Name: transient expression in red beet of a biopharmaceutical candidate vaccine for type-1 diabetes
Uploaded: 2019-03-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das gemeinsame Projekt "Die Verwendung von Pflanzen zur Herstellung von essbaren Impfstoff eine autoimmune Diabetes (eDIVA)" (Projekt-ID: 891854) von der Universität von Verona im Rahmen des Aufrufs 2014 finanziert.

1. rote Rüben und Spinat Anbau
<ol><li>Rote Beete wachsen (B. Vulgaris cv Moulin Rouge) und Spinat (S. Oleracea cv Industria) Pflanzen in einer Kammer Wachstum mit 150 µE Lichtintensität, 65 % Relative Luftfeuchtigkeit, 12 h hell/dunkel-Zyklus am 23/21 ° C, beziehungsweise.</li>
	<li>Nach der Keimung der Samen Düngen der Pflanzen zweimal wöchentlich mit einer Lösung von 1 g/L von einem handelsüblichen Dünger (Table of Materials). Verwenden Sie für Agroinfiltration fünf Woch...

<ol>
	<li>Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edible+plants+for+oral+delivery+of+biopharmaceuticals.">Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).</li><li>Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+recombinant+protein+production+in+different+biofactories:+The+green+perspective.">Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective.</a> BioMed Research International. , (2014).</li><li>Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+recovery+of+recombinant+proteins+from+plants.">Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants.</a> Biotechnology Progress. 20 (4), 1001-1014 (2004).</li><li>Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-made+pharmaceuticals+for+the+prevention+and+treatment+of+autoimmune+diseases:+Where+are+we?.">Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we?.</a> Expert Review of Vaccines. 9 (8), 957 (2010).</li><li>Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transfection+of+viral+replicons+for+efficient+transient+expression+in+plants.">Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants.</a> Nature Biotechnology. 23, (2005).</li><li>Ludvigsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+treatment+of+type+1+diabetes+in+childhood.">Update on treatment of type 1 diabetes in childhood.</a> Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).</li><li>Merlin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+GAD65+production+in+plants+using+the+MagnICON+transient+expression+system:+Optimization+of+upstream+production+and+downstream+processing.">Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing.</a> Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).</li><li>Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Analysis+of+Recombinant+Protein+Expression+in+Different+Biofactories:+Bacteria,+Insect+Cells+and+Plant+Systems.">A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).</li><li>Dal Santo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+terroir+concept+interpreted+through+grape+berry+metabolomics+and+transcriptomics.">The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics.</a> Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfiltration+as+an+effective+and+scalable+strategy+of+gene+delivery+for+production+of+pharmaceutical+proteins.">Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins.</a> Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).</li><li>Bertini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+type-1+diabetes+vaccine+candidate+using+edible+plants+expressing+a+major+autoantigen.">Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen.</a> Frontiers in Plant Science. 9, (2018).</li><li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+planta+expression+of+the+human+islet+autoantigen+glutamic+acid+decarboxylase+(GAD65).">Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65).</a> Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).</li><li>Sep&#250;lveda-Jim&#233;nez, G., Rueda-Ben&#237;tez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+red+beet+(Beta+vulgaris)+UDP-glucosyltransferase+gene+induced+by+wounding,+bacterial+infiltration+and+oxidative+stress.">A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress.</a> Journal of Experimental Botany. 56, (2005).</li><li>Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+for+enhancing+oral+bioavailability+of+peptides+and+proteins.">Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins.</a> International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).</li><li>. Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction Available from: <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction">https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction</a> (2015)</li><li>Kamei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexation+hydrogels+for+intestinal+delivery+of+interferon+beta+and+calcitonin.">Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin.</a> Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).</li><li>Tuesca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexation+hydrogels+for+oral+insulin+delivery:+effects+of+polymer+dosing+on+in+vivo+efficacy.">Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).</li><li>Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+yield+of+recombinant+pharmaceutical+proteins+in+plants.">Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants.</a> Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).</li><li>Dhama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-based+oral+vaccines+for+human+and+animal+pathogens+&#8211;+a+new+era+of+prophylaxis:+current+and+future+perspectives.">Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens &#8211; a new era of prophylaxis: current and future perspectives.</a> Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447, 75-93 (2013).</li><li>Hefferon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconceptualizing+cancer+immunotherapy+based+on+plant+production+systems.">Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems.</a> Future science. O3, (2017).</li></ol>

In dieser Studie haben wir vorläufige Analyse für die Gestaltung der ein Kandidat Schluckimpfung für autoimmune Diabetes gezeigt. Das Zielprotein für dieses Experiment war eine mutierte Form des menschlichen 65 kDa Glutamat-Decarboxylase, welche Produktion und Funktionalität sind leicht nachweisbar und messbar12. Ihren Ausdruck in verschiedenen essbaren Pflanzengeweben wurde durch die Vektoren5, vermittelt die vermitteln eines hohen Maß an rekombinanten Proteinprodukt...

