li>Rosca, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+mitochondria+in+heart+failure:+decrease+in+respirasomes+and+oxidative+phosphorylation.">Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation.</a> Cardiovascular Research. 80 (1), 30-39 (2008).</li><li>Jang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+Mitochondrial+Electron+Transport+Chain+Supercomplexes+in+the+Heart+During+Ischemia-Reperfusion.">Elucidating Mitochondrial Electron Transport Chain Supercomplexes in the Heart During Ischemia-Reperfusion.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 27 (1), 57-69 (2017).</li><li>Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ageing+alters+the+supramolecular+architecture+of+OxPhos+complexes+in+rat+brain+cortex.">Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex.</a> Experimental Gerontology. 45 (7), 563-572 (2010).</li><li>Krause, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions+in+organellar+and+prokaryotic+proteomes+by+native+gel+electrophoresis:+(Membrane)+protein+complexes+and+supercomplexes.">Detection and analysis of protein-protein interactions in organellar and prokaryotic proteomes by native gel electrophoresis: (Membrane) protein complexes and supercomplexes.</a> Electrophoresis. 27 (13), 2759-2781 (2006).</li><li>Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Resolution+Clear+Native+Electrophoresis+for+In-gel+Functional+Assays+and+Fluorescence+Studies+of+Membrane+Protein+Complexes.">High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes.</a> Molecular Cell Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).</li><li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+PAGE.">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li><li>Jang, S., Javadov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Challenges+in+Elucidating+Respiratory+Supercomplexes+in+Mitochondria:+Methodological+Obstacles.">Current Challenges in Elucidating Respiratory Supercomplexes in Mitochondria: Methodological Obstacles.</a> Frontiers in Physiology. 9, 238-238 (2018).</li><li>Cuillerier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+hepatic+LRPPRC+alters+mitochondrial+bioenergetics,+regulation+of+permeability+transition+and+trans-membrane+ROS+diffusion.">Loss of hepatic LRPPRC alters mitochondrial bioenergetics, regulation of permeability transition and trans-membrane ROS diffusion.</a> Human Molecular Genetics. 26 (16), 3186-3201 (2017).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. 80, 3-44 (2007).</li><li>Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria-associated+membranes+and+mitochondria+from+animal+tissues+and+cells.">Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells.</a> Nature Protocols. 4, 1582 (2009).</li><li>Wittig, I., Sch&#228;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+limitations+of+clear-native+PAGE.">Advantages and limitations of clear-native PAGE.</a> PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).</li><li>Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Mitochondrial+Respiratory+Chain+Supercomplexes+Using+Blue+Native+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis+(BN-PAGE).">Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE).</a> Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).</li><li>Beutner, G., Porter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Supercomplexes+of+the+Mitochondrial+Electron+Transport+Chain+with+Native+Electrophoresis,+In-gel+Assays,+and+Electroelution.">Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55738 (2017).</li><li>Von Hagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proteomics Sample Preperation. , 485 (2008).</li><li>Couoh-Cardel, S. J., Uribe-Carvajal, S., Wilkens, S., Garc&#237;a-Trejo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+dimeric+F1F0-ATP+synthase.">Structure of dimeric F1F0-ATP synthase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36447-36455 (2010).</li><li>Strauss, M., Hofhaus, G., Schr&#246;der, R. R., K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimer+ribbons+of+ATP+synthase+shape+the+inner+mitochondrial+membrane.">Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane.</a> The EMBO Journal. 27 (7), 1154-1160 (2008).</li><li>Sch&#228;gger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria.">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> The EMBO Journal. 19 (8), 1777-1783 (2000).</li><li>Wittig, I., Sch&#228;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organization+of+mitochondrial+ATP+synthase.">Structural organization of mitochondrial ATP synthase.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1777 (7), 592-598 (2008).</li><li>Giorgio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimers+of+mitochondrial+ATP+synthase+form+the+permeability+transition+pore.">Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Stated of America. 110 (15), 5887 (2013).</li></ol>

