Il modello Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo per valutare l'invasione perineurale nel cancro alla testa e al collo

Questo protocollo consente lo studio in vivo delle prime interazioni tra cellule tumorali e nervi e lo studio delle vie molecolari di invasione nervosa nel cancro. I principali vantaggi di questa tecnica sono il breve tempo sperimentale con il potenziale di studiare l'invasione perineurale e altri fenotipi tumorali nello stesso esperimento. Prima di provare questa tecnica per la prima volta, ti consigliamo di praticare la perforazione di uova commerciali non fecondate e raccogliere i gangli delle radici dorsali per ottimizzare la tua tecnica per entrambe le procedure.

A dimostrare la procedura sarà Min Liu, un ricercatore del mio laboratorio. Inizia incubando sei uova fecondate commerciali esenti da agenti patogeni per gruppo sperimentale in un incubatore di umidificazione delle uova a 38 gradi Celsius e 54% di umidità il primo giorno dopo la fecondazione per otto giorni con rotazione oraria. All'ottavo giorno, pulire la pelle dorsale di un topo eutanasiato con il 70% di etanolo e utilizzare le forbici per rimuovere la colonna vertebrale.

Separare le regioni cervicali, toraciche e lombari e posizionare le sezioni della colonna vertebrale in un piatto di coltura di 10 centimetri con PBS per mantenere i campioni di tessuto idratati. Utilizzando delicate forbici ossee, aprire le ossa vertebrali toraciche e cervicali negli aspetti dorsale e ventrale per separare la colonna vertebrale in due metà laterale e posizionare le sezioni di tessuto in un piatto pulito di 10 centimetri con PBS fresco. Usando le forcep, staccare delicatamente il midollo spinale dalle ossa vertebrali per visualizzare i gangli delle radici dorsali.

Posizionando le punte di un paio di forcelle fini tenute sotto ogni ganglio, afferrare il tessuto e tirarlo dalla cavità ossea in cui è alloggiato. Subito dopo la raccolta, posizionare ogni ganglio nel mezzo di coltura DMEM integrato con 2%penicillina e streptomicina o Pen-Strep e 10% siero bovino fetale o FBS per aiutare a prevenire la contaminazione batterica dei tessuti nervosi. Una volta raccolti tutti i gangli, trasferire i tessuti in un nuovo piatto di coltura contenente un mezzo di coltura DMEM fresco integrato con 2%Pen-Strep più 10%FBS e 1,2 microgrammi per millilitro di colorante fluorescente rosso per un'incubazione di un'ora nell'incubatore di coltura cellulare.

Per preparare le uova per l'innesto di ganglio della radice dorsale, attenere la luce in un armadio di flusso laminare e tenere l'uovo con il sacco d'aria naturale verso la fonte di luce, trasilluminare ogni uovo per verificare la vitalità del pulcino e la fase embrionale. Identificare l'attaccamento dell'embrione in via di sviluppo alla membrana corioallantoica come vaso mobile scuro attaccato alla membrana dell'uovo e utilizzare una matita per contrassegnare l'attaccamento per evitare interventi in questa regione. Disegnare una regione di 1,5 centimetri in un'area ben vascolarizzata ad almeno due centimetri dall'attacco dell'embrione per fungere da area della finestra operativa e disegnare un quadrato di 0,5 centimetri in un'area meno vascolarizzata a circa un centimetro dalla finestra operativa.

Quindi contrassegnare il centro della regione del sacco d'aria. Successivamente, utilizzare uno strumento rotante e un trapano per incisione con una punta di tre millimetri di diametro per forare con cura il guscio d'uovo all'interno del quadrato contrassegnato. Utilizzare le forcelle smussate per rimuovere il guscio d'uovo senza rimuovere la membrana bianca esterna del guscio d'uovo proprio sotto il guscio.

Utilizzare il trapano per effettuare con attenzione una perforazione di perforazione precisa nella croce contrassegnata nell'area del sacco d'aria per consentire il flusso d'aria nell'uovo senza rompere o danneggiare il guscio e aggiungere 30 microlitri di HBSS all'apertura quadrata sulla membrana esterna intatta del guscio d'uovo. Utilizzando un ago calibro 30, effettuare una perforazione millimetrica nella membrana esterna all'interno dell'area quadrata. Quindi, tenere l'uovo fino alla fonte di luce per visualizzare il sacco d'aria e applicare pressione su un bulbo di gomma contagocce.

