Name: transient expression in red beet of a biopharmaceutical candidate vaccine for type-1 diabetes
Uploaded: 2019-03-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes at JoVE.com

هذا العمل كان يدعمها المشروع المشترك "استخدام النباتات لإنتاج لقاح للأكل لمرض السكري المناعة الذاتية (أديفا)" (معرف المشروع: 891854) ممولة من جامعة فيرونا في إطار نداء عام 2014.

1-أحمر زراعة البنجر والسبانخ
<ol><li>زراعة البنجر الأحمر (الشائع باء-السيرة الذاتية مولان روج) والسبانخ (S. حمقاء السيرة الذاتية اندستريا) النباتات في غرفة لنمو، باستخدام µE 150 من شدة الضوء، 65% رطوبة نسبية، ح 12 دورة الضوء/الظلام في 23/21 درجة مئوية، على التوالي.</li>
	<li>بعد إنبات البذور، تس?...

<ol>
	<li>Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edible+plants+for+oral+delivery+of+biopharmaceuticals.">Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).</li><li>Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+recombinant+protein+production+in+different+biofactories:+The+green+perspective.">Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective.</a> BioMed Research International. , (2014).</li><li>Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+recovery+of+recombinant+proteins+from+plants.">Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants.</a> Biotechnology Progress. 20 (4), 1001-1014 (2004).</li><li>Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-made+pharmaceuticals+for+the+prevention+and+treatment+of+autoimmune+diseases:+Where+are+we?.">Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we?.</a> Expert Review of Vaccines. 9 (8), 957 (2010).</li><li>Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transfection+of+viral+replicons+for+efficient+transient+expression+in+plants.">Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants.</a> Nature Biotechnology. 23, (2005).</li><li>Ludvigsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+treatment+of+type+1+diabetes+in+childhood.">Update on treatment of type 1 diabetes in childhood.</a> Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).</li><li>Merlin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+GAD65+production+in+plants+using+the+MagnICON+transient+expression+system:+Optimization+of+upstream+production+and+downstream+processing.">Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing.</a> Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).</li><li>Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Analysis+of+Recombinant+Protein+Expression+in+Different+Biofactories:+Bacteria,+Insect+Cells+and+Plant+Systems.">A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).</li><li>Dal Santo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+terroir+concept+interpreted+through+grape+berry+metabolomics+and+transcriptomics.">The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics.</a> Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfiltration+as+an+effective+and+scalable+strategy+of+gene+delivery+for+production+of+pharmaceutical+proteins.">Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins.</a> Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).</li><li>Bertini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+type-1+diabetes+vaccine+candidate+using+edible+plants+expressing+a+major+autoantigen.">Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen.</a> Frontiers in Plant Science. 9, (2018).</li><li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+planta+expression+of+the+human+islet+autoantigen+glutamic+acid+decarboxylase+(GAD65).">Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65).</a> Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).</li><li>Sep&#250;lveda-Jim&#233;nez, G., Rueda-Ben&#237;tez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+red+beet+(Beta+vulgaris)+UDP-glucosyltransferase+gene+induced+by+wounding,+bacterial+infiltration+and+oxidative+stress.">A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress.</a> Journal of Experimental Botany. 56, (2005).</li><li>Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+for+enhancing+oral+bioavailability+of+peptides+and+proteins.">Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins.</a> International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).</li><li>. Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction Available from: <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction">https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction</a> (2015)</li><li>Kamei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexation+hydrogels+for+intestinal+delivery+of+interferon+beta+and+calcitonin.">Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin.</a> Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).</li><li>Tuesca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexation+hydrogels+for+oral+insulin+delivery:+effects+of+polymer+dosing+on+in+vivo+efficacy.">Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).</li><li>Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+yield+of+recombinant+pharmaceutical+proteins+in+plants.">Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants.</a> Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).</li><li>Dhama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-based+oral+vaccines+for+human+and+animal+pathogens+&#8211;+a+new+era+of+prophylaxis:+current+and+future+perspectives.">Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens &#8211; a new era of prophylaxis: current and future perspectives.</a> Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447, 75-93 (2013).</li><li>Hefferon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconceptualizing+cancer+immunotherapy+based+on+plant+production+systems.">Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems.</a> Future science. O3, (2017).</li></ol>

واظهرنا في هذه الدراسة تحليل أولى لتصميم لقاح المرشح عن طريق الفم لمرض السكري المناعة الذاتية. البروتين المستهدف لهذه التجربة هو أحد أشكال كاتشين 65 البشرية Decarboxylase غلوتامات، هي الإنتاج والوظائف التي لا يمكن اكتشافها بسهولة وقابلة للقياس12المتحولة. في التعبير في الأنسجة النب?...

