Name: transient expression in red beet of a biopharmaceutical candidate vaccine for type-1 diabetes
Uploaded: 2019-03-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af det fællesprojekt "Brug af planter til produktion af en autoimmun diabetes spiselige vaccine (eDIVA)" (projekt-ID: 891854) finansieret af Universitet Verona inden for rammerne af indkaldelsen 2014.

1. røde sukkerroer og spinat dyrkning
<ol><li>Vokse rødbede (B. vulgaris cv Moulin Rouge) og spinat (S. oleracea cv Industria) planter i et vækst kammer, med 150 µE af lysintensitet, 65% relativ luftfugtighed, 12 h lys/mørke cyklus på 23/21 ° C, hhv.</li>
	<li>Efter frø spiring, befrugte planter to gange om ugen med en 1 g/L opløsning af et kommercielt tilgængelige gødning (Tabel af materialer). Brug fem uger gamle spinat og seks uger gamle rødbede planter til agroinfiltra...

<ol>
	<li>Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edible+plants+for+oral+delivery+of+biopharmaceuticals.">Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).</li><li>Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+recombinant+protein+production+in+different+biofactories:+The+green+perspective.">Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective.</a> BioMed Research International. , (2014).</li><li>Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+recovery+of+recombinant+proteins+from+plants.">Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants.</a> Biotechnology Progress. 20 (4), 1001-1014 (2004).</li><li>Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-made+pharmaceuticals+for+the+prevention+and+treatment+of+autoimmune+diseases:+Where+are+we?.">Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we?.</a> Expert Review of Vaccines. 9 (8), 957 (2010).</li><li>Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transfection+of+viral+replicons+for+efficient+transient+expression+in+plants.">Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants.</a> Nature Biotechnology. 23, (2005).</li><li>Ludvigsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+treatment+of+type+1+diabetes+in+childhood.">Update on treatment of type 1 diabetes in childhood.</a> Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).</li><li>Merlin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+GAD65+production+in+plants+using+the+MagnICON+transient+expression+system:+Optimization+of+upstream+production+and+downstream+processing.">Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing.</a> Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).</li><li>Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Analysis+of+Recombinant+Protein+Expression+in+Different+Biofactories:+Bacteria,+Insect+Cells+and+Plant+Systems.">A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).</li><li>Dal Santo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+terroir+concept+interpreted+through+grape+berry+metabolomics+and+transcriptomics.">The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics.</a> Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfiltration+as+an+effective+and+scalable+strategy+of+gene+delivery+for+production+of+pharmaceutical+proteins.">Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins.</a> Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).</li><li>Bertini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+type-1+diabetes+vaccine+candidate+using+edible+plants+expressing+a+major+autoantigen.">Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen.</a> Frontiers in Plant Science. 9, (2018).</li><li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+planta+expression+of+the+human+islet+autoantigen+glutamic+acid+decarboxylase+(GAD65).">Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65).</a> Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).</li><li>Sep&#250;lveda-Jim&#233;nez, G., Rueda-Ben&#237;tez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+red+beet+(Beta+vulgaris)+UDP-glucosyltransferase+gene+induced+by+wounding,+bacterial+infiltration+and+oxidative+stress.">A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress.</a> Journal of Experimental Botany. 56, (2005).</li><li>Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+for+enhancing+oral+bioavailability+of+peptides+and+proteins.">Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins.</a> International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).</li><li>. Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction Available from: <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction">https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction</a> (2015)</li><li>Kamei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexation+hydrogels+for+intestinal+delivery+of+interferon+beta+and+calcitonin.">Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin.</a> Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).</li><li>Tuesca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexation+hydrogels+for+oral+insulin+delivery:+effects+of+polymer+dosing+on+in+vivo+efficacy.">Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).</li><li>Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+yield+of+recombinant+pharmaceutical+proteins+in+plants.">Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants.</a> Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).</li><li>Dhama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-based+oral+vaccines+for+human+and+animal+pathogens+&#8211;+a+new+era+of+prophylaxis:+current+and+future+perspectives.">Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens &#8211; a new era of prophylaxis: current and future perspectives.</a> Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447, 75-93 (2013).</li><li>Hefferon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconceptualizing+cancer+immunotherapy+based+on+plant+production+systems.">Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems.</a> Future science. O3, (2017).</li></ol>

I denne undersøgelse viste vi foreløbig analyse for udformningen af en kandidat oral vaccine for autoimmune diabetes. Target proteinet for dette eksperiment var en muteret form for den menneskelige 65 kDa glutamat Decarboxylase, hvilke produktions- og funktionalitet er let påviselige og målbare12. Dens udtryk i forskellige spiselige plantevæv blev formidlet af vektorer5, der mægle et højt niveau af rekombinante protein produktion i en meget kort tidsramme. Udvælgels...