Mitokondrial süperkompleksleri, fizyolojik rollerini ve birçok insan hastalığının patogenezindeki önemini, elde edildikleri veya genetik mitokondriyal hastalıklar için aktif olarak incelenmektedir3,7 , 9 , 10 ' dan fazla , 11 ' i , 12 tane , 13 ' ü , 14. güvenilir sonuçlar elde etmek için, çeşitli yönleri dikkate alınmalıdır. Bu protokol, fare karaciğer mitokondri ile test edilmiştir, fare iskelet kas mitokondri (sonuçlar gösterilmez), sıçan kalp mitokondri, ve insan fibroblast mitokondri (sonuçlar gösterilmez), ama kesinlikle diğer kaynaklara adapte edilebilir izole Mitokondri. Yöntem en iyi şekilde bir araya getiren bn ve CN-Page protokollerinin çeşitli yönlerini birleştirir, hangi deterjanlar ve anyonik bileşiklere maruz kalma azaltmak için izin yayımlanan protokollere kıyasla en az20,27,28.
Numune hazırlama
Numune hazırlama, SCs 'nin başarılı bir şekilde ayrılması için önemli bir adımı temsil eder. tampon bileşimi dikkatle proteinleri ve proteinler meclislerinin uygun çözünme elde etmek için seçilmiş olmalıdır, mümkün olduğu kadar koruyarak onların işlevsel ve yapısal bütünlük. İyonik mukavemet ve pH ekstraksiyon tamponu dikkate alınması gereken iki önemli faktördür. Çok düşük tuz konsantrasyonları (< 50 mM K-asetat veya NaCl) olmayan iyonik deterjanlar varlığında proteinlerin kötü çözünme neden olur, 500 mM yukarıda tuz konsantrasyonları protein istifleme/toplama teşvik edecek, ve CB ve yağış protein29. Bu nedenle SCs yakın fizyolojik iyonik mukavemet arabellekleri kullanılarak ayıklanmalıdır. PH açısından, yakın fizyolojik pH kullanımı önerilir.
Deterjan tipi ve deterjan/protein oranı da optimum SC ekstraksiyon için önemlidir. Yerli SCs 'nin maksimal korunması için digitonin tercih edilir26. Mevcut protokol ve diğer yayımlanan yöntemlerde gösterildiği gibi23,30,31,32, bu hafif deterjan, birden fazla SC montajının Supramoleküler bileşimi korur ve dimerik ve ATPsynthase Oligomerik yapısı (Şekil 3 ve Şekil 4). Çeşitli miktarlarda digitonin ile ilgili numunelerin titrasyonu, optimum çözünme sağlayan koşulları belirlemek için, enzim aktivitesini ve fizyolojik protein etkileşimlerini korurken önemlidir. Titrasyon 2 ile 8 g/g26arasında değişen oranlarla yapılmalıdır. Karaciğer, iskelet kası ve kardiyak mitokondri için optimum sonuçlar sırasıyla 4, 5 ve 6 g digitonin/g proteini ile elde edilir. Digitonin 'in, en uygun koşullarda digitonin2ile gözlenen benzer göç ve SC bileşimine neden olan triton X-100 tarafından değiştirileceği belirtilmelidir. Ancak bu deterjan, deterjan/protein oranındaki nispeten küçük bir artış (örn. 1 ' den 1,5 g/g 'ye kadar), SCs montajlarının tam bir dağılmasına neden olabilir, bu da deneysel tutarsızlıklaraneden olabilir. Ekstraksiyon sonra, örnekler geleneksel CN-sayfa20,26dışında, jel uygulandığında proteinleri bir ücret vermek için Coomassie mavi ile geleneksel olarak desteklenmektedir. Coomassie mavi ve potansiyel ayrışma labil proteinlerin protein maruz en aza indirmek için, numuneler Bu protokolde Coomassie mavi ile tamamlayıcı değildir.
Elektroforez
Hem CN-PAGE ve BN-PAGE mitokondriyal OXPHOS kompleksleri, her biri farklı avantajları ve sınırlamaları olan çalışma için kullanılmıştır. CN-Page (özellikle deterjan benzeri bir etkiye sahip olan CB 'nin yokluğunda) altında kullanılan daha hafif koşullar, ATP sentaz in-jel aktivitesinin daha iyi korunmasını sağlar ve yüksek molekül ağırlığı SCs ve ATP sentaz 'de labil proteinlerinin dağılmasına sınır verir Montaj26. Ancak, protein ekstresi ve Elektroforez tamponları anyonik boya CB yokluğunda proteinlerin kendi içsel şarj ve izoelektrik noktasına dayalı göç neden, jel içinde proteinlerin elektroforetik hareketlilik azaltır26. Dahası, CB yokluğunda, yetersiz negatif şarj proteinleri toplama eğilimindedir, böylece jel protein kompleksleri çözünürlüğünü azaltarak20,26. Bu sınırlamaları aşmak için, sözde yüksek çözünürlüklü CN-PAGE Wittig ve Schragger20tarafından geliştirilmiştir. Bu protokolde, sodyum deoksikolatın (doc) ve çeşitli hafif olmayan iyonik deterjanlar (DDM, Triton X100), membran proteinlerini çözünten tutmak için katot tamponunu eklenir ve proteinlere negatif bir şarj değişimi uygulayabilir, bu da önemli bir iyileşme elde edilir çözünürlüğü20.
Mevcut hibrit CN/BN protokolünün ayırt edici özelliği, bu deterjanlar olmadan karşılaştırılabilir bir çözünürlüğe ulaşılabilmektedir. Elektroforezinin başlangıcında CB 'nin katot tamponunun anlık olarak eklenmesi, protein toplamayı sınırlamak ve jel içinde hareketlilik geliştirmek için yeterlidir (Şekil 3 ve Şekil 4). Sonuç olarak, bu hibrid tekniği, farklı SC montajlarının mükemmel çözünürlüğünü ve çok düşük veya deterjanlara maruz kalmasını sağlar. CB düşük miktarlarda varlığı da CV aktivitesinin daha iyi korunması, dimerik ve Oligomerik CV meclisleri (Şekil 3 ve Wittig ve Schägger 200526) geliştirilmiş korunması ve mavi arka plan gürültüsünün azaltılması sağlar olabilir Özellikle CII ve CıV (Şekil 2) için jel faaliyetlerinin ölçülmesini engelleyebilir. Dahası, protein ekstresi içinde CB yokluğunda SCs içinde labil protein etkileşimlerin bozulması sınırlar. Örneğin, Ant ile ATP sentaz fiziksel Association synthasome 33 veya PTP açılış 34 düzenlemek için cyclophilin-D ile oluşturmak için daha iyi CB yokluğunda görülür. Elektroforez sırasında CB 'ye anlık maruz kalma sadece bu nedenle SCs içinde yeni protein etkileşimlerini ortaya çıkarmak için yararlı olabilir. genel olarak, bu hibrit CN/BN-PAGE protokolü, böylece hassas ve hızlı jel aktivite ölçümlerinde analitik ile birleştirmek için izin verir , SCs gelişmiş analizi için 2D Elektroforez, immüno-algılama ve/veya proteomik içeren teknikler. Bu SCs için büyüyen ilgi ile, çalışmalar artan sayıda yerel sayfa için küçük 10 x 10 cm jelleri kullanmak unutulmamalıdır. Bu yaklaşım bolluk SC montajlarında brüt değişiklikleri belirlemek için yeterli olabilir, ancak küçük jellerin düşük ayırma kapasitesi büyük olasılıkla ince yeniden düzenlemeleri çözmek veya proteomik analiz için farklı bantları kesmek için sınırlıdır. Dahası, daha küçük jelleri kullanarak çeşitli çalışmalar respirasome ATPsynthase dimer aynı boyutta göç olduğunu bildirdi, zor onları ayırmak için yapım22. Bu nedenle, büyük jeller kullanımı tercih edilmelidir.

