Name: transient expression in red beet of a biopharmaceutical candidate vaccine for type-1 diabetes
Uploaded: 2019-03-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door het gezamenlijke Project "Het gebruik van planten voor de productie van een auto-immuunziekte diabetes eetbare vaccin (eDIVA)" (Project-ID: 891854) door de Universiteit van Verona, in het kader van de oproep 2014 gefinancierd.

1. de rode bieten en spinazie teelt
<ol><li>Rode biet groeien (B. vulgaris cv Moulin Rouge) en spinazie (S. oleracea cv Industria) planten in een zaal van de groei, met 150 µE van lichtintensiteit, 65% relatieve vochtigheid, 12 h licht/donker cyclus bij 23/21 ° C, respectievelijk.</li>
	<li>Na de ontkieming van zaad, bevrucht de planten twee keer per week met een oplossing van 1 g/L van een commercieel beschikbare kunstmest (Tabel van materialen). Gebruik de vijf weken oude spinazie...

<ol>
	<li>Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edible+plants+for+oral+delivery+of+biopharmaceuticals.">Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).</li><li>Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+recombinant+protein+production+in+different+biofactories:+The+green+perspective.">Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective.</a> BioMed Research International. , (2014).</li><li>Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+recovery+of+recombinant+proteins+from+plants.">Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants.</a> Biotechnology Progress. 20 (4), 1001-1014 (2004).</li><li>Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-made+pharmaceuticals+for+the+prevention+and+treatment+of+autoimmune+diseases:+Where+are+we?.">Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we?.</a> Expert Review of Vaccines. 9 (8), 957 (2010).</li><li>Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transfection+of+viral+replicons+for+efficient+transient+expression+in+plants.">Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants.</a> Nature Biotechnology. 23, (2005).</li><li>Ludvigsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+treatment+of+type+1+diabetes+in+childhood.">Update on treatment of type 1 diabetes in childhood.</a> Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).</li><li>Merlin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+GAD65+production+in+plants+using+the+MagnICON+transient+expression+system:+Optimization+of+upstream+production+and+downstream+processing.">Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing.</a> Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).</li><li>Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Analysis+of+Recombinant+Protein+Expression+in+Different+Biofactories:+Bacteria,+Insect+Cells+and+Plant+Systems.">A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).</li><li>Dal Santo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+terroir+concept+interpreted+through+grape+berry+metabolomics+and+transcriptomics.">The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics.</a> Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfiltration+as+an+effective+and+scalable+strategy+of+gene+delivery+for+production+of+pharmaceutical+proteins.">Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins.</a> Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).</li><li>Bertini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+type-1+diabetes+vaccine+candidate+using+edible+plants+expressing+a+major+autoantigen.">Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen.</a> Frontiers in Plant Science. 9, (2018).</li><li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+planta+expression+of+the+human+islet+autoantigen+glutamic+acid+decarboxylase+(GAD65).">Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65).</a> Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).</li><li>Sep&#250;lveda-Jim&#233;nez, G., Rueda-Ben&#237;tez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+red+beet+(Beta+vulgaris)+UDP-glucosyltransferase+gene+induced+by+wounding,+bacterial+infiltration+and+oxidative+stress.">A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress.</a> Journal of Experimental Botany. 56, (2005).</li><li>Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+for+enhancing+oral+bioavailability+of+peptides+and+proteins.">Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins.</a> International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).</li><li>. Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction Available from: <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction">https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction</a> (2015)</li><li>Kamei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexation+hydrogels+for+intestinal+delivery+of+interferon+beta+and+calcitonin.">Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin.</a> Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).</li><li>Tuesca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexation+hydrogels+for+oral+insulin+delivery:+effects+of+polymer+dosing+on+in+vivo+efficacy.">Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).</li><li>Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+yield+of+recombinant+pharmaceutical+proteins+in+plants.">Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants.</a> Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).</li><li>Dhama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-based+oral+vaccines+for+human+and+animal+pathogens+&#8211;+a+new+era+of+prophylaxis:+current+and+future+perspectives.">Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens &#8211; a new era of prophylaxis: current and future perspectives.</a> Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447, 75-93 (2013).</li><li>Hefferon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconceptualizing+cancer+immunotherapy+based+on+plant+production+systems.">Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems.</a> Future science. O3, (2017).</li></ol>