Siden anlægget Molekylærbiologi revolution i 1980 ' erne, kan plante-baserede systemer til produktion af biopharmaceuticals betragtes som et alternativ til traditionelle systemer baseret på mikrobiel og mammale celler1. Planter viser flere fordele frem for traditionelle platforme, med skalerbarhed, omkostningseffektivitet og sikkerhed at blive den mest relevante2. Den rekombinante produkt kan renset fra transformerede plantevæv og derefter administreres, enten parenteralt eller mundtligt og i øvrigt transformeret spiselige plante kan bruges direkte til oral levering. Den mundtlige rute fremmer samtidig slimhinde og systemisk immunitet, og det fjerner behovet for nåle og specialiseret medicinsk personale. Derudover eliminerer oral levering den komplekse downstream behandling, som normalt tegner sig for 80% af de samlede produktionsomkostninger af en rekombinant protein3. Alle disse fordele kan oversættes til besparelser i produktion, levering og arbejdskraft at reducere omkostningerne i forbindelse med hver dosis, gør stoffet overkommelig for de fleste af verdens befolkning.
Flere strategier, både for stabil transformation og forbigående udtryk, var udviklet til fremstilling af rekombinante proteiner i planter. Blandt dem giver en højtydende dekonstrueret plante virus-baseret udtryk system (f.eks. magnICON) overlegen ydeevne fører høje udbytter af rekombinante proteiner over relativt korte tidsfrister4. Mange eksempler på forbigående udtryk ved hjælp af planten virus-baseret udtryk system i Nicotiana benthamiana planter er rapporteret, at være guldstandarden produktion vært. Denne model plante betragtes ikke som en spiselige arter på grund af alkaloider og andre toksiske metabolitter, der er akkumuleret i sine blade.
I dette arbejde, beskriver vi sammenligning mellem to spiselige plante systemer, rødbede (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) og spinat (Spinacea oleracea cv Industria), for at give udtryk for to kandidat 65 kDa isoform af glutaminsyre decarboxylase (GAD65), udført af planten virus-baseret vektorer5. GAD65 er et større autoantigen forbundet til Type 1 Diabetes (T1D) og det er i øjeblikket under efterforskning i humane kliniske forsøg til at forhindre eller forsinke T1D ved at inducere tolerance6. Produktionen af GAD65 i planter er blevet grundigt undersøgt i modellen plantearter som Nicotiana tabacum og N. benthamiana4,5,6,7. Her, beskriver vi brugen af spiselige plantearter til produktion af molekyle i væv, der kan være beregnet til en direkte oral levering. Fra et teknisk synspunkt, vi studeret og valgt system for planten agroinfiltration og spiselige plante platform for GAD65 produktion ved at evaluere forskellige parametre: udtrykket rekombinante protein niveauer, de resterende mikrobielle afgift i anlægget væv beregnet til oral levering, modstanden i GAD65 til gastrisk fordøjelsen og bioækvivalens af de transformerede planter med wild-type.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2-&#956;m Minisart RC4 membrane filters</td>
			<td>Sartorius-Stedim</td>
			<td>17764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8211;mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td>pH 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27221</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td>Toxic &#8211; 0.1 M stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Bacteriological Grade</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0949</td>
			<td>15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-eGFP antibody</td>
			<td>ABCam</td>
			<td>ab290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAD 65/67 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-LHCB2 antibody</td>
			<td>Agrisera</td>
			<td>AS01 003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 &#956;m) Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Guard Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 &#956;m) Guard&#160; Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CalMag Grower</td>
			<td>Peter Excel</td>
			<td>15-5-15</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>C0109</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708370</td>
			<td>ChemiDoc Touch Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5927</td>
			<td>Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence reader</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>&#160;1420-011</td>
			<td>VICTOR Multilabel Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td>15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1758</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 &#956;m) Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC Guard Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 &#956;m) Guard&#160; Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6154</td>
			<td>Do not freeze/thaw too many times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Autosampler</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>System Gold 508 Autosampler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>System Gold 128 Solvent Module HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>24137</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K4000</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol solution</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td>Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizator</td>
			<td>5Pascal</td>
			<td>LIO5P0000DGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectometer</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>&#160; -</td>
			<td>Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk-blocking solution</td>
			<td>Ristora</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>3 % in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282</td>
			<td>&#160;Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulase membrane</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase substrate ECL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2235</td>
			<td>Light sensitive material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Vacuum Press</td>
			<td>VWR</td>
			<td>111400000098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643</td>
			<td>Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643</td>
			<td>Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>R0146</td>
			<td>Toxic &#8211; 25 mg/mL stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium dodecyl sulphate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metabisulphite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7681-57-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator system</td>
			<td>Soltec</td>
			<td>090.003.0003</td>
			<td>Sonica&#174; 2200 MH; frequency 40 khz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent fixed 300-&#181;L insert glass tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11573680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>TRP03</td>
			<td>10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Heto</td>
			<td>3878 F1-3</td>
			<td>Speed-vac System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>39253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y1333</td>
			<td>5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient expression in red beet of a biopharmaceutical candidate vaccine for type-1 diabetes