ومنذ ثورة البيولوجيا الجزيئية النباتية في الثمانينات، يمكن اعتبار الأنظمة المستندة إلى مصنع لإنتاج صيدلية كبديل للنظم التقليدية القائمة على الخلايا الجرثومية والثدييات1. عرض النباتات العديد من المزايا عبر الأنظمة الأساسية التقليدية، مع قابلية التطوير والفعالية من حيث التكلفة والسلامة هي الأكثر صلة بالموضوع2. يمكن تنقيته من الأنسجة النباتية تحول المنتج المؤتلف وثم إدارته، أما الحقن أو شفويا، وعلاوة على ذلك، تحولت النباتية الصالحة للأكل يمكن أن تستخدم مباشرة للتسليم عن طريق الفم. الطريق الفموي في الوقت نفسه يعزز حصانة المخاطية والجهازية، وأنه يلغي الحاجة للابر والموظفين الطبية المتخصصة. وعلاوة على ذلك، يلغي التسليم الشفوي التجهيز النهائي المعقدة، التي عادة ما تمثل 80 في المائة تكلفة التصنيع الكلي من البروتين المؤتلف3. يمكن ترجمة جميع هذه المزايا إلى تحقيق وفورات في الإنتاج والإمدادات والعمل على الحد من التكاليف لكل جرعة، جعل الدواء بأسعار معقولة لمعظم سكان العالم.
ووضعت العديد من الاستراتيجيات، سواء بالنسبة للتحول مستقرة والتعبير عابرة، لإنتاج البروتينات المؤتلف في النباتات. فيما بينها، نظام تعبير المستندة إلى الفيروسات النباتية فككت الغلة (مثلاً، ماجنيكون) يوفر أداء متفوق يؤدي عالية الغلة من البروتينات المؤتلف على مدى فترات زمنية قصيرة نسبيا4. وترد أمثلة كثيرة لتعبير عابر باستخدام نظام التعبير المستندة إلى الفيروسات النباتية في النباتات بينثاميانا نيكوتيانا ، يجري المضيف الإنتاج معيار الذهب. ومع ذلك، لا يعتبر هذا المصنع النموذجي أنواع الصالحة للأكل نتيجة القلويات وغيرها من الأيض السامة التي تتراكم في أوراقها.
في هذا العمل، ويصف لنا المقارنة بين نظامين النباتية الصالحة للأكل، البنجر الأحمر (الشائع بيتا السيرة الذاتية مولان روج) والسبانخ (سبيناسيا حمقاء السيرة الذاتية اندستريا)، للتعبير عن شكلين مرشح من isoform كاتشين 65 من حمض الجلوتاميك ديكاربوكسيلاسي (GAD65)، التي تقوم بها المصنع القائم على الفيروس متجهات5. GAD65 أوتوانتيجين رئيسية المرتبطة بداء السكري من النوع 1 (T1D)، وحاليا قيد التحقيق في التجارب السريرية البشرية منع أو تأخير T1D بحمل التسامح6. ودرست إنتاج GAD65 في النباتات على نطاق واسع في الأنواع النباتية النموذجية نيكوتيانا تاباكوم و بينثاميانا أ4،5،،من67. وهنا يصف لنا استخدام الأنواع النباتية الصالحة للأكل لإنتاج جزيء في الأنسجة التي يمكن أن تعني لتسليم مباشر عن طريق الفم. من وجهة نظر تقنية، بدراسة وتحديد نظام أجروينفيلتريشن النباتية ومنهاج GAD65 إنتاج زيوت الطعام النباتية من خلال تقييم معلمات مختلفة: تعبير البروتين المؤتلف المستويات، تهمة الميكروبية المتبقية في المصنع الأنسجة يعني للتسليم الشفوي، ومقاومة GAD65 لهضم المعدة، والتكافؤ للنباتات تحول مع نوع البرية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2-&#956;m Minisart RC4 membrane filters</td>
			<td>Sartorius-Stedim</td>
			<td>17764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8211;mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td>pH 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27221</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td>Toxic &#8211; 0.1 M stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Bacteriological Grade</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0949</td>
			<td>15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-eGFP antibody</td>
			<td>ABCam</td>
			<td>ab290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAD 65/67 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-LHCB2 antibody</td>
			<td>Agrisera</td>
			<td>AS01 003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 &#956;m) Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Guard Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 &#956;m) Guard&#160; Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CalMag Grower</td>
			<td>Peter Excel</td>
			<td>15-5-15</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>C0109</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708370</td>
			<td>ChemiDoc Touch Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5927</td>
			<td>Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence reader</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>&#160;1420-011</td>
			<td>VICTOR Multilabel Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td>15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1758</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 &#956;m) Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC Guard Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 &#956;m) Guard&#160; Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6154</td>
			<td>Do not freeze/thaw too many times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Autosampler</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>System Gold 508 Autosampler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>System Gold 128 Solvent Module HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>24137</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K4000</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol solution</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td>Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizator</td>
			<td>5Pascal</td>
			<td>LIO5P0000DGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectometer</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>&#160; -</td>
			<td>Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk-blocking solution</td>
			<td>Ristora</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>3 % in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282</td>
			<td>&#160;Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulase membrane</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase substrate ECL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2235</td>
			<td>Light sensitive material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Vacuum Press</td>
			<td>VWR</td>
			<td>111400000098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643</td>
			<td>Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643</td>
			<td>Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>R0146</td>
			<td>Toxic &#8211; 25 mg/mL stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium dodecyl sulphate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metabisulphite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7681-57-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator system</td>
			<td>Soltec</td>
			<td>090.003.0003</td>
			<td>Sonica&#174; 2200 MH; frequency 40 khz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent fixed 300-&#181;L insert glass tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11573680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>TRP03</td>
			<td>10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Heto</td>
			<td>3878 F1-3</td>
			<td>Speed-vac System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>39253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y1333</td>
			<td>5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient expression in red beet of a biopharmaceutical candidate vaccine for type-1 diabetes

