이 프로토콜은 종양 세포와 신경 사이 초기 상호 작용의 생체 내 연구 와 암에 있는 신경 침략의 분자 통로의 연구 결과 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 동일한 실험에서 perineural 침략 및 기타 암 표현형을 연구할 수 있는 잠재력을 가진 짧은 실험 시간입니다. 처음으로이 기술을 시도하기 전에, 우리는 두 절차에 대한 기술을 최적화하기 위해 상업 비 수정 계란을 드릴링하고 등쪽 뿌리 갱리아를 수확하는 것이 좋습니다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 연구 동료 인 민 리우 (Min Liu)가 될 것입니다. 실험군당 6개의 상업용 병원균 이없는 수정란을 달걀 가습 인큐베이터에 38도, 시간당 회전시 8일간 의 습도 54%를 배양한다. 8일째에는 안락사된 쥐의 등쪽 피부를 70%에탄올로 청소하고 가위를 사용하여 척추를 제거합니다.
자궁 경부, 흉부 및 요추 영역을 분리하고 조직 샘플을 수화하기 위해 PBS와 함께 10 센티미터 배양 접시에 척추 섹션을 배치합니다. 섬세한 뼈 가위를 사용하여 등쪽과 복부 측면에 흉부 와 자궁 경부 척추 뼈를 열어 척추를 두 개의 측면 반쪽으로 분리하고 조직 섹션을 신선한 PBS로 깨끗한 10 센티미터 접시에 넣습니다. 집게를 사용하여 척골 뼈에서 척수를 부드럽게 분리하여 등부 뿌리 신경절을 시각화합니다.
각 신경절 아래에 들고 있는 한 쌍의 미세 한 집게의 팁을 놓고 조직을 잡고 박혀있는 뼈 구멍에서 당깁니다. 수확 직후 각 신경절을 DMEM 배양 배지에 2%페니실린과 연쇄상 구균 또는 펜 스트렙, 10%의 태아 소 혈청 또는 FBS로 보충하여 신경 조직의 세균 오염을 방지합니다. 모든 간질이 수확되면, 2%펜-스트렙 플러스 10%FBS와 1.2 마이크로그램당 세포 배양 인큐베이터에서 1시간 동안 보충된 신선한 DMEM 배양 배지를 함유한 새로운 배양 접시로 조직을 옮기.
등대 뿌리 신경절 이식편용 계란을 준비하기 위해 라미나르 플로우 캐비닛의 빛을 어둡게 하고 자연적으로 발생하는 공기 주머니로 달걀을 광원을 향해 돌리며 각 달걀을 환전하여 병아리 의 생존력과 배아 단계를 확인합니다. 난막에 부착된 어두운 움직이는 용기로서 조골막에 대한 개발 배아의 부착을 식별하고 연필을 사용하여 이 부위의 개입을 피한다. 수술 창 영역으로 작용하고 수술 창에서 약 1센티미터 떨어진 혈관 부위에 0.5센티미터 의 사각형을 그리는 배아 부착으로부터 적어도 2센티미터 의 혈관 부위에 1.5센티미터 영역을 그립니다.
그런 다음 공기 낭 영역의 중심을 표시합니다. 다음으로, 로터리 도구와 3밀리미터 직경 비트로 드릴을 조각하여 표시된 사각형 내에서 달걀 껍질을 조심스럽게 드릴링합니다. 무딘 집게를 사용하여 껍질 바로 아래에 흰색 외부 계란 껍질 막을 제거하지 않고 달걀 껍질을 제거하십시오.
드릴을 사용하여 공기 주머니 영역의 표시된 십자가에서 정밀하게 드릴 천공을 만들어 껍질을 부러뜨리거나 손상시키지 않고 계란으로 공기 흐름을 허용하고 그대로 외부 계란 껍질 멤브레인 위에 30 마이크로리터의 HBSS를 추가하십시오. 30 게이지 바늘을 사용하여 사각형 영역 내의 외부 멤브레인에서 정확하게 천점을 만듭니다. 다음으로, 계란을 광원까지 잡고 공기 주머니를 시각화하고 안면 담수 고무 전구에 압력을 가합니다.