Posizionare il bulbo contagocce sulla piccola perforazione all'interno del sacco d'aria e rilasciare la pressione sul bulbo fino a quando non si osserva una separazione della membrana esterna e delle membrane corioallantoiche all'interno dell'area della finestra operativa ripetendo questo passaggio fino a raggiungere una completa separazione delle membrane. Quando tutte le uova sono state modificate nello stesso modo, praticare la finestra operativa circolare in un uovo facendo attenzione a non rompersi la membrana esterna del guscio d'uovo e utilizzare il lato appiccicoso di un pezzo di nastro adesivo per rimuovere eventuali particelle sciolte dal guscio. Utilizzando forcelle smussate, rimuovere il guscio d'uovo dall'area forata seguita dalla membrana esterna del guscio d'uovo facendo attenzione a non introdurre piccole particelle di guscio all'interno dell'uovo per ridurre al minimo la contaminazione.

Quando il guscio d'uovo e la membrana esterna sono stati rimossi come dimostrato, coprire le uova con una membrana di cera di paraffina e riposizionare le uova nell'incubatrice di uova senza rotazione fino a quando i gangli della radice dorsale non sono pronti per l'innesto. Per l'innesto di un ganglio di radice dorsale sulla membrana corioallantoica, utilizzare forcelle sterili fini per afferrare attentamente un ganglio nel piatto di coltura e lavare delicatamente il tessuto in un contenitore di HBSS fresco. Posizionare il ganglio sulla membrana corioallantoica di un uovo facendo attenzione a non forare la membrana e coprire tutte le aperture delle uova con medicazioni sterili trasparenti.

Quando tutte le uova sono state innestate, riportarle nell'incubatrice di uova umidificante per due giorni senza rotazione. Alla fine dell'incubazione, trasferire le uova nell'armadio di flusso laminare e utilizzare forbici e forcep per aprire la medicazione trasparente del film. Successivamente, aggiungere da 0,5 a un milione di cellule tumorali etichettate fluorescentmente in cinque microlitri di HBSS sulla membrana corioallantoica di ogni uovo a circa due millimetri da ogni ganglio della radice dorsale mantenendo una distanza uniforme tra i gangli e le cellule.

Quindi coprire le uova con un nuovo condimento cinematografico e riportare le uova nell'incubatrice di uova per sette giorni senza rotazione. Alla fine dell'incubazione, posizionare le uova sulla panca del laboratorio. Utilizzare una siringa per perforare la medicazione del film di ogni uovo e applicare circa 300 microlitri di paraformaldeide al 4% su ogni membrana corioallantoica per irrigidire leggermente il tessuto per facilitare il processo di raccolta.

Usando le forbici, rimuovere la metà superiore del guscio d'uovo con la membrana corioallantoica attaccata. Ridurre le dimensioni del guscio a circa tre centimetri di diametro mantenendo la porzione della membrana corioallantoica in cui il ganglio della radice dorsale e le cellule tumorali sono state innestate all'interno del centro del frammento di guscio. Quindi afferrare la membrana corioallantoica con forceps fini e staccare il tessuto dal guscio d'uovo per il trasferimento in un pozzo di una piastra a sei po po 'contenente due millilitri di paraformaldeide al 4% per ganglio della radice dorsale del pozzo e lato della cellula tumorale verso l'alto.

L'integrazione dei gangli delle radici dorsali nella membrana corioallantoica è importante in quanto la membrana corioallantoica fornisce nutrizione al tessuto ganglio della radice dorsale durante l'esperimento. Microscopicamente, il ganglio della radice dorsale si osserva all'interno del tessuto connettivo della membrana corioallantoica e i vasi sanguigni sono spesso visti all'interno del tessuto ganglio della radice dorsale suggerendo che l'apporto di sangue della membrana corioallantoica sta nutrendo il tessuto innestato. I tumori impiantati sono identificati anche sulla membrana corioallantoica mediante colorazione ematossilina ed eosina.

A seconda di quanta invasione è presente, i tumori potrebbero presentare no a numerose isole tumorali che invadono il tessuto connettivo. In questo esperimento rappresentativo, l'imaging con l'analisi della fluorescenza di fusione ha rivelato una maggiore invasione del ganglio della radice dorsale nelle membrane corioallantoiche innestate con cellule tumorali sull'espressione del recettore della galanina 2 rispetto ai tumori di controllo. Questo modello in vivo utile ed economico di invasione perineurale può essere replicato anche da laboratori con risorse limitate.