الزراعة الجزيئية النباتية هو استخدام النباتات إنتاج جزيئات ذات الاهتمام. من هذا المنظور، النباتات قد تستعمل كالمفاعلات الحيوية لإنتاج وتنقية اللاحقة للمنتج النهائي والتسليم الشفوي المباشر من البروتينات مغايرة عند استخدام الأنواع النباتية الصالحة للأكل. في هذا العمل، نقدم تطوير اللقاح الفموي ضد داء السكري من النوع 1 (T1D) المرشح في النظم النباتية الصالحة للأكل باستخدام تكنولوجيا المستندة إلى فيروس الحمض النووي المؤتلف مصنع فككت تسليمها مع تسلل الفراغ. النتائج التي توصلنا إليها تظهر أن بنجر أحمر مضيف مناسب للتعبير عابرة من أوتوانتيجين المشتقة البشرية المرتبطة T1D، يعتبر مرشح واعدة كلقاح T1D. اتسمت الأوراق المنتجة أوتوانتيجين دقة لمقاومتهم لهضم المعدة ووجود تهمة البكتيرية المتبقية لصورتهم الأيضية الثانوية، إعطاء لمحة عامة عن عملية الإنتاج للاستخدام المحتمل محطات للتسليم الشفوي المباشر بروتين مغايرة. وأظهر تحليل لدينا تدهور شبه كامل من اللقاح الفموي المرشح المعصوفه بعد هضم المعدة محاكاة، مما يوحي بأن استراتيجية تغليف في تصنيع اللقاح جاد المشتقة من النباتات مطلوب.

ويرد في هذا العمل، وسير العمل لتطوير لقاح الشفوي في الأنسجة النباتية الصالحة للأكل. أن التركيز في هذا العمل هو التعبير عن البروتين المستهدف في أنواع النباتية مضيف الصالحة للأكل، وتوصيف اللقاح الفموي المحتملة.
وشملت الخطوة الأولى في تقيي...