Plante molekylært landbrug er brugen af planter til at producere molekyler af interesse. I dette perspektiv, kan planter bruges både som bioreaktorer til produktion og efterfølgende rensning af det endelige produkt og for den direkte mundtlige levering af heterolog proteiner ved brug af spiselige plantearter. I dette arbejde præsenterer vi udviklingen af en kandidat oral vaccine mod Type 1 Diabetes (T1D) i spiselige plante systemer ved hjælp af dekonstrueret plante virus-baseret rekombinant DNA-teknologi, leveret med vakuum infiltration. Vores resultater viser, at en rødbede er en passende vært for forbigående udtryk for en menneskelig afledte autoantigen knyttet til T1D, anses for at være en lovende kandidat som en T1D vaccine. Bladene producerer autoantigen blev grundigt karakteriseret for deres modstand mod gastrisk fordøjelse, for tilstedeværelsen af resterende bakteriel afgift og for deres sekundære metaboliske profil, giver en oversigt over processen for den potentielle anvendelse af planter til direkte oral levering af en heterolog protein. Vores analyse viste næsten fuldstændig nedbrydning af den frysetørrede kandidat oral vaccine efter en simuleret gastrisk fordøjelse, tyder på, at en indkapsling strategi til fremstilling af plantebaserede GAD vaccine er påkrævet.

I dette arbejde præsenteres for udviklingen af en oral vaccine i spiselige plantevæv arbejdsgang. Fokus for dette arbejde er udtryk for et mål protein i en spiselig vært plantearter og karakterisering af den potentielle oral vaccine.
Det første trin involveret evaluering af egnetheden af plante virus-baseret udtrykket teknologi til at producere rekombinante proteiner i spiselige plante systemer. Til dette formål, vi først...

Watch this Scientific Journal Video about Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes at JoVE.com

Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes

Forbigående udtryk i rødbede biofarmaceutiske kandidat vaccine til Type 1 Diabetes

Vi præsenterer her, en protokol for at producere en oral vaccine kandidat mod Type 1 diabetes i en spiselig plante.

Plant molecular farming is the use of plants to produce molecules of interest. In this perspective, plants may be used both as bioreactors for the ...