In deze studie toonden we voorlopige analyse voor het ontwerp van een kandidaat-orale vaccin voor auto-immuunziekte diabetes. De proteïne van de doelgroep voor dit experiment was een gemuteerde vorm van het menselijke 65 kDa glutamaat Decarboxylase, welke productie en functionaliteit zijn dan gemakkelijk waarneembare en meetbare12. De expressie in de weefsels van verschillende eetbare plant was gemedieerd door de vectoren5, die een hoog niveau van de productie van recombin...

Sinds de plant moleculaire biologie revolutie in de jaren 1980, kunnen plant gebaseerde systemen voor de productie van biofarmaceutica worden beschouwd als een alternatief voor traditionele systemen gebaseerd op microbiële en zoogdieren cellen1. Planten display verscheidene voordelen over traditionele platformen, met schaalbaarheid, kosteneffectiviteit en veiligheid wordt de meest relevante2. De recombinante product kan worden gezuiverd van getransformeerde plant weefsel en vervolgens beheerd, ofwel parenteraal of mondeling en, bovendien, getransformeerde eetbare plant direct voor mondelinge levering kan worden gebruikt. Orale toediening bevordert tegelijkertijd mucosal en systemische immuniteit, en het elimineert de noodzaak voor naalden en gespecialiseerde medisch personeel. Bovendien elimineert mondelinge levering de complexe downstream processing, die normaal goed is voor 80% van de totale productiekosten van een recombinant eiwit3. Al deze voordelen kunnen worden vertaald in besparingen in leveringen, productie en arbeid reduceert de kosten van elke dosis, waardoor de drug betaalbaar voor de meeste van de wereldbevolking.
Verschillende strategieën, zowel voor stabiele transformatie en voorbijgaande expressie, werden ontwikkeld voor de productie van recombinante eiwitten in planten. Onder hen biedt een hoog rendement gedeconstrueerd plant virus gebaseerde expressie systeem (bijvoorbeeld magnICON) superieure prestaties leidt hoge opbrengsten van recombinante eiwitten over relatief korte tijdschalen4. Vele voorbeelden van voorbijgaande expressie met behulp van de plant virus gebaseerde expressie systeem in Nicotiana benthamiana planten worden gerapporteerd, wordt de goudstandaard productie host. Deze plant model wordt echter niet beschouwd als een eetbare soorten als gevolg van de alkaloïden en andere giftige metabolieten die zijn verzameld in zijn bladeren.
In dit werk, beschrijven we de vergelijking tussen twee eetbare plant systemen, rode biet (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) en spinazie (oleracea Spinacea cv Industria), voor de expressie van twee kandidaat-vormen van de isovorm 65 kDa van glutaminezuur decarboxylase (GAD65), uitgevoerd door de plant virus gebaseerde vectoren5. GAD65 is een grote autoantigen geassocieerd met Type 1 Diabetes (T1D) en het wordt momenteel onderzocht in klinische testen te voorkomen of vertragen T1D door inducerende tolerantie6. De productie van GAD65 in planten is uitgebreid onderzocht bij model plantensoorten als Nicotiana tabacum en N. benthamiana4,5,6,7. Hier beschrijven we het gebruik van eetbare planten voor de productie van de molecule in weefsels die kunnen worden bedoeld voor een mondelinge bericht direct te bezorgen. Vanuit een technisch oogpunt, we onderzocht en geselecteerd van het systeem voor agroinfiltration van de plant en de eetbare plant-platform voor de productie van GAD65 met een evaluatie van verschillende parameters: de recombinant eiwit expressie niveaus, de resterende microbiële lading in plant weefsels bedoeld voor mondelinge levering, de weerstand van GAD65 naar de maag spijsvertering, en de biologische equivalentie van de getransformeerde planten met de wild-type.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2-&#956;m Minisart RC4 membrane filters</td>
			<td>Sartorius-Stedim</td>
			<td>17764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8211;mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td>pH 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27221</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td>Toxic &#8211; 0.1 M stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Bacteriological Grade</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0949</td>
			<td>15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-eGFP antibody</td>
			<td>ABCam</td>
			<td>ab290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAD 65/67 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-LHCB2 antibody</td>
			<td>Agrisera</td>
			<td>AS01 003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 &#956;m) Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Guard Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 &#956;m) Guard&#160; Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CalMag Grower</td>
			<td>Peter Excel</td>
			<td>15-5-15</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>C0109</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708370</td>
			<td>ChemiDoc Touch Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5927</td>
			<td>Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence reader</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>&#160;1420-011</td>
			<td>VICTOR Multilabel Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td>15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1758</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 &#956;m) Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC Guard Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 &#956;m) Guard&#160; Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6154</td>
			<td>Do not freeze/thaw too many times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Autosampler</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>System Gold 508 Autosampler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>System Gold 128 Solvent Module HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>24137</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K4000</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol solution</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td>Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizator</td>
			<td>5Pascal</td>
			<td>LIO5P0000DGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectometer</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>&#160; -</td>
			<td>Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk-blocking solution</td>
			<td>Ristora</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>3 % in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282</td>
			<td>&#160;Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulase membrane</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase substrate ECL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2235</td>
			<td>Light sensitive material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Vacuum Press</td>
			<td>VWR</td>
			<td>111400000098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643</td>
			<td>Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643</td>
			<td>Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>R0146</td>
			<td>Toxic &#8211; 25 mg/mL stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium dodecyl sulphate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metabisulphite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7681-57-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator system</td>
			<td>Soltec</td>
			<td>090.003.0003</td>
			<td>Sonica&#174; 2200 MH; frequency 40 khz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent fixed 300-&#181;L insert glass tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11573680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>TRP03</td>
			<td>10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Heto</td>
			<td>3878 F1-3</td>
			<td>Speed-vac System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>39253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y1333</td>
			<td>5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient expression in red beet of a biopharmaceutical candidate vaccine for type-1 diabetes

