Den chick Chorioallantoic membran in vivo modell för att bedöma perineural invasion i huvud-och hals cancer

Detta protokoll gör det möjligt att in vivo studie av tidiga interaktioner mellan tumörceller och nerver och studiet av molekylära vägar av nerv invasion i cancer. De främsta fördelarna med denna teknik är den korta experimentella tid med potential att studera perineural invasion och andra cancer fenotyper i samma experiment. Innan du provar denna teknik för första gången, rekommenderar vi att öva borrning kommersiella icke-befruktade ägg och skörda dorsala roten ganglier att optimera din teknik för båda förfarandena.

Demonstrerar proceduren blir Min Liu, en forskarassistent från mitt laboratorium. Börja med att inkubera sex kommersiella patogenfria befruktade ägg per försöksgrupp i en äggbefuktande inkubator vid 38 grader Celsius och 54%luftfuktighet på den första dagen efter befruktningen i åtta dagar med timrotation. På dag åtta, rengör rygghuden hos en dödshjälpt råtta med 70%etanol och använd sax för att ta bort ryggraden.

Separera hals-, bröst-, och ländryggen regioner och placera ryggraden sektioner i en 10 centimeter kultur skålen med PBS för att hålla vävnadsprover hydrerade. Med hjälp av delikat ben sax, öppna bröst- och halskotben i dorsala och ventrala aspekter för att separera ryggraden i två laterala halvor och placera vävnadssektionerna i en ren 10 centimeters skål med färsk PBS. Med hjälp av tång, försiktigt lossa ryggmärgen från vertebral ben för att visualisera dorsala rot ganglions.

Placera spetsarna på ett par fina tutensor som hålls under varje ganglion, ta tag i vävnaden och dra den från benhålan där den är instudad. Omedelbart efter skörd, placera varje ganglion i DMEM kultur medium kompletteras med 2%penicillin och streptomycin eller Pen-Strep och 10%fetala nötkreatur serum eller FBS för att förhindra bakteriell kontaminering av nervvävnaderna. När alla ganglier har skördats, överföra vävnaderna till en ny kultur maträtt som innehåller färska DMEM kultur medium kompletteras med 2%Pen-Strep plus 10%FBS och 1,2 mikrogram per milliliter av rött fluorescerande färgämne för en timmes inkubation i cellkultur inkubatorn.

För att förbereda äggen för dorsala rot ganglion moderplantor, dämpa ljuset i en laminär flöde skåp och hålla ägget med naturligt förekommande luft säck mot ljuskällan, transilluminate varje ägg för att kontrollera för chick livskraft och embryonala fasen. Identifiera fastsättning av det utvecklande embryot till det chorioallantoiska membranet som ett mörkt rörligt kärl som är fäst vid äggmembranet och använd en penna för att markera bilagan för att undvika insatser i denna region. Rita en 1,5 centimeter region i ett väl vaskulariserat område minst två centimeter från embryotillsatsen för att fungera som ett operationsfönsterområde och rita en 0,5 centimeters kvadrat i ett mindre vaskulariserat område ungefär en centimeter från operationsfönstret.

Markera sedan centrum av luftsäcksregionen. Därefter använder en roterande verktyg och gravyr borr med en tre millimeter diameter bit för att noggrant borra äggskal inom den markerade torget. Använd trubbiga tlysen för att avlägsna äggskalet utan att ta bort det vita yttre äggskalsmembranet precis under skalet.

Använd borren för att noggrant göra en pricksäker borrperforering i det markerade korset i luftsäcksområdet för att tillåta luftflöde in i ägget utan att bryta eller skada skalet och tillsätt 30 mikroliter av HBSS till den fyrkantiga öppningen över det intakta yttre äggskalsmembranet. Med hjälp av en 30 gauge nål, gör en precisera perforering i det yttre membranet inom det fyrkantiga området. Därefter håller ägget upp till ljuskällan för att visualisera luften säcken och tillämpa tryck på en pipett gummi glödlampa.