Watch this Scientific Journal Video about Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes at JoVE.com

Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes

التعبير عابر في البنجر الأحمر لقاح مرشح الصيدلانية البيولوجية لمرض السكري نوع 1

نقدم هنا، بروتوكولا لإنتاج مرشح لقاح الفموي ضد داء السكري نوع 1 في مصنع للأكل.

Plant molecular farming is the use of plants to produce molecules of interest. In this perspective, plants may be used both as bioreactors for the ...

من بين الاستراتيجيات المختلفة لإنتاج البروتين المؤتلف في النباتات ، يوفر تعبير VERS النباتي المفكك أداءً فائقًا ، مما يؤدي إلى غلة عالية على مدى فترة زمنية قصيرة نسبية. إن تكرار هذه التكنولوجيا لإنتاج لقاح فموي ينطوي على إمكانات كبيرة ليصبح بديلاً عن اللقاحات التقليدية في المستقبل القريب. أوراق البنجر الأحمر الLyophilized تحول بشكل عابر يتراكم كمية من مستضدات الصورة مناسبة للتحريض التسامح عن طريق الفم في الوقاية من مرض السكري من النوع الأول.ويمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول التجريبي ليشمل العديد من الأنواع الصالحة للأكل المختلفة بعد تقييم كل حالة على حدة لتراكم البروتين المؤتلف. ومن خلال هذا الإجراء، سيكون إدواردو بيرتيني، وماتيا سانتوني، وآنا كوكورولو، وروبرتا زامبيري. لبدء هذا الإجراء، تنمو البنجر الأحمر والنباتات السبانخ في غرفة النمو كما هو مبين في بروتوكول النص.بعد إنبات البذور، اخصح النباتات مرتين في الأسبوع مع محلول من الأسمدة المتاحة تجاريا بتركيز غرام واحد للتر الواحد. للتصفية الزراعية، استخدم السبانخ من العمر خمسة أسابيع وستة مصانع بنجر أحمر من العمر. بعد بناء ناقلات التعبير النباتية، تلقيح المحولات الثلاثة A.tumefaciens في 50 ملليلتر من متوسطة LB التي تحتوي على ريفامبيسين بتركيز 50 ميكروغرام لكل ملليلتر والمضادات الحيوية الموجهة المحددة على النحو المبين في بروتوكول النص.تنمو عن طريق هز بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية. في اليوم التالي، بيليه الثقافات البكتيرية عن طريق الطرد المركزي في 4500 مرات G لمدة 20 دقيقة. Resuspend بيليه في 100 ملليلتر من حاجز التسلل التي تحتوي على 10 ميوس ميليمولار و 10 ميليمولار سلفات المغنيسيوم.احتضان التعليقات في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات. مزيج حجم متساو من تعليق البكتيرية التي تحتوي على واحدة من الوحدات المعروضة هنا، مع وحدة رئيس الوزراء خمسة ووحدة integrase. باستخدام حقنة دون إبرة، أخرج خمسة ملليلترات من مزيج التعليق.اضغط على طرف الحقنة ضد الجانب السفلي من ورقة النبات أثناء تطبيق ضغط مضاد بلطف على الجانب الآخر من الورقة. التسلل إلى أول ثلاثة أوراق الموسعة تماما، بدءا من قمة، لكل مصنع. تسمية الأوراق الزراعية المصفاة مع علامة الورق على جذع الورقة.ثم العودة إلى النباتات إلى غرفة النمو في ظل الظروف القياسية. في الأيام 4-14 بعد العدوى، وجمع الأوراق الزراعية المرشحة وتجميدها في النيتروجين السائل. تخزين هذا النسيج النباتي في ناقص 80 درجة مئوية.أولاً، تنمو بشكل منفصل المحولات A.tumefaciens الثلاثة في 50 ملليلتر من متوسطة LB التي تحتوي على ريفامبيسين بتركيز 50 ميكرولتر لكل ملليلتر، والمضادات الحيوية المناسبة للنواقل المحددة عن طريق الاهتزاز بين عشية وضحاها عند 28 درجة مئوية. في اليوم التالي، بيليه الثقافات البكتيرية عن طريق الطرد المركزي في 4500 مرات G لمدة 20 دقيقة. Resuspend بيليه في 1 لتر من التسلل العازلة لOD600 من 0.35، واحتضان التعليقات في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات.ثم إضافة 0.01٪ من المنظفات إلى كل تعليق. مزيج حجم متساو من تعليق البكتيرية التي تحتوي على واحدة من الوحدات المعروضة هنا مع وحدة رئيس الوزراء خمسة ووحدة integrase. إدراج واحد ستة أسابيع من العمر نبات البنجر الأحمر في حامل.عكس حامل ووضعها على رأس منقار يحتوي على اثنين لتر من حمام تسلل لغمر الأوراق في تعليق التسلل. بعد ذلك، نقل حمام التسلل مع النبات المغمور إلى غرفة التسلل وإغلاقه. بدوره على مضخة فراغ وفتح صمام التفريغ على غرفة التسلل.مرة واحدة في الضغط في الغرفة قد انخفض إلى 90 ملليبار، والحفاظ على الفراغ لمدة ثلاث دقائق. ثم حرر الفراغ لمدة 45 ثانية. عندما عادت الغرفة إلى الضغط الجوي، افتح الغرفة وأزل النبات المتسلل من الحمام البكتيري.