Mitokondri Oksidatif fosforilasyon ile enerji üretmek, nerede solunum kompleksler ı-II-III-IV oksitler substratlar ve oksijen transfer elektronlar, ATP sentaz (CV) tarafından ADP fosforilasyon sağlayan bir gradyan üreten. Geçtiğimiz yıllarda, yoğun çalışmalar solunum zinciri kompleksleri sadece iç mitokondriyal membranın doğrusal bir şekilde dahil olmadığını göstermiştir, ancak aynı zamanda süperkompleksleri (SCs) düzenlemeleri1,2içine düzenlenir. Mammalin mitokondri olarak, SCs farklı stoichiometries var: CI/cııı2/civ1-4 (hangi RESPIRASOME adlı ve NADH yeteneğine sahiptir: O2 oxidoreduction ın VITRO)2, CI/cıii2, ve ciii2 /Civ1-23,4. Ayrıca, solunum kompleksler serbest form ve SCs düzenlemeleri arasında farklı oranlarda dağıtılır. Bu nedenle, bu tahmin edilmektedir 85%-100% CI, 55% – 65% cııı, ve 15%-25% CıV SCs bulunur4. Bu Supramoleküler yapıları ROS üretimini azaltmak için düşünülmesi, stabilize veya bireysel kompleksleri montaj yardımcı, solunum zinciri etkinliğini düzenleyen, ve protein zengin iç mitokondriyal membran protein toplama önlemek5 ,6,7,8. Çeşitli laboratuvarlarda enerji talep ve hastalıkların patogenezinde önemini varyasyon üzerine yeniden modelleme yeteneği araştırılıyor3,7,9,10, 11 ' i , 12 tane , 13 ' ü , 14. araştırmalar, SCs montajında patolojik değişikliklerin, kardiyolipin sentezi15' te genetik kusur, kalp yetmezliği16, dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çeşitli bozukluklarda mevcut olduğunu göstermiştir. iskemi-reperfüzyon17, diyabet12, ve yaşlanma18.
Yerli Elektroforez ve immünozansiyonun yaygın olarak kullanıldığı SCs çalışmalarda oxphos kompleksler dörernary düzenlemeleri çözmek için2,19,20,21. Yerli Elektroforez daha da özel ile kombine edilebilir jel aktivite deneyleri veya 2D-SDS çeşitli SCs montajları hassas moleküler belirlenmesi sağlamak için sayfa1,19. SCs çalışma yeteneği, ekstraksiyon koşullarına, kullanılan deterjan türü ve konsantrasyonu, iyonik mukavemet ve pH yanı sıra tampon bileşimi, CB varlığı, jel içeren elektroforetik göç koşullarında da dahil olmak üzere kritik olarak bağımlıdır. boyutu ve akrilamid yüzdesi2.
Protokoller ve SCs bant çözünürlüğü büyük ölçüde kağıt arasında farklılık gösterir, çalışmalar arasında karşılaştırma yapmak zor ve zorlu yöntemlerin adaptasyon22. Bu nedenle, bu yazıda Non-İyonik deterjan digitonin ile farklı kaynakların izole mitokondri gelen SCs ayıklamak için sağlam ve optimum protokol öneriyor, ve yüksek moleküler ağırlık SCs bantları çözmek için. Optimize edilmiş deterjan konsantrasyonu, ekstraksiyon tamponunun bileşimi ve numune preparasyonunda Coomassie Blue olmaması protein kompleksleri bozulması en aza indirmektir. Bu protokol (bkz. Şekil 1 ' e genel bakış için), CN-Page ve bn-Page ' i büyük jel üzerinde optimum SCs montajları çözünürlüğü ile birleştirir ve in-jel etkinliğiyle uyumludur, reaktif bantların daha iyi görselleştirilmesini sağlayan ayrıntılı bir analiz SCs düzenlemeleri ve bileşimi için bağışıklık algılama.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-amino caproic acid</td>
			<td>sigma</td>
			<td>A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>sigma</td>
			<td>A3377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14730</td>
			<td>Lot number GR3174539-12, RRID AB_301438</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SDHA antibody [2E3GC12FB2AE2]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14715</td>
			<td>Lot number GR3235943-1, RRID AB_301433</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-UQCRC2 antibody [13G12AF12BB11]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14745</td>
			<td>Lot number GR304308-3, RRID AB_2213640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis N,N&#39;-Methylene-Bis-Acrylamide</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue G</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COX4 Monoclonal Antibody (1D6E1A8)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>459600</td>
			<td>Lot number TI2637158, RRID AB_2532240</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c from equine heart</td>
			<td>sigma</td>
			<td>C7752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand FH100M Multichannel Peristaltic Pumps</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13-310-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inner Glass Plates. Pkg of 2, 20 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with outer plate</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1651823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 485 Gradient Former. 40-175 ml acrylamide gradient former, includes valve stem and tubing kit, for use with Mini-PROTEAN multi-casting chamber systems</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1654120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDUFA9 Monoclonal Antibody (20C11B11B11)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>459100</td>
			<td>Lot number TD2536591, RRID AB_2532223</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrotetrazolium Blue chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outer Glass Plates. Pkg of 2, 22.3 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with inner plate</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1651824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl floride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerpack 1000</td>
			<td>Biorad</td>
			<td colspan="2">Serial Number 286BR 07171</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROTEAN II Sandwich Clamps. Pkg of 2, clamps for running gels, for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell, 1 left and 1 right</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1651902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROTEAN II xi Cell. Large format vertical electrophoresis cell, 16 x 20 cm gel size, 4 gel capacity, spacers and combs</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1651811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROTEAN II xi Comb. Pkg of 1, 15-well, 1.5 mm, comb for PROTEAN II xi electrophoresis cell</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1651873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROTEAN II xi Multi-Gel Casting Chamber. Multi-gel casting chamber, 20 x 20 cm gel size, for up to ten 1.5 mm thick gels, includes sealing plate, gasket, separation sheets, acrylic blocks, PROTEAN II XL alignment cards</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1652025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROTEAN II xi Spacers. Pkg of 4, 1.5 mm, spacers for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1651849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCIENCEWARE Utility Bags (10 x 12&#34;) 4 mil, Bel-Art, Box of 100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>11215-388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick Blot Paper. Pkg of 25 sheets, 15 x 20 cm, absorbent filter paper, for use with Trans-Blot cassette</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1703956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Cell With Plate Electrodes and Super Cooling Coil. Transfer cell and cooling coil (#170-3912), includes 2 gel holder cassettes, buffer tank, lid with cables, fiber pads, 1 pack blot paper</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1703939</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hybrid clear/blue native electrophoresis for the separation and analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes

Oksidatif fosforilasyon makinelerinin kompleksleri, mitokondri için yapısal ve fonksiyonel avantajları yerine getireceği inanılan süperkompleks (SCs) adlı Supramoleküler protein düzenlemelerini oluşturmaktadır. SCs, mayadan memeliye kadar pek çok tür içinde tespit edilmiş ve artan sayıda çalışmada genetik ve elde edilen insan hastalıklarında örgütlerinin bozulması rapor edilmiştir. Sonuç olarak, laboratuarları artan sayıda, metodolojik olarak zor olabilir SCs analiz ilgilendi. Bu makalede, bir zaman etkin şekilde SCs çözümlemek ve çözümlemek için mavi ve Clear yerel PAGE yöntemlerinin avantajlarını birleştiren en iyi duruma getirilmiş bir protokol sunar. Bu hibrid CN/BN-PAGE yöntemi ile, hafif deterjan digitoninin optimum miktarlarda ayıklanan mitokondriyal SCs, diğer deterjanlara maruz kalmadan, Elektroforez başında anyonik boya Coomassie Blue (CB) kısaca maruz kalır. Bu kısa CB 'ye maruz kalma, SCS 'de yüksek CB düzeylerinin negatif etkisini kaçınarak ve SCS içindeki labil protein-protein etkileşimleri ile geleneksel bn-Page metotları gibi etkin bir şekilde ayrı ve çözülmesine olanak sağlar. Bu protokol ile, bu nedenle, tam ve hızlı jel aktivite ölçümlerini 2B Elektroforez, immüno-algılama ve/veya yüksek SCs analizi için proteomik içeren analitik tekniklerle birleştirmek mümkündür.

