The Chick Chorioallantoic membran in vivo -modell for å vurdere Perineural invasjon i hode og nakke Cancer

Denne protokollen tillater in vivo-studien av tidlige interaksjoner mellom tumorceller og nerver og studiet av molekylære veier for nerveinvasjon i kreft. De viktigste fordelene med denne teknikken er den korte eksperimentelle tiden med potensial til å studere perineural invasjon og andre kreftfenotyper i samme eksperiment. Før du prøver denne teknikken for første gang, anbefaler vi å øve på å bore kommersielle ikke-befruktede egg og høste dorsal rotganglia for å optimalisere teknikken din for begge prosedyrene.

Å demonstrere prosedyren vil være Min Liu, en forskningsmedarbeider fra laboratoriet mitt. Begynn med å inkubere seks kommersielle patogenfrie befruktede egg per eksperimentell gruppe i en eggfuktende inkubator ved 38 grader Celsius og 54% fuktighet på den første dagen etter befruktning i åtte dager med timerotasjon. På dag åtte, rengjør rygghuden til en eutanisert rotte med 70% etanol og bruk saks for å fjerne ryggraden.

Skill cervical, thorax og lumbal områder og plassere ryggraden seksjoner i en 10 centimeter kultur rett med PBS for å holde vevsprøver hydrert. Ved hjelp av delikatbensaks, åpne thorax og cervical vertebrale bein i rygg- og ventrale aspekter for å skille ryggraden i to laterale halvdeler og legg vevseksjonene i en ren 10 centimeter rett med frisk PBS. Bruk tang, løsne forsiktig ryggmargen fra vertebrale bein for å visualisere dorsale rotganglions.

Plassere spissene av et par fine tang holdt under hver ganglion, ta tak i vevet og trekk det fra beinhulen der det er fast. Umiddelbart etter høsting, plasser hver ganglion i DMEM kultur medium supplert med 2% penicillin og streptomycin eller Pen-Strep og 10% fosterbovin serum eller FBS for å forhindre bakteriell forurensning av nervevevet. Når alle ganglia har blitt høstet, overføre vevet til en ny kultur rett som inneholder frisk DMEM kultur medium supplert med 2% Pen-Strep pluss 10% FBS og 1,2 mikrogram per milliliter rød fluorescerende fargestoff for en times inkubasjon i cellekultur inkubatoren.

For å forberede eggene til dorsal rot ganglion pode, dempe lyset i en laminær strømningskabinett og holde egget med naturlig forekommende luftsekk mot lyskilden, transilluminere hvert egg for å se etter chick levedyktighet og embryonal fase. Identifiser vedlegget av det utviklende embryoet til den chorioallantoic membranen som et mørkt bevegelig fartøy festet til eggmembranen og bruk en blyant for å markere vedlegget for å unngå inngrep i denne regionen. Tegn en 1,5 centimeter region i et godt vaskularisert område minst to centimeter fra embryotilbehøret for å fungere som et operasjonsvindusområde og tegne en 0,5 centimeter firkant i et mindre vaskularisert område omtrent en centimeter fra driftsvinduet.

Merk deretter midten av luftsec-regionen. Deretter bruker du et roterende verktøy og graveringsbor med en tre millimeter diameter bit for å forsiktig bore eggeskallet innenfor den merkede firkanten. Bruk sløve tang for å fjerne eggeskallet uten å fjerne den hvite ytre eggeskallmembranen rett under skallet.

Bruk boret til å forsiktig lage en presis boreperforering i det markerte korset i luftsekkeområdet for å tillate luftstrøm inn i egget uten å bryte eller skade skallet og legge til 30 mikroliter HBSS til firkantåpningen over den intakte ytre eggeskallmembranen. Bruk en 30 gauge nål, gjør en presis perforering i den ytre membranen innenfor det firkantede området. Deretter holder du egget opp til lyskilden for å visualisere luftseken og legge press på en pipettegummipære.