إعادة المصنع إلى غرفة النمو. في يوم التعبير الأقصى ، حصاد الأوراق المتسللة وتجميدها في النيتروجين السائل كما هو موضح سابقا. أولا، حصاد فراغ الزراعية المصفاة دلتا 87 GAD65mut التعبير عن أوراق البنجر الأحمر في ذروة التعبير، وتجميدها في النيتروجين السائل.lyophilize الأوراق المجمدة في ناقص 50 درجة مئوية و 0.04 ملليبار لمدة 72 ساعة. ثم تخزينها في ناقص 80 درجة مئوية. عندما تكون على استعداد للمضي قدما، طحن الأوراق إلى مسحوق ناعم وتخزينها في درجة حرارة الغرفة في حاوية مختومة مع هلام السيليكا لاستبعاد الرطوبة.لمحاكاة الهضم المعدة، تزن 100 ملليغرام من تجميد الأرض ناعما المجففة أوراق البنجر الأحمر، و resuspend في ستة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. استخدم ستة حمض هيدروكلوريك مولي لضبط درجة الحموضة العينة إلى اثنين. إضافة أربعة ملليغرام لكل ملليلتر البيبسين من الغشاء المخاطي في المعدة المسامية، و 10 ملليمولر حمض الهيدروكلوريك، للحصول على تركيز البيبسين النهائي من ملليغرام واحد لكل ملليلتر.هز العينة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 120 دقيقة. بعد ذلك، استخدم هيدروكسيد الصوديوم لضبط درجة هيدروكسيد الH عينة إلى ثمانية وactivate البيبسين. نقل 750 ميكرولتر aliquots من كل عينة إلى أنابيب microcentrifuge، والطرد المركزي aliquots في 20،000 مرات G وعلى أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.جمع كل افرا على حدة، وإعادة تعليق كل بيليه في حجم واحد فائقة من العازلة التحميل. ثم تحليل كل من فائقة وبيليه resuspended من قبل تحليل لطخة الغربية. لتحليل سلامة الخلية، وإعداد عينتين من 100 ملليغرام من أوراق البنجر الأحمر المجففة تجميد الأرض ناعما، و resuspend على حد سواء في ستة ملليلتر من برنامج تلفزيوني.استخدم ستة حمض هيدروكلوريك مولي لضبط درجة الحموضة لعينة واحدة إلى اثنين. صافح كلتا العينتين على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 120 دقيقة. ثم aliquot 750 ميكرولترات من كل عينة إلى أنابيب microcentrifuge.جهاز طرد مركزي في 20،000 مرة G و 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. جمع كل افرا على حدة، وإعادة تعليق كل بيليه في حجم واحد فائقة من العازلة التحميل. ثم تحليل كل من فائقة وبيليه resuspended من قبل تحليل لطخة الغربية.أولاً، تزن 100 ملليغرام من أوراق البنجر الأحمر المجففة بالتجميد الأرضي ناعماً، ثم تُعَد في ثمانية ملليلترات من برنامج تلفزيوني معقم. دوامة لمدة دقيقة واحدة. لوحة ملليلتر واحد من كل تجانس ورقة المجففة تجميد في واحدة من خمسة وسائل الإعلام LB انتقائية أعدت.احتضان لوحات في 28 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام. بعد ذلك، عد مستعمرات البكتيريا الزراعية التي تزرع على كل لوحة، وحساب الشحنة البكتيرية المتبقية كعدد وحدات تشكيل مستعمرة لكل ملليلتر من متجانس الأوراق المجففة بالتجميد. في هذا العمل، يتم تطوير لقاح عن طريق الفم في الأنسجة النباتية الصالحة للأكل.يتم نقش النباتات البنجر والسبانخ الحمراء يدوياً بالتصفية الزراعية مع تعليق A.tumefaciens تحمل ناقلات التعبير المؤتلفة EGFP ، ويتم تصور تعبير البروتين الفلورسنت من خلال تحليل البقعة الغربية ويتم قياسه كميًا تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. يتميز نظام البنجر الأحمر بتعبير EGFP أعلى ، حيث يصل إلى ما يقرب من 544 ميكروغرامًا لكل غرام من وزن الأوراق الطازجة في تسعة أيام بعد العدوى ، في حين أن السبانخ وصلت فقط إلى مستوى أقصى يبلغ حوالي 113.4 ميكروغرامًا لكل غرام من وزن الأوراق الطازجة في 11 يومًا بعد العدوى. وبسبب هذا، يتم تحديد البنجر الأحمر كمضيف التعبير لكافة التجارب اللاحقة.ثم يتم اختراق النباتات الفراغ مع تعليق A.tumefaciens. بعد استخراج TSP من أوراق الترشيح الزراعي، يتم تحليل العينات بواسطة لطخة غربية، ويتم قياس كمية البروتين المؤتلف نسبيا من خلال تحليل قياس الكثافة. وأخيراً، يتم تقييم بارامترات تطوير لقاح فموي محتمل.كما رأينا هنا، يُنظر إلى البروتين المستهدف على أنه مستقر بعد عملية التجميل. يتم محاكاة هضم المعدة عن طريق إضافة إنزيم المعدة البيبسين المسامي إلى المواد المجففة بالتجميد ، إما إلى تركيز نهائي قدره ملليغرام واحد لكل ملليلتر ، أو نسبة 1 إلى 20 ، إلى TSP. كلا ظروف العلاج الهضمي يؤدي إلى تدهور البروتين المؤتلف.عدم وجود إشارة محددة في عينات بيليه بعد هضم البيبسين تشير إلى أنه بعد تجميد التجفيف، فقدت الخلايا النباتية سلامتها، وهذا أدى إلى تدهور البروتين المستهدف. وينبغي تكييف الإجراء بعناية مع الأنواع النباتية فيما يتعلق بالتسرب الفراغي والبروتين المؤتلف المستهدف فيما يتعلق بتحليل الدورة الزمنية. ويمكن أيضاً استخدام الإجراء البرهاني لإنتاج الأدوية البيولوجية المعدة للتسليم الفموي، مثل اللقاح والأجسام المضادة.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