Şekil 2 , SCs 'nin çıkarılması için gerekli olan digitonin uygun miktarını belirlemeye yönelik digitonin titrasyon denemenin sonuçlarını gösterir. Bu tutar doku/hücre tipine ve numunenin dondurulmuş olup olmadığına bağlı olarak farklılık gösterecektir. Bu deney için, yeni fare karaciğer mitokondri izole SCs görselleştirme için bir CıV-jel aktivite gerçekleştirildi. 2/1 ila 10/1 g digitonin/g protein oranları test edildi. Bu örnek için digitonin en uygun miktarı 4 g/g, monomerik CıV iyi bir çözünürlük sağlar, ve yüksek moleküler ağırlık SCs. Daha düşük bir oranda, bantları açık değildir ve Elektroforez sırasında smear içine çözmek, digitonin daha yüksek oranda kullanımı yüksek moleküler ağırlık SC bozulması yol açar.
Şekil 3 ve Şekil 4 , 4 g digitonin/g protein ile çıkarılan fare karaciğer mitokondri hazırlanması üzerinde gerçekleştirilen tam bir deney sonuçlarını göster. Proteinler hibrid BN/CN-PAGE, standart BN-PAGE veya CN-PAGE kullanılarak ayrılır. Her üç jelin de aynı anda kazılmış ve şeritleri aynı numune çoğaltır ile yüklendi. Elektroforez aşağıdaki, bireysel şeritleri kesilmiş ve jel aktivite ölçümü için işlenmiş (CI, CII, CıV ve CV Şekil 3) ve İmmünoblotting (CI, CII, cııı, CIV, Şekil 4CV).
(Örneğin, hibrid CN/BN-PAGE) veya numune ve Elektroforez boyunca katot tampon (yani BN-PAGE), önemli ölçüde hareketlilik ve SC bantları çözünürlüğü geliştirir ve bireysel solunum kompleksler (örn ile karşılaştırıldığında CN-PAGE (Şekil 3). Gruplar kolayca hibrit tekniği veya BN-PAGE ile CıV için jel etkinliğinden sonra ayırt edilir, aynı örnekte CN-PAGE, SCs ve monomerik CıV reaktif bantları tarafından çözülmüş ise tespit edilemez.
Şekil 3 ve ŞEKIL 4 , oxphos monomerlerin ve Supramoleküler montajların çözünürlüğü ve bantlama DESENININ, hibrit CN/BN-PAGE ve bn-Page arasında niteliksel olarak karşılaştırılabilir olduğunu gösterir. Ancak, önemli farklar var. İlk olarak, OXPHOS kompleksinlerin elektroforetik hareketliliği, protein hibrid CN/BN-PAGE koşulları vs standart bn-Page kullanılarak ayrıldığı zaman biraz azalır, çünkü CB 'nin azaltılmış miktarı. Bu hareketlilik vardiya CıV monomerler için daha büyüktür, CV monomerleri tarafından takip, ve CI (Şekil 3 ve Şekil 4). İkincisi, mavi arka plan hibrid CN/BN-PAGE BN-PAGE (Şekil 3, sol şeritleri) ile karşılaştırıldığında daha düşüktür. Sonuç olarak, Bn-Page aşağıdaki yüksek arka plan seviyeleri tamamen CII için jel aktivite Boyama Maskeler ve CIV dimerleri aktivitesi ile ilişkili arka plan gürültüsünü geliştirir (Şekil 3). Üçüncü olarak, CV 'nin etkinliği, CV katalizör aktivitesine müdahale ettiği bilinen CB 'nin azaltılmış miktarı nedeniyle, numune hibrid CN/BN-PAGE koşullarında BN-PAGE (Şekil 3) ' e kıyasla çalıştırıldığında daha yüksektir. 26 CN/bn-Page Ayrıca CV Supramoleküler montajların daha iyi korunmasını sağlar, CV dimerleri ile ilişkili toplam CV aktivitesinin daha büyük bir oranı ile gösterildiği gibi (Şekil 3). Dahası, CV oligomerler CN/bn-Page altında görülebilir, onlar bn-Page koşulları altında tamamen Disosiye iken. İlginçtir, CV aktivite görüntüleyen ayrı bantları da CV monomerler ve dimers arasında gözlenen, örnekleri CN/BN-PAGE altında çalıştırıldığında (Şekil 2).
Şekil 5 , Supramoleküler montajlarda OXPHOS kompleks dağıtımının temsili bir analizini gösterir. Görüntü, 4 farklı sağlıklı fare karaciğer mitokondri preparatından elde edilen numunelerin jel aktivitesinde CI gösterir. Densitometri analizi, CI-reaktif bantları eğrisi altında alanı ölçmek ve monomerik (i1) ve Supramoleküler formları C1 aktivite göreli dağılımı sunmak için izin verir (ı1III2, ı1III2IV 1, ı1III2IVn). Benzer analiz immünoblot aşağıdaki gerçekleştirilebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59294/59294fig1.jpg"> Şekil 1: tahlil iş akışı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59294/59294fig1large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59294/59294fig2.jpg"> Şekil 2: Digitonin titrasyon taze fare karaciğer mitokondri gelen süperkompleksleri ayıklamak için. Bu örnek, solunum süper kompleksleri ayıklamak için digitonin artan miktarlarda tedavi edilen bir hayvandan izole fare karaciğer mitokondri plakaya gösterir. Örnekler daha sonra hibrid CN/BN PAGE ile çözüldü ve CıV-jel aktivitesi belirlendi. CıV1: kompleks IV monomerler; CıV2: kompleks IV dimers; SC: süperkompleksleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59294/59294fig2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59294/59294fig3.jpg"> Şekil 3: HIBRID CN/bn-Page, Bn-Page veya CN-Page aşağıdaki OXPHOS kompleksler içinde-jel aktivitesi. Bir fareyle izole edilen karaciğer mitokondri solunum süper kompleksleri ayıklamak için digitonin (4 g/g oranı digotonin/protein) ile tedavi edildi. Bu numunenin aliquots daha sonra üç farklı jelleri birden fazla kuyuları yüklendi ve CN/BN-PAGE, BN-PAGE veya CN-PAGE sundu. Her bir jel içinde çoğaltılan her şerit daha sonra kesilmiş ve hemen içinde-jel aktivite deneyleri için kullanılan (etiketli CI, CII, CIV ve CV). Bir şerit, Coomassie Blue ile arka plan (BG etiketli) boyama göstermek için kontrol olarak kullanılmıştır. OXPHOS kompleksler ve Supramoleküler montajlar, her OXPHOS kompleksinin moleküler stoichiometrisi gösteren indekslerde sayılar ile standart terminolojinin kullanılarak tanımlanır. Cııı içeren Supramoleküler montajların pozisyonunun, bu özel deneyde CıII için jel aktivitesinin gerçekleştirildiği için immünozizatörlere dayalı olduğu unutulmamalıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59294/59294fig3large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59294/59294fig4.jpg"> Şekil 4: HIBRID CN/bn-Page veya bn-Page aşağıdaki OXPHOS kompleksler Immünoblot analizi. Şekil 3 ' te açıklanan deneylerden çoğaltır, tek bir membran elektro-transfer edildi. Transferden sonra, bireysel şeritleri kesilmiş ve CI, CII, cııı, CıV, ve CV tanıyan spesifik antikorlar ile inkübe edildi. OXPHOS kompleksler ve Supramoleküler montajlar, standart terminolojinin kullanıldığı Her OXPHOS kompleksi moleküler stoichiometri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59294/59294fig4large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59294/59294fig5.jpg"> Şekil 5: monomerik ve Supramoleküler montajlarda CI dağılımının ölçülmesini. (A) CI in-jel faaliyet belırlenen hibrid CN/bn-sayfa karaciğer MITOKONDRI SC özleri 4 fareler elde. (B) CI monomerlerin (i1) ve çeşitli CI içeren Supramoleküler kompleksleri (ı 1 III2, ı 1 III2IV1) karşılık gelen farklı zirveler gösteren ımagej jel Analiz Aracı kullanılarak elde edilen densitogram ve ben1III2IVn). (C) C1 aktivitesinin göreli dağılımının ölçülmesini. Veri ortalama ve SEM 4 fareler temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59294/59294fig5large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Digitonin/protein oranı (g/g)</td>
