Chick Chorioallantoic membran in vivo model til at vurdere Perineural invasion i hoved-og hals kræft

Denne protokol giver in vivo undersøgelse af tidlige interaktioner mellem tumorceller og nerver og studiet af molekylære veje af nerve invasion i kræft. De vigtigste fordele ved denne teknik er den korte eksperimentelle tid med potentiale til at studere perineural invasion og andre kræft fænotyper i samme eksperiment. Før du prøver denne teknik for første gang, anbefaler vi at praktisere boring kommercielle ikke-befrugtede æg og høst den dorsale rod ganglier at optimere din teknik til begge procedurer.

Demonstration af proceduren vil være Min Liu, en forskningsmedarbejder fra mit laboratorium. Begynd med at inkubere seks kommercielle patogenfrie befrugtede æg pr. forsøgsgruppe i en ægbefugtningskuvøse ved 38 grader Celsius og 54% fugtighed på den første dag efter befrugtning i otte dage med timerotation. På dag otte, rense dorsale huden af en aflivet rotte med 70% ethanol og bruge en saks til at fjerne rygsøjlen.

Adskære hals-, bryst- og lændeområderne og læg rygsøjlen i en 10 centimeters kulturskål med PBS for at holde vævsprøverne hydreret. Brug sarte ben saks, åbne thorax og halshvirveldyr knogler i ryg-og ventrale aspekter til at adskille rygsøjlen i to laterale halvdele og placere væv sektioner i en ren 10 centimeter skål med frisk PBS. Ved hjælp af scener, forsigtigt løsrive rygmarven fra vertebrale knogler til at visualisere dorsale rod ganglions.

Placering af spidsen af et par fine scefæces holdt under hver ganglion, forstå vævet og trække det fra knoglehulen, hvor det er indgivet. Umiddelbart efter høst, placere hver ganglion i DMEM kultur medium suppleret med 2% penicillin og streptomycin eller Pen-Strep og 10% føtal kvæg serum eller FBS at hjælpe med at forhindre bakteriel forurening af nervevæv. Når alle ganglier er høstet, overføre væv i en ny kultur parabol indeholder frisk DMEM kultur medium suppleret med 2% Pen-Strep plus 10% FBS og 1,2 mikrogram pr milliliter rød fluorescerende farvestof til en times inkubation i cellen kultur inkubator.

For at forberede æggene til dorsal rod ganglion graft, dæmpe lyset i en laminar flow kabinet og holde ægget med den naturligt forekommende luftsæk mod lyskilden, transilluminate hvert æg for at kontrollere for kylling levedygtighed og embryonale fase. Identificer fastgørelsen af det udviklende embryo til den chorioallantoic membran som en mørk bevægelig beholder fastgjort til ægmembranen og bruge en blyant til at markere den vedhæftede fil for at undgå interventioner i denne region. Tegn en 1,5 centimeter region i et godt vaskulært område mindst to centimeter fra fosteret vedhæftet fil til at fungere som en drift vindue område og tegne en 0,5 centimeter kvadrat i en mindre vaskulær område cirka en centimeter fra driftsvinduet.

Marker derefter midten af luftsækken. Brug derefter et roterende værktøj og graveringsbor med en bid med en diameter på tre millimeter til omhyggeligt at bore æggeskallen inden for det markerede kvadrat. Brug stumpe kraftbecer til at fjerne æggeskallen uden at fjerne den hvide ydre æggeskalmembran lige under skallen.

Brug boret til omhyggeligt at lave en lokalisere boremaskine perforering i det markerede kors i luftsækken område for at tillade luftstrøm ind i ægget uden at bryde eller beskadige skallen og tilsæt 30 mikroliter AF HBSS til firkantet åbning over intakt ydre æggeskal membran. Ved hjælp af en 30 gauge nål, lave en lokalisere perforering i den ydre membran inden for det firkantede område. Hold derefter ægget op til lyskilden for at visualisere luftsækken og lægge pres på en pipettegummipærepære.