Plant moleculaire landbouw is het gebruik van planten voor de productie van moleculen van belang. In dit perspectief moet kunnen planten gebruikt worden als bioreactoren voor de productie en de daaropvolgende zuivering van het eindproduct en de directe mondelinge levering van heterologe eiwitten bij het gebruik van eetbare plantensoorten. In dit werk presenteren wij de ontwikkeling van een kandidaat-orale vaccin tegen Type 1 Diabetes (T1D) in de eetbare plant-systemen die gebruikmaken van gedeconstrueerd plant virus gebaseerde recombinant DNA-technologie, geleverd met vacuüm infiltratie. Onze resultaten tonen aan dat een rode biet een geschikte gastheer voor de voorbijgaande expressie van een mens afgeleide autoantigen gekoppeld aan T1D is, beschouwd als een veelbelovende kandidaat als een T1D vaccin. Bladeren produceren de autoantigen werden grondig gekenmerkt voor hun verzet tegen de maag spijsvertering, de aanwezigheid van residuele bacteriële lading en hun secundaire metabole profiel, met een overzicht van het productie proces voor de potentiële gebruik van planten voor de directe mondelinge aflevering van een heteroloog eiwit. Onze analyse toonde bijna volledige afbraak van het gevriesdroogd kandidaat-orale vaccin na een gesimuleerde maag spijsvertering, suggereert dat een strategie van de inkapseling bij de vervaardiging van de GAD plantgerelateerde vaccin vereist is.