안도비버 전구를 공기 낭 내의 작은 천공 위에 놓고 수술 창 영역 내의 외부 멤브레인 및 초리오알란토믹 멤브레인의 분리가 관찰될 때까지 전구에 압력을 방출하여 멤브레인의 완전한 분리가 이루어질 때까지 이 단계를 반복하는 것이 관찰된다. 모든 계란이 동일한 방식으로 수정되면, 외부 계란 껍질 막을 파열하지 않도록주의 한 계란에 원형 작동 창을 드릴링하고 쉘에서 느슨한 입자를 제거하기 위해 접착제 테이프 조각의 끈적 끈적한 면을 사용합니다. 무딘 집게를 사용하여, 오염을 최소화하기 위해 계란 내부에 작은 껍질 입자를 소개하지 않도록주의 하는 외부 계란 껍질 막 에 의해 다음 드릴 영역에서 계란 껍질을 제거합니다.
달걀 껍질과 외부 멤브레인이 입증된 대로 제거되면 파라핀 왁스 멤브레인으로 계란을 덮고 등쪽 뿌리 간질이 접목 할 준비가 될 때까지 회전없이 계란 인큐베이터에 다시 계란을 넣습니다. 등대 뿌리 신경절을 초리오알란토믹 멤브레인에 이식하려면 미세멸균 집게를 사용하여 배양 접시에 있는 하나의 신경절을 조심스럽게 파악하고 신선한 HBSS 용기에 티슈를 부드럽게 씻으십시오. 간경을 한 달걀의 조오알라란토틱 막에 놓고 막에 구멍을 뚫지 않도록 주의하고 멸균 투명 필름 드레싱으로 모든 계란 개구부를 덮습니다.
모든 계란이식되었을 때, 회전없이 이틀 동안 가습 계란 인큐베이터로 돌아갑니다. 인큐베이션이 끝나면 계란을 라미나르 플로우 캐비닛으로 옮기고 가위와 집게를 사용하여 투명한 필름 드레싱을 엽니다. 다음으로, 각 등대 뿌리 신경절에서 약 2밀리미터씩 각 계란의 초리오알란토믹 막에 HBSS의 5개의 마이크로리터에 0.5내지 100만 개의 형광으로 표지된 종양 세포를 추가하여 신경리아와 세포 사이의 균일한 거리를 유지한다.
그런 다음 새로운 필름 드레싱으로 계란을 덮고 회전없이 7 일 동안 계란 인큐베이터로 계란을 반환합니다. 인큐베이션이 끝나면 계란을 실험실 벤치 상단에 놓습니다. 주사기를 사용하여 각 계란의 필름 드레싱을 천명하고 각 초라알란토믹 멤브레인에 약 300 개의 미세 리터를 적용하여 수확 과정을 용이하게하기 위해 조직을 약간 경화시킵니다.
가위를 사용하여, 조골 란토믹 멤브레인이 부착된 달걀 껍질의 상부 절반을 제거합니다. 등등 뿌리 신경절및 종양 세포가 쉘 단편의 중앙 내에서 접목된 초리오알란토아막의 부분을 유지하는 직경이 약 3센티미터로 쉘의 크기를 감소시킵니다. 그런 다음 미세 한 포셉으로 chorioallantoic 막을 잡고 잘 등쪽 뿌리 신경절과 종양 세포 측 당 4 %의 파라 포름 알데히드의 2 밀리리터를 포함하는 6 웰 플레이트의 1 우물로 전송하기 위해 달걀 껍질에서 조직을 분리합니다.
조골란토믹 멤브레인에 등삼 근간을 통합하는 것은 실험 중 등대 뿌리 신경절 조직에 영양을 공급하기 때문에 중요하다. 현미경으로, 등쪽 뿌리 신경절은 융자 막과 혈관의 결합 조직 내에서 관찰되는 것은 종종 조환막 혈액 공급이 접목 된 조직을 양육하고 있음을 시사하는 등쪽 뿌리 신경절 조직 내부에서 종종 볼 수 있습니다. 이식된 종양은 또한 헤마톡실린과 에신 염색에 의하여 초리알란토이드 막에서 확인됩니다.
얼마나 많은 침략이 존재하는지에 따라, 종양은 결합 조직을 침략하는 수많은 종양 섬에 아무 없이 제시할 지도 모릅니다. 이 대표적인 실험에서, 병합 형광 분석을 가진 화상 진찰은 관제 종양에 비해 갈라닌 수용체 2를 표현하는 종양 세포와 접목된 초리알란토믹 막에서 등쪽 뿌리 신경절의 증가된 침입을 드러냈다. perineural 침략의 생체 내 모델에서 유용하고 비용 효과적인 이 유용하고 비용 효과적인 제한된 자원을 가진 실험실에서도 복제 할 수 있습니다.