إنشاء ثنائي الأبعاد ركائز منقوشة على الحبس البروتين والخلايا

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

الخلوية لاستخراج الدهن المستهدفة التخفيف النظائر المستقرة تحليل السائل الطيف اللوني القداس

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

خلق عابر المسامات غشاء الخلية باستخدام طابعة نافثة للحبر القياسية

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

الجلد الوشم ونهجا جديدا للتسليم اللقاحات DNA

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

توصيف النظم المعقدة باستخدام تصميم التجارب النهج: عابر التعبير البروتين في التبغ كدراسة حالة

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

التعبير، والعزلة، وتنقية القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان البيروكسيديز البروتينات لتجديد الأنسجة العصبية

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

تسيطر البيئة الميكروية للتحقيق ديناميكية الدم الحمراء تجميع خلية

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

تلفيق من Functionalized المغناطيسي البكتيرية Nanocellulose مع أكسيد الحديد النانوية

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

ميكروفلويديك تدفق الدوائر عن طريق الدم تم اعادة تشكيل لنموذج الإرقاء وصفائح الدم نقل<em&gt; في المختبر</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

تطوير عضوي نموذج متعددة الخلايا ثلاثي الأبعاد من الأمعاء الغشاء المخاطي الإنسان نمت في ظل الجاذبية

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...