In dit werk, wordt de workflow voor de ontwikkeling van een orale vaccin in eetbare plantaardige weefsels gepresenteerd. De focus van dit werk is de uitdrukking van een doel-proteïne in een eetbare host plantensoorten en de karakterisatie van het potentiële orale vaccin.
De eerste stap bij de beoordeling van de geschiktheid van de plant expressie virus gebaseerde technologie voor de productie van recombinante eiwitten in eetba...

Watch this Scientific Journal Video about Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes at JoVE.com

Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes

Voorbijgaande expressie in rode biet van een biofarmaceutische kandidaat vaccin voor Type 1 Diabetes

Hier presenteren we een protocol voor de productie van een kandidaat van de orale vaccin tegen Type 1 diabetes in een eetbare plant.

Plant molecular farming is the use of plants to produce molecules of interest. In this perspective, plants may be used both as bioreactors for the ...

Onder de verschillende strategieën voor de productie van recombinant eiwit in planten, de gedeconstrueerde plantaardige VERS expressie biedt superieure prestaties, wat leidt tot hoge opbrengsten over een relatief kort tijdsbestek. Replicatie van deze technologie voor de productie van een oraal vaccin heeft een groot potentieel om in de nabije toekomst een alternatief te worden voor conventionele vaccins. Lyophilized rode bieten bladeren tijdelijk getransformeerd accumuleert een hoeveelheid foto antigenen geschikt voor orale tolerantie inductie in type een diabetes preventie.Dit experimentele protocol kan worden uitgebreid tot veel verschillende eetbare soorten na een beoordeling van recombinant eiwitaccumulatie per geval. Het demonstreren van de procedure zal Edoardo Bertini, Mattia Santoni, Anna Cuccurullo, en Roberta Zampieri. Om met deze procedure te beginnen, kweek je rode bieten- en spinazieplanten in een groeikamer zoals beschreven in het tekstprotocol.Bevrucht de planten na zaadkieming twee keer per week met een oplossing van commercieel verkrijgbare meststof met een concentratie van één gram per liter. Voor agro-infiltratie, gebruik maken van vijf weken oude spinazie en zes weken oude rode bieten planten. Na de bouw van de plantenexpressievectoren inent u de drie Transformatoren van A.tumefaciens in 50 milliliter LB-medium met rifampicine bij een concentratie van 50 microgram per milliliter en vectorspecifieke antibiotica zoals beschreven in het tekstprotocol.Groeien door schudden 's nachts op 28 graden Celsius. De volgende dag, pellet de bacteriële culturen door centrifugeren op 4500 keer G gedurende 20 minuten. Resuspend de pellet in 100 milliliter infiltratie buffer met 10 millimolar MES en 10 millimolar magnesiumsulfaat.De suspensies drie uur lang op kamertemperatuur uitbroeden. Meng een gelijk volume van een bacteriële suspensie met een van de hier getoonde modules, met de vijf prime module en de integrase module. Met behulp van een spuit zonder naald, neem vijf milliliter van de schorsing mix.Druk de punt van de spuit tegen de onderkant van het plantenblad terwijl u de druk zachtjes tegenzet aan de andere kant van het blad. Infiltreren in de eerste drie volledig uitgebreide bladeren, vanaf de top, voor elke plant. Label de agroinfiltrated bladeren met het papieren label op de bladstengel.Breng de planten vervolgens onder standaardomstandigheden terug naar de groeikamer. Op dag vier tot 14 na infectie, verzamel de agro-geïnfiltreerd bladeren en bevries ze in vloeibare stikstof. Bewaar dit plantenweefsel op min 80 graden Celsius.Ten eerste, afzonderlijk groeien de drie A.tumefaciens transformatoren in 50 milliliter LB medium met rifampicin bij een concentratie van 50 microliter per milliliter, en passende vector-specifieke antibiotica door schudden 's