Seit der Pflanze Molekularbiologie Revolution in den 1980er Jahren können als Alternative zu herkömmlichen Systemen basierend auf mikrobielle und Säugetier-Zellen1pflanzliche Systeme für die Produktion von Biopharmazeutika betrachtet werden. Pflanzen zeigen mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Plattformen mit Skalierbarkeit, Wirtschaftlichkeit und Sicherheit werden die relevantesten2. Das rekombinante Produkt kann von transformierte Pflanzengewebe gereinigt und dann verabreicht, entweder parenteral oder oral und darüber hinaus kann transformierten essbare Pflanze direkt zur mündlichen Lieferung verwendet werden. Die orale Verabreichung fördert gleichzeitig Schleimhaut und systemische Immunität, und es entfällt die Notwendigkeit für Nadeln und medizinisches Fachpersonal. Darüber hinaus entfällt mündlichen Lieferung die komplexe Weiterverarbeitung, die normalerweise 80 % der gesamten Herstellungskosten eines rekombinanten Proteins3ausmacht. Diese Vorteile können übersetzt werden Einsparungen in der Produktion, Versorgung und Arbeit, die Reduzierung der Kosten für jede Dosis, das Medikament zu einem Großteil der Weltbevölkerung erschwinglich zu machen.
Für die Produktion rekombinanter Proteine in Pflanzen wurden mehrere Strategien, sowohl für stabile Transformation und transiente Expression entwickelt. Unter anderem bietet eine hochverzinsliche dekonstruiert Virus-basierte Ausdruck der Anlage (z. B. MagnICON) überlegenen Leistung, hohe Erträge von rekombinanten Proteinen über relativ kurze Fristen4führt. Viele Beispiele für transiente Expression mit der Virus-basierte Ausdruck der Anlage in Nicotiana Benthamiana Pflanzen werden gemeldet und den Gold-Standard-Produktions-Server. Allerdings gilt diese Modellpflanze nicht als essbaren Arten aufgrund der Alkaloide und andere toxischen Metaboliten, die in den Blättern angesammelt werden.
In dieser Arbeit beschreiben wir den Vergleich zwischen zwei essbare Anlagensysteme, rote Beete (Beta Vulgaris cv Moulin Rouge) und Spinat (Spinacea Oleracea cv Industria), für den Ausdruck von zwei Kandidaten der 65 kDa Isoform von Glutaminsäure Decarboxylase (GAD65), durchgeführt von der Pflanze, die Virus-basierte Vektoren5. GAD65 ist eine große Autoantigen, Typ 1 Diabetes (T1D) zugeordnet und es wird derzeit in klinischen Studien am Menschen zu verhindern oder zu verzögern T1D durch Induktion Toleranz6untersucht. Die Produktion von GAD65 in Pflanzen wurde ausgiebig im Modell Pflanzenarten wie Nicotiana Tabacum und N. Benthamiana4,5,6,7untersucht. Hier beschreiben wir die Verwendung von essbaren Pflanzen für die Herstellung des Moleküls in Geweben, die für eine mündliche Direktfahrt gemeint sein kann. Aus technischer Sicht wir studierten und das System für die Pflanze Agroinfiltration und essbare Pflanze Plattform für GAD65 Produktion durch die Auswertung verschiedener Parameter ausgewählt: die rekombinante Proteinexpression Ebenen, die mikrobielle Restladung im Werk Gewebe für die mündlichen Lieferung, den Widerstand der GAD65, der Magen Verdauung und die Bioäquivalenz der transformierten Pflanzen mit dem Wildtyp.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2-&#956;m Minisart RC4 membrane filters</td>
			<td>Sartorius-Stedim</td>
			<td>17764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8211;mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td>pH 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27221</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td>Toxic &#8211; 0.1 M stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Bacteriological Grade</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0949</td>
			<td>15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-eGFP antibody</td>
			<td>ABCam</td>
			<td>ab290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAD 65/67 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-LHCB2 antibody</td>
			<td>Agrisera</td>
			<td>AS01 003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 &#956;m) Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Guard Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 &#956;m) Guard&#160; Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CalMag Grower</td>
			<td>Peter Excel</td>
			<td>15-5-15</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>C0109</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708370</td>
			<td>ChemiDoc Touch Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5927</td>
			<td>Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence reader</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>&#160;1420-011</td>
			<td>VICTOR Multilabel Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td>15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1758</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 &#956;m) Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC Guard Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 &#956;m) Guard&#160; Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6154</td>
			<td>Do not freeze/thaw too many times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Autosampler</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>System Gold 508 Autosampler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>System Gold 128 Solvent Module HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>24137</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K4000</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol solution</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td>Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizator</td>
			<td>5Pascal</td>
			<td>LIO5P0000DGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectometer</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>&#160; -</td>
			<td>Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk-blocking solution</td>
			<td>Ristora</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>3 % in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282</td>
			<td>&#160;Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulase membrane</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase substrate ECL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2235</td>
			<td>Light sensitive material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Vacuum Press</td>
			<td>VWR</td>
			<td>111400000098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643</td>
			<td>Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643</td>
			<td>Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>R0146</td>
			<td>Toxic &#8211; 25 mg/mL stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium dodecyl sulphate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metabisulphite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7681-57-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator system</td>
			<td>Soltec</td>
			<td>090.003.0003</td>
			<td>Sonica&#174; 2200 MH; frequency 40 khz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent fixed 300-&#181;L insert glass tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11573680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>TRP03</td>
			<td>10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Heto</td>
			<td>3878 F1-3</td>
			<td>Speed-vac System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>39253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y1333</td>
			<td>5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient expression in red beet of a biopharmaceutical candidate vaccine for type-1 diabetes