Plasser pipettepæren over den lille perforeringen i luftseparaken og slipp trykket på pæren til en separasjon av den ytre membranen og chorioallantoic membraner i driftsvindusområdet observeres gjenta dette trinnet til en fullstendig separasjon av membranene oppnås. Når alle eggene er modifisert på samme måte, bor det sirkulære driftsvinduet i ett egg, vær forsiktig så du ikke bryter den ytre eggeskallmembranen og bruker den klissete siden av et stykke tape for å fjerne løse partikler fra skallet. Ved hjelp av stumpe tang, fjern eggeskallet fra det borede området etterfulgt av den ytre eggeskallmembranen som tar vare på å ikke introdusere små skallpartikler inne i egget for å minimere forurensning.

Når eggeskallet og den ytre membranen er fjernet som demonstrert, dekk eggene med en parafinvoksmembran og legg eggene tilbake i egginkubatoren uten rotasjon til dorsal rotganglia er klare for pode. For pode av en dorsal rot ganglion på chorioallantoic membran, bruk fine sterile tang for å nøye gripe en ganglion i kulturfatet og forsiktig vaske vevet i en beholder med frisk HBSS. Plasser ganglionen på den chorioallantoic membranen til ett egg, vær forsiktig så du ikke punkterer membranen og dekk alle eggåpningene med sterile gjennomsiktige filmdressinger.

Når alle eggene er podet, returnerer du dem til fuktingsegginkubatoren i to dager uten rotasjon. På slutten av inkubasjonen, overfør eggene til laminærstrømningskabinettet og bruk saks og tang for å åpne den gjennomsiktige filmdressingen. Deretter legger du til 0,5 til en million fluorescerende merkede tumorceller i fem mikroliter av HBSS på den chorioallantoic membranen til hvert egg omtrent to millimeter fra hver dorsal rotganglion som holder en jevn avstand mellom gangliene og cellene.

Dekk deretter eggene med en ny filmdressing og returner eggene til egginkubatoren i syv dager uten rotasjon. På slutten av inkubasjonen, legg eggene på laboratoriebenktoppen. Bruk en sprøyte til å perforere filmdressingen av hvert egg og bruke ca. 300 mikroliter på 4 % paraformaldehyd over hver chorioallantoic membran for å stivne vevet litt for å lette høstingsprosessen.

Ved hjelp av saks, fjern den øvre halvdelen av eggeskallet med den chorioallantoic membranen festet. Reduser størrelsen på skallet til omtrent tre centimeter i diameter som holder den delen av den chorioallantoic membranen hvor ryggrotganglion og tumorceller ble podet i midten av skallfragmentet. Ta deretter tak i den chorioallantoic membranen med fine tang og løsne vevet fra eggeskallet for overføring til en brønn av en seks-brønns plate som inneholder to milliliter på 4% paraformaldehyd per godt dorsal rot ganglion og tumorcelle side opp.

Integreringen av dorsal rot ganglia i chorioallantoic membran er viktig som chorioallantoic membran gir ernæring til dorsal rot ganglion vev under forsøket. Mikroskopisk observeres dorsal rotganglion i bindevevet i den chorioallantoiske membranen og blodårene blir ofte sett inne i dorsal rotganglionvevet som tyder på at den korioallantoiske membranblodtilførselen nærer det podede vevet. Implanterte svulster er også identifisert på den chorioallantoic membranen av hematoksylin og eosin farging.

Avhengig av hvor mye invasjon er til stede, svulster kan presentere med nei til mange tumor øyer invadere bindevev. I dette representative eksperimentet viste avbildning med fusjonsfluorescensanalyse en økt invasjon av dorsal rotganglion i chorioallantoic membraner podet med tumorceller over å uttrykke galaninreseptoren 2 sammenlignet med kontrollsvulster. Denne nyttige og kostnadseffektive in vivo-modellen av perineural invasjon kan replikeres selv av laboratorier med begrensede ressurser.