			<td>2 g/g</td>
			<td>4 g/g</td>
			<td>6 g/g</td>
			<td>8 g/g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ekstraksiyon tampon hacmi (μL)</td>
			<td>400</td>
			<td>300</td>
			<td>200</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>% 10 stok digitonin (μL) hacmi</td>
			<td>100</td>
			<td>200</td>
			<td>300</td>
			<td>400</td>
		</tr>
<tr>
<td>Toplam çıkarma arabelleği hacmi (μL)</td>
			<td>500</td>
			<td>500</td>
			<td>500</td>
			<td>500</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: çeşitli digitonin/protein oranları kullanılarak 5 mg mitokondriyal proteinlerden SCs çıkarmak için gerekli birimler.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Bileşik</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA, pH 7,5</td>
			<td>1 mM 'Lik</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>30 mM 'Lik</td>
		</tr>
<tr>
<td>Potasyum asetat</td>
			<td>150 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gliserol</td>
			<td>12</td>
		</tr>
<tr>
<td>6-aminocaproik asit</td>
			<td>2 mM 'Lik</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: SC ekstraksiyon arabelleği (son konsantrasyonlar). En fazla 3 ay boyunca 4 °C ' de tutun.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Bileşik</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
3x jel tampon: Aliquot ve tutmak-20 °c, pH 7,5
</td>
		</tr>
<tr>
<td>İmidazol/HCl pH-7,0</td>
			<td>75 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>6-aminocaproik asit</td>
			<td>1,5 M</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
Akrilamid tampon: Aliquot ve tutmak-20 °c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Akrilamid</td>
			<td>99,5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>BIS-akrilamid</td>
			<td>3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3: jel stok tamponları.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>2 jeller için:</td>
			<td>% 4 (60 mL)</td>
			<td>% 12 (60 mL)</td>
			<td>İstifleme (% 4) (25 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>3X jel tampon</td>
			<td>19,8 mL</td>
			<td>19,8 mL</td>
			<td>8,25 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Akrilamid tampon</td>
			<td>4,8 mL</td>
			<td>14,4 mL</td>
			<td>2 mL 'Lik</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>35 mL</td>
			<td>13,1 mL</td>
			<td>14,6 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gliserol</td>
			<td>-</td>
			<td>12 mL 'Lik</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>APS 10%</td>
			<td>360 (μL)</td>
			<td>60 (μL)</td>
			<td>150 (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>TEMED</td>
			<td>24 μL</td>
			<td>12 μL</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 4:% 4 –% 12 gradyan jeli.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Bileşik</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Anot tamponu: 4 °C ' de tutun, pH 7,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>İmidazol</td>
			<td>25mm</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Katot tamponu: 4 °C ' de tutun, pH 7,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tricine</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>İmidazol</td>
			<td>7,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Coomassie mavi (G250) ile veya olmadan</td>
			<td>0,022%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 5: Elektroforez tamponları.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Bileşik</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Kompleks ı aktivite tampon: 5 mM TRIS-HCl pH 7,4 taze hazırlayın</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nitrotetrazolyum mavisi</td>
			<td>3 mM 'Lik</td>
		</tr>
<tr>
<td>NADH</td>
			<td>14 mM 'Lik</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Kompleks II aktivite tampon: 5 mM TRIS-HCl pH 7,4 taze hazırlayın</td>
		</tr>
<tr>
<td>Süksinat</td>
			<td>20 mM 'Lik</td>
		</tr>
<tr>
<td>PMSF</td>
			<td>0,2 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nitrotetrazolyum mavisi</td>
			<td>3 mM 'Lik</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Kompleks IV aktivite tampon: hazırlamak taze 50 mM na-fosfat pH 7,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sitokrom C</td>
			<td>0,05 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Diaminobenzidin</td>
			<td>2,3 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">ATPsynthase etkinlik tampon: su taze hazırlamak, Ko ile 8 pH ayarlamak</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycine</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>5 mM 'Lik</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>30 mM 'Lik</td>
		</tr>
<tr>
<td>Atp</td>
			<td>5 mM 'Lik</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 6: ın-jel aktivite assay tamponlar.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Bileşik</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Aktarım arabelleği</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris üssü</td>
			<td>25mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycine</td>
			<td>192 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>SDS</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Metan -ol</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">(TBST adresinde)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris üssü</td>
			<td>20 mM 'Lik</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>137 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ara 20</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 7: Immünoblotting tamponları.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Karmaşık</td>
			<td>Altbirim</td>
			<td>Klon</td>
		</tr>
<tr>
<td>ı</td>
			<td>NDUFA9</td>
			<td>20C11B11B11</td>
		</tr>
<tr>
<td>ıı</td>
			<td>MEHMET mehmet</td>
			<td>2E3GC12FB2AE2</td>
		</tr>
<tr>
<td>ııı</td>
			<td>UQCRC2</td>
			<td>13G12AF12BB11</td>
		</tr>
<tr>
<td>ıv</td>
			<td>COX4</td>
			<td>1D6E1A8</td>
		</tr>
<tr>
<td>V</td>
			<td>(ATPB)</td>
			<td>3D5 sunumu</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 8: solunum ZINCIRI SC algılamak için İmmünoblotting için kullanılan antikorlar. Şirketler ve lot numaraları için malzeme tablosunu görün.