Pflanze molekulare Landwirtschaft ist der Einsatz von Anlagen zur Erzeugung von Molekülen von Interesse. Unter diesem Gesichtspunkt können Pflanzen sowohl als Bioreaktoren für die Produktion und die anschliessende Reinigung des Endprodukts und für die direkte mündliche Übergabe heterologen Proteine verwendet werden, wenn essbare Pflanzenarten zu verwenden. In dieser Arbeit präsentieren wir die Entwicklung von einem Kandidaten Schluckimpfung gegen Typ-1-Diabetes (T1D) in essbare Anlagensysteme mit dekonstruierten Pflanze Virus-basierte rekombinanter DNA-Technologie, geliefert mit Vakuum Infiltration. Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine rote Beete geeignet Host für die transiente Expression von einem menschlichen abgeleiteten Autoantigen T1D, als ein viel versprechender Kandidat als T1D Impfstoff zugeordnet ist. Blätter produzieren die Autoantigen zeichneten sich gründlich auf ihre Resistenz gegen Magen Verdauung und für das Vorhandensein der bakteriellen Restladung ihre sekundäre metabolischen Profils, geben einen Überblick über die Prozess-Produktion für den möglichen Einsatz von Anlagen zur mündlichen Direktlieferung von einer heterologen Proteinen. Unsere Analyse ergab fast vollständigen Abbau der gefriergetrockneten Kandidat Schluckimpfung nach einer simulierten Magen Verdauung, was darauf hindeutet, dass eine Kapselung-Strategie bei der Herstellung von pflanzlichen GAD Impfstoff erforderlich ist.

In dieser Arbeit wird der Workflow für die Entwicklung einer Schluckimpfung in essbare Pflanzengeweben vorgestellt. Der Schwerpunkt dieser Arbeit ist der Ausdruck ein Zielprotein in einer essbaren Host Pflanzenarten und die Charakterisierung der potenziellen Schluckimpfung.
Der erste Schritt bestand die Bewertung der Eignung von Virus-basierte Ausdruck Anlagentechnik, rekombinante Proteine in essbare Anlagen zu produzieren. Zu ...

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Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes

Transiente Expression in rote Beete einen biopharmazeutischen Kandidat Impfstoff für Typ-1-Diabetes

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine mündliche Impfstoffkandidaten gegen Diabetes Typ1 in eine essbare Pflanze produzieren.

Plant molecular farming is the use of plants to produce molecules of interest. In this perspective, plants may be used both as bioreactors for the ...