Sæt pipettepæren over den lille perforering i luftsækken, og slip trykket på pæren, indtil der observeres en adskillelse af den ydre membran og chorioallantoic membraner inden for operationsvinduesområdet, og dette trin gentages, indtil membranerne er fuldstændig isoleret. Når alle æggene er blevet ændret på samme måde, bores det cirkulære driftsvindue i et æg, idet man ikke bryder den ydre æggeskalmembran, og brug den klistrede side af et stykke tape til at fjerne eventuelle løse partikler fra skallen. Brug stumpe kraftbehænder, fjern æggeskallen fra det borede område efterfulgt af den ydre æggeskalmembranen, idet man ikke indfører små skalpartikler inde i ægget for at minimere forureningen.

Når æggeskallen og den ydre membran er fjernet som påvist, skal æggene dækkes med en paraffinvoksmembran og æggene tilbage i ægskuvøsen uden rotation, indtil dorsale rodganglier er klar til podning. Til podning af en dorsal rod ganglion på chorioallantoic membran, bruge fine sterile kraftbuner til omhyggeligt at forstå en ganglion i kulturen parabol og forsigtigt vaske vævet i en beholder med frisk HBSS. Placer ganglion på chorioallantoic membran af et æg være omhyggelig med ikke at punktere membranen og dække alle æg åbninger med sterile gennemsigtige film forbindinger.

Når alle æggene er podet, returneres de til den befugtning æg rugemaskine i to dage uden rotation. I slutningen af inkubationen, overføre æggene til laminar flow kabinet og bruge saks og kraftbånd til at åbne den gennemsigtige film dressing. Dernæst tilføje 0,5 til en million fluorescerende mærket tumorceller i fem mikroliter af HBSS på chorioallantoic membran af hvert æg omkring to millimeter fra hver dorsale rod ganglion holde en ensartet afstand mellem ganglier og cellerne.

Derefter dække æggene med en ny film dressing og returnere æggene til ægget rugemaskine i syv dage uden rotation. Ved inkubationens afslutning sættes æggene på laboratoriebænken. Brug en sprøjte til at perforere filmen dressing af hvert æg og anvende omkring 300 mikroliter af 4% paraformaldehyd over hver chorioallantoic membran til lidt stivne vævet for at lette høstprocessen.

Ved hjælp af en saks, fjerne den øverste halvdel af æggeskallen med chorioallantoic membran fastgjort. Reducer størrelsen af skallen til cirka tre centimeter i diameter holde den del af chorioallantoic membran, hvor dorsale rod ganglion og tumorceller blev podet i midten af skallen fragment. Derefter gribe chorioallantoic membran med fine scelinnte og løsrive vævet fra æggeskallen til overførsel i en brønd af en seks-brønd plade, der indeholder to milliliter 4% paraformaldehyd per godt dorsale rod ganglion og tumor celle side op.

Integrationen af dorsale rodganglier i chorioallantoic membranen er vigtig, da den chorioallantoic membran giver ernæring til dorsale rod ganglion væv under forsøget. Mikroskopisk, den dorsale rod ganglion er observeret i bindevæv af chorioallantoic membran og blodkar ses ofte inde i dorsale rod ganglion væv tyder på, at chorioallantoic membran blodforsyning er pleje det podede væv. Implanterede tumorer er også identificeret på chorioallantoic membran af hæmatoxylin og eosin farvning.

Afhængigt af hvor meget invasion er til stede, tumorer kan præsentere med ingen til talrige tumor øer invaderer bindevæv. I denne repræsentative eksperiment, billeddannelse med fusionere fluorescens analyse afslørede en øget invasion af dorsale rod ganglion i chorioallantoic membraner podet med tumorceller over udtrykke galanin receptor 2 i forhold til kontrol tumorer. Denne nyttige og omkostningseffektive in vivo model af perineural invasion kan kopieres selv af laboratorier med begrænsede ressourcer.