Watch this Scientific Journal Video about Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes at JoVE.com

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Burada, deterjanlara ve Coomassie Blue 'ya maruz kalmayı en aza indiren mitokondrial süperkompleksleri ayıklamak, çözmek ve tanımlamak için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, çözünürlük ve enzim faaliyetlerinin korunması arasında optimum bir denge sunarken, labil protein-protein etkileşimlerini kaybetme riskini en aza indirir.

Mitokondriyal solunum zinciri Süperkompleksleri ayrımı ve analizi için hibrid Clear/mavi yerli Elektroforez

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Süper kompleksler iç-mitokondriyal membranda solunum zinciri kompleksleri tarafından oluşturulan supramoleküler derlemelerdir. Bu süper komplekslerin oluşumu, reaktif oksijen türlerinin üretiminin azalması, stabilizasyon ve bireysel solunum zinciri komplekslerinin daha etkili bir şekilde biraraya edilmesi, solunum zinciri aktivitesi düzenlemesi ve iç zarın protein açısından zengin ortamında protein toplamasının önlenmesi gibi çeşitli yapısal ve fonksiyonel avantajlar sağladığına inanılmaktadır. Süper komplekslerin montaj ve bileşimindeki değişiklikler dinamiktir ve fizyolojik adaptasyon sırasında gözlenen mitokondriyal fonksiyondaki değişikliklerin yanı sıra çeşitli genetik ve edinsel hastalıkların altında yatan değişiklikler inanılmaktadır.Bu video, süper karmaşıkları hassas ve zaman etkili bir şekilde çözmek ve analiz etmek için karma açık/mavi yerel PAGE protokolü sunar. Bu melez açık / mavi yerli PAGE yönteminin ana avantajı en iyi geleneksel mavi ve net yerli PAGE protokolleri çeşitli yönlerini birleştirir, hangi en az en az deterjanve anyonik bileşiklere maruz kalma azaltmak için izin verir yayınlanan protokoller ile karşılaştırıldığında. Süper komplekslerin optimum ayrıştırılması ve analizi büyük degrade jellerde elde edilir.Bu yordam, el ile beceri ve dikkatli yürütme gerektiren birkaç hassas adımlar içerir. Yazılı protokole görsel destek tekniğin uygulanmasını kolaylaştıracak önemli ipuçları sağlar. Prosedürü gösteren İskenderiye, benim laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi.Başlamak için, 16 bir 1.5 mililitrelik tüp içinde hayvan dokusundan izole mitokondri santrifüj, 4 santigrat derece 10 dakika için 000-kez-G. Supernatant atın ve mitokondriyal pelet yeniden askıya almak için tüp için digitonin içeren buz soğuk çıkarma tampon hesaplanan hacmi ekleyin. Tüpleri bir mini tüp rotatörüne yerleştirin ve orta dönüş hızında 4 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın.Santrifüj örnekleri 20, 400-kez-G 45 dakika 4santigrat derece insolubilize parçaları kaldırmak için. Supernatant'ı buz üzerinde yeni bir tüpe aktarın. Elektroforez aynı gün yapılmazsa, numuneleri eksi 80 derecede saklayın.Döküm odasını aç. Odaya 20 santimetre kat 22 santimetre dış cam plaka yerleştirin. Odanın yan ve köşelerine sıkıca oturttuklarından emin olmak için hizalama kartını kullanarak 1,5 mililitrelik spacer'lerden oluşan bir set yerleştirin.Jel sandviç oluşturmak için spacers üstüne bir iç cam plaka yerleştirin ve cam plaka üstüne plastik bir ayırma levha koymak. Üç jel sandviç montaj düzenleyin. Odada kalan alanı almak için gerekirse daha fazla akrilik bloklar veya cam plakalar ekleyin.Contayı conta çentikte sıkıca oturtmadan önce olukta bir parafilm şeridi yerleştirin. Tavan plakasını hazneye yerleştirin ve altı vidanın hepsini sıkın. Döküm odasını dur.Işık karıştırma odasında bir manyetik karıştırıcı ile bir karıştırma plakası üzerinde eski degrade yerleştirin. Döküm odasının borularını degrade eskisine bağlayın ve peristaltik pompanın kasetindeki tüpü sabitlayın. Degrade eski stopcock kapalı olduğundan emin olun.Dört jel atmak için, iki Erlenmeyer şişelerinde %4 ve 60 mililitre lik 60 mililitre jel çözeltihazırlayın ve iyice karıştırarak girdap layın. %4 jel çözeltisini Hafif karıştırma odasına, %12'sini degradenin ağır rezervuar odasına dökün. 350 rpm de karıştırma plakası karıştırma hızı ayarlayın.Sonra stopcock açın ve 35 rpm de pompa açın. Hafif fraksiyonun çözelti seviyesi ağır fraksiyondan daha düşük olduğunda, pompayı duraklatın ve hafif ve ağır rezervuarlar arasındaki valf sapını açın. Kesirler hacmi dengeleyin ve pompa yeniden başlatın.Hiçbir kabarcıklar sisteme girmek ve cam plakalar arasında sıkışıp olsun emin olun. Degrade jel tamamen dökülür sonra, pompa durdurmak ve jel kurutmaönlemek için her jel sandviç üzerine bir mililitre su bindirme. İki saat polimerize olsun.Erlenmeyer şişesinde 25 mililitrelik istifleme jeli hazırlayın ve iyice karıştırmak için girdap. Suyu çıkarmak için montajı hassas bir şekilde ters çevirin ve her jel sandviçe 15 kuyuttekleyin. Pour istifleme jelve iki saat polimerize sağlar.Bundan sonra, jel ve sandviç kelepçeler tarak tarak çıkarın. Kısa cam plaka aşağı bakacak şekilde, jel sandviçi soğutma çekirdeğine yerleştirin. Diğer tarafta tekrarlayın ve elektroforez tankına çekirdek yerleştirin.Elektroforez tankının iç haznesinde 300 mililitre mavi katot tampondökün. Pipet ve yükleme uçları ile kuyu başına 75 ila 175 mikrogram protein yükleyin. Soğuk odada dört santigrat derecede elektrotları güç kaynağına takın ve 150 volta çıkarın ve jeli bir buçuk saat çalıştırın, ya da numunelerin hepsi degrade jeline girene kadar.OxPHOS komplekslerinin jel içi faaliyetlerin paralel olarak belirlenmesini ve immünoblot analizini sağlamak için numunenin ayrı kuyularda çoğaltılması. Pipet ile mavi katot tampon kaldırın. Coomassie mavi ücretsiz katot tampon 300 mililitre değiştirin ve soğuk odada gecede 200 volt jel çalıştırın.Elektroforez bitmeden önce, el yazmasına göre jel içi aktivite tamponları hazırlayın ve oda sıcaklığında karanlıkta tutun. Elektroforezi durdurun ve jeli alın. Plastik torbayı bir kitap gibi açabilsin diye kesin.