nachts op 28 graden Celsius. De volgende dag, pellet de bacteriële culturen door centrifugeren op 4500 keer G gedurende 20 minuten. Resuspend de pellet in 1 liter infiltratie buffer tot een OD600 van 0,35, en incubeer de schorsingen bij kamertemperatuur gedurende drie uur.Voeg vervolgens 0,01% van het wasmiddel toe aan elke suspensie. Meng een gelijk volume van een bacteriële suspensie met een van de hier getoonde modules met de vijf priemmodule en de integrase module. Steek een zes weken oude rode bietenplant in de houder.Omkeren van de houder en plaats het op de top van een beker met twee liter van een infiltratie bad om de bladeren onder te dompelen in de infiltratie suspensie. Breng hierna het infiltratiebad met de ondergedompelde installatie naar de infiltratiekamer en sluit het. Zet de vacuümpomp aan en open de vacuüminlaatklep op de infiltratiekamer.Zodra de druk in de kamer is gedaald tot 90 millibar, moet u het vacuüm gedurende drie minuten behouden. Laat het vacuüm vervolgens 45 seconden los. Wanneer de kamer is teruggekeerd naar atmosferische druk, open de kamer en verwijder de geïnfiltreerde plant uit het bacteriële bad.Breng de plant terug naar de groeikamer. Oogst op de dag van maximale expressie de geïnfiltreerde bladeren en bevries ze in vloeibare stikstof zoals eerder beschreven. Oogst eerst de vacuüm agroinfiltrated delta 87 GAD65mut die rode bietenbladeren uitdrukt op de expressiepiek en bevries ze in vloeibare stikstof.Lyophilize de bevroren bladeren op min 50 graden Celsius en op 0,04 millibar gedurende 72 uur. Bewaar ze dan bij min 80 graden Celsius. Wanneer u klaar bent om verder te gaan, maal de bladeren tot een fijn poeder en bewaar bij kamertemperatuur in een verzegelde container met silicagel om het vocht uit te sluiten.Voor de maagvertering simulatie, wegen 100 milligram van de fijn gemalen gevriesdroogde rode bieten bladeren, en resuspend het in zes milliliter PBS. Gebruik zes molaire zoutzuur om het monster pH aan te passen aan twee. Voeg vier milligram per milliliter pepsine van varkens maagslijmvlies, en 10 millimolar zoutzuur, om een definitieve pepsine concentratie van een milligram per milliliter te verkrijgen.Schud het monster op 37 graden Celsius gedurende 120 minuten. Gebruik vervolgens natriumhydroxide om de pH van het monster aan te passen tot acht en de pepsine te inactiveren. Breng 750 microliter aliquots van elk monster over naar microcentrifugebuizen en vercentrifugeer de aliquots op 20.000 keer G en gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius.Verzamel elke supernatant afzonderlijk, en resuspend elke pellet in een supernatant volume van de lading buffer. Analyseer vervolgens zowel de supernatant als de geresuspended pellet door Western blot analyse. Voor de celintegriteitsanalyse bereidt u twee monsters van 100 milligram van de fijn gemalen gevriesdroogde rode bietenbladeren en resuspend beide in zes milliliter PBS.Gebruik zes molaire zoutzuur om de pH van één monster aan te passen aan twee. Schud beide monsters op 37 graden Celsius gedurende 120 minuten. Dan aliquot 750 microliters van elk monster om microcentrifuge buizen.Centrifuge op 20.000 keer G en bij 4 graden Celsius gedurende 20 minuten. Verzamel elke supernatant afzonderlijk, en resuspend elke pellet in een supernatant volume van de lading buffer. Analyseer vervolgens zowel de supernatant als de geresuspended pellet door Western blot analyse.Weeg eerst 100 milligram van de fijn gemalen gevriesdroogde rode bietenbladeren en zet het opnieuw op in acht milliliter steriele PBS. Vortex voor één minuut. Plaat een milliliter van elk gevriesdroogd bladhomogenaat in een van de vijf bereide selectieve LB-media.Broed de platen drie dagen lang op 28 graden Celsius. Tel hierna de agrobacteriumkolonies die op elke plaat worden