Blandt de forskellige strategier for produktion af rekombinant protein i planter, giver det dekonstruerede plantebaserede VERS-udtryk overlegen ydeevne, hvilket fører til høje udbytter over en relativ kort tidsramme. Replikering af denne teknologi til fremstilling af en oral vaccine rummer et stort potentiale for at blive et alternativ til konventionelle vacciner i den nærmeste fremtid. Lyophilized red roe blade forbigående omdannet akkumulerer en mængde foto antigener egnet til oral tolerance induktion i type et diabetes forebyggelse.Denne forsøgsprotokol kan udvides til at omfatte mange forskellige spiselige arter efter en vurdering fra sag til sag af rekombinant proteinakkumulering. Demonstration af proceduren vil være Edoardo Bertini, Mattia Santoni, Anna Cuccurullo, og Roberta Zampieri. For at begynde denne procedure, vokse rødbeder og spinat planter i et vækstkammer som skitseret i tekstprotokollen.Efter frø spiring, befrugte planterne to gange om ugen med en opløsning af kommercielt tilgængelige gødning i en koncentration på et gram per liter. Brug fem uger gamle spinat og seks uger gamle rødroeplanter til agroinfiltration. Efter konstruktion af planteudtryksvektorer skal de tre A.tumefaciens-transformanter inst 50 milliliter LB-medium indeholdende rifampicin i en koncentration på 50 mikrogram pr. milliliter og vektorspecifikke antibiotika som beskrevet i tekstprotokollen.Vokse ved at ryste natten over på 28 grader Celsius. Den næste dag, pellet de bakterielle kulturer ved centrifugering på 4500 gange G i 20 minutter. Pelletsuspendrer pelletet op igen i 100 milliliter infiltrationsbuffer indeholdende 10 millimolar MES og 10 millimolar magnesiumsulfat.Suspensionerne inkuberes ved stuetemperatur i tre timer. Bland et tilsvarende volumen af en bakteriel suspension, der indeholder et af de moduler, der vises her, med de fem primære modul og integrase modulet. Brug en sprøjte uden en nål til at tage fem milliliter af suspensionsblandingen ud.Tryk sprøjtens spids mod undersiden af plantebladet, mens du påstÃ tryk forsigtigt trykkes til den anden side af bladet. Infiltrere de første tre helt udvidede blade, startende fra toppen, for hver plante. Mærk de agroinfilterede blade med papirmærket på bladstammen.Derefter returnere planterne til vækstkammeret under standardbetingelser. På dag fire til 14 post-infektion, indsamle agroinfiltrated blade og fryse dem i flydende kvælstof. Opbevar dette plantevæv på minus 80 grader Celsius.For det første, separat dyrke de tre A.tumefaciens transformanter i 50 milliliter LB medium indeholdende rifampicin ved en koncentration af 50 mikroliter pr milliliter, og passende vektor-specifikke antibiotika ved at ryste natten over ved 28 grader Celsius. Den næste dag, pellet de bakterielle kulturer ved centrifugering på 4500 gange G i 20 minutter. Opspræn din pellet i 1 liter infiltrationsbuffer til en OD600 på 0,35, og inkuber suspensionerne ved stuetemperatur i tre timer.Derefter tilsættes 0,01% af vaskemidlet til hver suspension. Bland et tilsvarende volumen af en bakteriel suspension, der indeholder et af de moduler, der vises her med de fem prime modul og integrase modulet. Sæt en seks uger gammel rød roe plante i holderen.Invertere indehaveren og placere den på toppen af et bægerglas, der indeholder to liter af en infiltration bad til at nedsænke bladene i infiltration suspension. Derefter overføres infiltrationsbadet med den neddykkede plante til infiltrationskammeret og luk det. Tænd for vakuumpumpen og åbn vakuumindtagsventilen på infiltrationskammeret.Når trykket i kammeret er faldet til 90 millibar, opretholdes vakuumet i tre minutter. Slip derefter støvsugeren i 45 sekunder. Når kammeret er vendt tilbage til atmosfærisk tryk, åbne kammeret og fjerne infiltreret plante fra bakteriebadet.Returner anlægget til vækstkammeret. På dagen for maksimal udtryk, høste de infiltrerede blade og fryse dem i flydende kvælstof som tidligere beskrevet. Først høst vakuum agroinfiltrated delta 87 GAD65mut udtrykke røde roer blade på udtrykket peak, og fryse dem i flydende nitrogen.Lyophilize de frosne blade på minus 50 grader Celsius og på 0,04 millibar i 72 timer. Derefter gemme dem på minus 80 grader Celsius. Når du er klar til at fortsætte, male bladene til et fint pulver og opbevares ved stuetemperatur i en forseglet beholder med silica gel for at udelukke fugt.For gastrisk fordøjelse simulering, vejer 100 milligram af fint jorden frysetørrede røde roer blade, og resuspend det i seks milliliter PBS. Der anvendes seks molarschlorsyre til at justere prøven pH til to. Der tilsættes fire milligram pr. milliliter pepsin fra porcin gastrisk slimhinder og 10 millimolarchlorsyre for at opnå en endelig pepsinkoncentration på et milligram pr. milliliter.Shak prøven ved 37 grader