Şerit leri kesin ve jel şeritlerini plastik torbalara aktarın. Üç taraftan ikisini kapatmak için ısı yalıtımı kullanın. Negatif kontrol denemeleri yapılırsa, bağırsak arabelleklerine inhibitörler ekleyin.Üç deneysel örnek için, in-jel aktivite tampon 20 mililitre ekleyin. Kabarcıklar çıkarın ve plastik torbanın dördüncü tarafında mühür. Karanlıkta 37 santigrat derecede jel şeritlerini inkübedin ve her 15 dakikada bir kontrol edin.Kuluçka süresi protein ve kompleksmiktarına bağlı olarak değişir. Kuluçkadan sonra, reaksiyonu durdurmak için suda jel şeritlerini durulayın ve karmaşık V için karmaşık I, karmaşık IV veya siyah arka plan için beyaz bir arka plan üzerinde görüntü.Bu örnekiçin, taze fare karaciğer mitokondrisinden izole edilen süper kompleksleri görselleştirmek için karmaşık bir IV jel içi aktivite gerçekleştirildi. Monomerik kompleks IV ve yüksek molekül ağırlıklı süper komplekslerin iyi bir çözünürlüğü sağladığından, bu örnek için en uygun digitonin miktarı gram başına dört gramdır.Daha düşük bir oranda, bantlar açık değildir ve elektroforez sırasında bir yayma içine çözmek, digitonin yüksek oranda kullanımı yüksek molekül ağırlıklı süperkomplekslerin bozulmasına yol açar. Bir fareden izole edilen karaciğer mitokondrisi solunum süperkomplekslerini çıkarmak için en uygun miktarda digitonin ile tedavi edildi. OXPHOS komplekslerinin elektroforetik hareketliliği, proteinler melez açık/mavi yerli PAGE koşulları kullanılarak ayrıldığında, coomassie mavisinin azaltılmış miktarı nedeniyle standart yerli PAGE ile karşılaştırıldığında biraz azalır.Bu hareketlilik kayması karmaşık IV monomerler için daha büyüktür, bunu karmaşık V monomerleri takip ve karmaşık I.The mavi arka plan mavi yerel SAYFA'ya göre hibrit açık yerli/mavi yerel SAYFA'da daha düşüktür. Mavi yerli PAGE'i izleyen yüksek arka plan seviyeleri, karmaşık II için jel içi aktivite boyamayı tamamen maskeler ve karmaşık IV dimerlerin aktivitesi ile ilişkili arka plan gürültüsünü artırır. Bu protokol için, enzim aktivitesi ve fizyolojik protein etkileşimleri korurken, optimal solubilizasyona izin veren koşulları belirlemek için ilgi örneklerinin çeşitli miktarlarda digitonin ile titrasyonu çok önemlidir.Jel döküm ile ilgili tüm adım uygun numune ayırma için en uygun degrade oluşumuna titizlikle yapılmalıdır. Aşırı bakım da bu büyük ve kırılgan jellerin manipülasyon için alınmalıdır. Her zaman jel yüksek yüzdeucunu kullanarak birkaç parmak ile tutun.Bu hibrit berrak/mavi yerli PAGE yöntemi ile numuneler, elektroforezin başlangıcında diğer deterjanlara maruz kalmadan aniyonik boya Coomassie mavisine kısaca maruz kalmaktadır. Bu, süper kompleksleri geleneksel mavi yerli PAGE yöntemlerinde olduğu gibi etkili bir şekilde ayırmak ve çözmek için izin verirken, yüksek Coomassie mavi düzeylerinin in-gel aktivite tahlilleri ve süper kompleksler içindeki labile protein-protein etkileşimleri üzerindeki olumsuz etkisinden kaçınır. Bu protokol ile hassas ve hızlı jel içi aktivite ölçümlerini 2D elektroforez, immünositve/veya proteomik içeren analitik tekniklerle birleştirmek mümkündür.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Mitochondria and Energy Production

SCIENTISTS IN ACTION

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Nötr Kılcal kullanılarak monoklonal antikor izoformlannın Kapiler Elektroforez Ayırma

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Mitokondriyal Elektron Nakil Zincirinin Süper Komplekslerinin Yerli Elektroforez, In-Jel Testleri ve Elektroelüsyon ile İncelenmesi

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteomik analiz onların yerel hücresel ortamında içeriğe özel Protein kompleksleri

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

AtHIRD11 içsel bozukluğu ve bağlama kapiller Jel Elektroforez ve benzeşme kapiler Elektroforez Metal iyonları doğru Analizi

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Thylakoid membran Protein kompleksleri tarafından mavi yerli jel elektroforez Analizi

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Protein ayrımı ve karakterizasyonu için birden fazla açıyla ışık saçılma (MALS) birleştiğinde iyon Kromatografi (IEX)

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Primer ınsan hava yolu epitel hücrelerinin hava yolu yüzeyi sıvı pH 'Sı gerçek zamanlı, yarı otomatik floresan ölçümü

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Paralel Reaksiyon İzleme ile Ubiquitin Zincir Analizi

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Membran Protein-Protein Etkileşim Analizi için Yerli Hücreli Membran Nanopartiküller Sistemi

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...