Placera pipetten glödlampa över den lilla perforeringen inom luftsäcken och släpp trycket på glödlampan tills en separation av yttermembranet och chorioallantoic membranen inom operationsfönstret området observeras upprepa detta steg tills en fullständig separation av membranen uppnås. När alla ägg har modifierats på samma sätt, borra det cirkulära operationsfönstret i ett ägg noga med att inte brista den yttre äggskal membran och använda den klibbiga sidan av en bit av tejp för att ta bort eventuella lösa partiklar från skalet. Med hjälp av trubbiga tövröfningar, ta bort äggskal från det borrade området följt av det yttre äggskalsmembranet som är noga med att inte införa små skalpartiklar inuti ägget för att minimera kontaminering.

När äggskal och yttre membran har tagits bort som visat, täck äggen med en paraffin vax membran och placera äggen tillbaka i ägginkubatorn utan rotation tills dorsala rot ganglier är redo för ympning. För ympning av en dorsal rot ganglion på chorioallantoic membranet, använd fina sterila tång för att noggrant förstå en ganglion i kultur skålen och försiktigt tvätta vävnaden i en behållare med färska HBSS. Placera ganglion på chorioallantoic membranet av ett ägg vara noga med att inte punktera membranet och täcka alla ägg öppningar med sterila transparenta film förband.

När alla ägg har ympats, returnera dem till befuktande ägg inkubator i två dagar utan rotation. Vid slutet av inkubationen överför du äggen till det laminära flödesskåpet och använder sax och forceps för att öppna det genomskinliga filmförbandet. Därefter lägger 0,5 till en miljon fluorescerande märkta tumörceller i fem mikroliter av HBSS på chorioallantoic membranet av varje ägg cirka två millimeter från varje dorsal rot ganglion hålla ett enhetligt avstånd mellan ganglier och cellerna.

Täck sedan äggen med en ny filmdressing och återför äggen till ägginkubatorn i sju dagar utan rotation. I slutet av inkubationen, placera äggen på laboratoriebänken toppen. Använd en spruta för att perforera filmförbandet av varje ägg och applicera ca 300 mikroliter av 4%paraformaldehyd över varje chorioallantoic membran för att något stelna vävnaden för att underlätta skördeprocessen.

Med hjälp av sax, ta bort den övre halvan av äggskal med chorioallantoic membranet bifogas. Minska storleken på skalet till cirka tre centimeter i diameter hålla den del av chorioallantoic membranet där dorsala rot ganglion och tumörceller var ympade inom mitten av skal fragmentet. Sedan greppa chorioallantoic membranet med fina tång och lossa vävnaden från äggskal för överföring till en brunn av en sex-väl platta som innehåller två milliliter av 4%paraformaldehyd per väl dorsala rot ganglion och tumör cell sidan upp.

Integrationen av dorsala rot ganglier i chorioallantoic membranet är viktigt som chorioallantoic membranet ger näring till dorsala rot ganglion vävnad under experimentet. Mikroskopiskt, den dorsala roten ganglion observeras inom bindväv av chorioallantoic membranet och blodkärlen ses ofta inuti den dorsala roten ganglion vävnaden tyder på att den chorioallantoic membran blodtillförseln är vårdar den ympade vävnaden. Implanterade tumörer identifieras också på det chorioallantoic membranet genom hematoxylin och eosin färgning.

Beroende på hur mycket invasion är närvarande, tumörer kan presentera med nej till många tumör öar invaderar bindväv. I detta representativa experiment, bildframställning med merge fluorescens analys visade en ökad invasion av den dorsala roten ganglion i chorioallantoic membran ympade med tumör cellerna över uttrycker den galanin receptorn 2 jämfört med kontroll tumörer. Denna användbara och kostnadseffektiv in vivo modell av perineural invasion kan replikeras även av laboratorier med begränsade resurser.