Celsius i 120 minutter. Dernæst skal du bruge natriumhydroxid til at justere prøven pH til otte og inaktivere pepsin. Overfør 750 mikroliter aliquots af hver prøve til mikrocentrifuge rør, og centrifuge aliquots ved 20, 000 gange G og ved fire grader Celsius i 20 minutter.Saml hver supernatant separat, og resuspend hver pellet i en supernatant volumen af lastning buffer. Derefter analysere både supernatant og resuspended pellet ved Western blot analyse. Til celleintegritetsanalysen skal der udarbejdes to prøver på 100 mg de fintfrysede rødbederblade, og der skal resuspenderes både i seks milliliter PBS.Brug seks molar saltsyre til at justere pH-slutningen af en prøve til to. Ryst begge prøver ved 37 grader Celsius i 120 minutter. Derefter aliquot 750 mikroliter af hver prøve til mikrocentrifuge rør.Centrifuge ved 20, 000 gange G og ved 4 grader Celsius i 20 minutter. Saml hver supernatant separat, og resuspend hver pellet i en supernatant volumen af lastning buffer. Derefter analysere både supernatant og resuspended pellet ved Western blot analyse.Først vejer 100 milligram af fint jorden frysetørrede rødbede blade, og resuspend det i otte milliliter sterile PBS. Vortex i et minut. Plade en milliliter af hvert frysetørret blad homogenat i et af de fem forberedte selektive LB-medier.Inkuber pladerne ved 28 grader Celsius i tre dage. Derefter tælles de agrobacteriumkolonier, der dyrkes på hver plade, og den resterende bakterieladning beregnes som antallet af kolonidannende enheder pr. milliliter af det frysetørrede blad homogenat. I dette arbejde, en oral vaccine er udviklet i spiselige plantevæv.Rødroer og spinatplanter agroinfiltreres manuelt med suspensioner af A.tumefaciens med EGFP rekombinant ekspressionsvektorer, og fluorescerende proteinudtryk visualiseres ved vestlig blotanalyse og kvantificeres under UV-lys. Det røde roesystem er karakteriseret ved et højere EGFP-udtryk, der når op på ca. 544 mikrogram pr. gram frisk bladvægt ved ni dage efter infektionen, mens spinaten kun nåede et maksimumsniveau på ca. 113,4 mikrogram pr. gram frisk bladvægt på 11 dage efter infektionen. Derfor vælges rødbederen som udtryksvært for alle efterfølgende eksperimenter.Planter er derefter vakuum infiltreret med en A.tumefaciens suspension. Efter TSP-ekstraktionen fra agroinfiltreringsblade analyseres prøverne af Western blot, og det rekombinant protein kvantificeres relativt ved en densitometrianalyse. Endelig evalueres parametrene for udvikling af en potentiel oral vaccine.Som det ses her, er målet protein ses at være stabil efter lyophilization proces. Gastrisk fordøjelse simuleres ved at tilføje det porcine gastrisk enzym pepsin til frysetørret materiale, enten til en endelig koncentration på en milligram pr. milliliter eller et forhold på 1 til 20 til TSP. Begge fordøjelsesbehandlingsbetingelser resulterer i nedbrydning af det rekombinant protein.Fraværet af et specifikt signal i pellet prøver efter pepsin fordøjelse tyder på, at efter frysetørring, plantecellerne mistet deres integritet, og dette førte til målet protein nedbrydning. Proceduren bør nøje tilpasses plantearten med hensyn til vakuuminfiltration og målkombineringsprotein med hensyn til tidsforløbsanalyse. Demonstrationsproceduren kan også anvendes til fremstilling af biofarmaceutiske lægemidler, der er beregnet til oral levering, f.eks.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Cellular Lipid Ekstraktion for målrettet stabile isotoper Fortynding Liquid Chromatography-massespektrometri Analyse

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Oprettelse Forbigående Cell membranporer Brug en Standard Inkjet printer

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Hud tatovering som en ny tilgang til DNA Vaccine Delivery

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Karakterisering af komplekse systemer ved hjælp af udformning af eksperimenter Fremgangsmåde: Transient Protein Expression i tobak som et casestudie

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Ekspression, isolation og oprensning af opløselige og uopløselige Biotinylerede Proteiner til nervevæv Regeneration

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Kontrolleret Mikrofluid Miljø for Dynamic Undersøgelse af røde blodlegemer Sammenlægning

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

Fremstilling af en funktionaliseret Magnetic Bakteriel Nanocellulose med Iron Oxide Nanopartikler

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikrofluid Flow Chambers Brug Rekonstitueret Blood til Model Hæmostase og trombocytinfusion<em&gt; In vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Udvikling af en flercellet Tre-dimensionel organotypisk Model af menneskelige tarmslimhinden Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...