geteeld en bereken de resterende bacteriële lading als het aantal kolonievormende eenheden per milliliter van het gevriesdroogde bladhomogenaat. In dit werk wordt een oraal vaccin ontwikkeld in eetbaar plantweefsel.Rode bieten en spinazieplanten worden handmatig agroinfiltrrated met suspensies van A.tumefaciens die EGFP recombinant expressievectoren dragen, en de fluorescerende eiwitexpressie wordt gevisualiseerd door westerse vlekanalyse en gekwantificeerd onder UV-licht. Het rodebietensysteem wordt gekenmerkt door een hogere EGFP-expressie, die ongeveer 544 microgram per gram vers bladgewicht bereikt na negen dagen na infectie, terwijl de spinazie slechts een maximumniveau van ongeveer 113,4 microgram per gram vers bladgewicht bereikte op 11 dagen na infectie. Hierdoor wordt de rode bieten geselecteerd als expressiehost voor alle volgende experimenten.Planten worden vervolgens vacuüm geïnfiltreerd met een A.tumefaciens suspensie. Na de TSP-extractie uit agro-infiltratiebladeren worden de monsters geanalyseerd door westerse vlek en wordt het recombinant eiwit relatief gekwantificeerd door een densitometrieanalyse. Ten slotte worden de parameters voor de ontwikkeling van een mogelijk oraal vaccin geëvalueerd.Zoals hier te zien, wordt het doeleiwit gezien als stabiel na het lyophilisatieproces. Maagvertering wordt gesimuleerd door het varkenszuurenzym pepsine toe te voegen aan gevriesdroogd materiaal, hetzij tot een uiteindelijke concentratie van één milligram per milliliter, of een verhouding van één tot 20, aan TSP. Beide spijsverteringsbehandelingsvoorwaarden resulteren in afbraak van het recombinant eiwit.De afwezigheid van een specifiek signaal in de pelletmonsters na pepsine spijsvertering suggereren dat na vriesdrogen, de plantencellen hun integriteit verloren, en dit leidde tot de beoogde eiwitafbraak. De procedure moet zorgvuldig worden aangepast aan de plantensoorten met betrekking tot vacuüminfiltratie en het doelrecombinant eiwit met betrekking tot de analyse van de tijdscursus. De demonstrerende procedure kan ook worden gebruikt voor de productie van biofarmaceutische geneesmiddelen die bestemd zijn voor orale levering, zoals vaccin en antilichamen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Het creëren van twee-dimensionale Patterned Substraten voor eiwit en Cell opsluiting

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Cellulaire vetextractie voor gerichte stabiele isotopen Verdunning vloeistofchromatografie-massaspectrometrie Analyse

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Het creëren van voorbijgaande celmembraan poriën met een standaard inkjetprinter

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Huid tatoeëren als een nieuwe benadering voor DNA-vaccin Levering

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Karakterisering van complexe systemen met behulp van de Design of Experiments Aanpak: Transient Eiwitexpressie in tabak als een case study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Expressie, isolatie en zuivering van oplosbare en onoplosbare Biotinylated Eiwitten voor Nerve Tissue Regeneration

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Gecontroleerde Microfluïdische Milieu voor Dynamic Onderzoek van Red Blood Cell Aggregation

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

Fabricage van een gefunctionaliseerd Magnetic Bacterial Nanocellulose met ijzeroxide Nanodeeltjes

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluïdische Flow Chambers behulp Gereconstitueerde Blood voor Model hemostase en bloedplaatjestransfusie<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Ontwikkeling van een Meercellige Driedimensionale Organotypische model van het menselijk darmslijmvlies geteeld onder Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...