Unter den verschiedenen Strategien zur Produktion von rekombinantem Protein in Pflanzen bietet die dekonstruierte pflanzliche VERS-Expression eine überlegene Leistung, die über einen relativ kurzen Zeitraum zu hohen Erträgen führt. Die Replikation dieser Technologie für die Herstellung eines oralen Impfstoffs birgt ein großes Potenzial, in naher Zukunft zu einer Alternative zu herkömmlichen Impfstoffen zu werden. Lyophilisierte Rote Rübenblätter, die vorübergehend transformiert werden, akkumulieren eine Menge an Photoantigenen, die für die orale Toleranzinduktion bei der Diabetesprävention Typ 1 geeignet sind.Dieses experimentelle Protokoll könnte nach einer Fall-zu-Fall-Bewertung der rekombinanten Proteinakkumulation auf viele verschiedene essbare Arten ausgedehnt werden. Die Demonstration des Verfahrens wird Edoardo Bertini, Mattia Santoni, Anna Cuccurullo und Roberta Zampieri sein. Um dieses Verfahren zu beginnen, wachsen Rote Rüben und Spinatpflanzen in einer Wachstumskammer, wie im Textprotokoll beschrieben.Nach der Samenkeimung die Pflanzen zweimal pro Woche mit einer Lösung aus handelsüblichem Dünger in einer Konzentration von einem Gramm pro Liter düngen. Für die Agroinfiltration fünf Wochen alten Spinat und sechs Wochen alte Rote-Bete-Pflanzen verwenden. Nach dem Aufbau der Pflanzenexpressionsvektoren impfen Sie die drei A.tumefaciens-Transformationsmittel in 50 MilliliterLB-Medium, das Rifampicin in einer Konzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter und vektorspezifische Antibiotika enthält, wie im Textprotokoll beschrieben.Wachsen Sie durch Schütteln über Nacht bei 28 Grad Celsius. Am nächsten Tag pellet die Bakterienkulturen durch Zentrifugieren bei 4500 mal G für 20 Minuten. Setzen Sie das Pellet in 100 Milliliter infiltrationspuffer mit 10 Millimolar MES und 10 Millimolar Magnesiumsulfat aus.Inkubieren Sie die Suspensionen bei Raumtemperatur für drei Stunden. Mischen Sie ein gleiches Volumen einer bakteriellen Suspension, die eines der hier gezeigten Module enthält, mit dem fünf Primmodul und dem Integrase-Modul. Mit einer Spritze ohne Nadel fünf Milliliter der Suspensionsmischung herausnehmen.Drücken Sie die Spitze der Spritze gegen die Unterseite des Pflanzenblattes, während Sie sanft Gegendruck auf die andere Seite des Blattes ausüben. Infiltrieren Sie die ersten drei vollständig expandierten Blätter, beginnend mit der Spitze, für jede Pflanze. Beschriften Sie die agrofiltrierten Blätter mit dem Papieranhänger auf dem Blattstamm.Dann bringen Sie die Pflanzen unter Standardbedingungen in die Wachstumskammer zurück. An den Tagen vier bis 14 nach der Infektion die agrofiltrierten Blätter sammeln und in flüssigem Stickstoff einfrieren. Bewahren Sie dieses Pflanzengewebe bei minus 80 Grad Celsius auf.Erstens, separat wachsen die drei A.tumefaciens Transformants in 50 Milliliter LB Medium mit Rifampicin in einer Konzentration von 50 Mikroliter pro Milliliter, und geeignete vektorspezifische Antibiotika durch Schütteln über Nacht bei 28 Grad Celsius. Am nächsten Tag pellet die Bakterienkulturen durch Zentrifugieren bei 4500 mal G für 20 Minuten. Setzen Sie das Pellet in 1 Liter Infiltrationspuffer auf einen OD600 von 0,35 aus, und inkubieren Sie die Suspensionen bei Raumtemperatur für drei Stunden.Dann fügen Sie 0,01% des Waschmittels zu jeder Suspension hinzu. Mischen Sie ein gleiches Volumen einer bakteriellen Suspension, die eines der hier gezeigten Module enthält, mit dem fünf Primmodul und dem Integrase-Modul. Legen Sie eine sechs Wochen alte Rote-Beet-Pflanze in den Halter.Invertieren Sie den Halter und legen Sie ihn auf einen Becher, der zwei Liter eines Infiltrationsbades enthält, um die Blätter in die Infiltrationssuspension zu tauchen. Danach das Infiltrationsbad mit der Unterwasseranlage in die Infiltrationskammer überführen und schließen. Schalten Sie die Vakuumpumpe ein und öffnen Sie das Vakuumeinlassventil an der Infiltrationskammer.Sobald der Druck in der Kammer auf 90 Millibar gefallen ist, halten Sie das Vakuum für drei Minuten aufrecht. Lassen Sie dann das Vakuum für 45 Sekunden los. Wenn die Kammer wieder atmosphärischen Druck erreicht hat, öffnen Sie die Kammer und entfernen Sie die infiltrierte Pflanze aus dem Bakterienbad.Bringen Sie die Pflanze in die Wachstumskammer zurück. Am Tag der maximalen Expression die infiltrierten Blätter ernten und in flüssigem Stickstoff einfrieren, wie zuvor beschrieben. Zuerst ernten Sie das vakuumagrofilfiltrierte Delta 87 GAD65mut, das rote Rübenblätter auf dem Ausdrucksgipfel ausdrückt, und frieren sie in flüssigem Stickstoff ein.Lyophilisieren Sie die gefrorenen Blätter bei minus 50 Grad Celsius und bei 0,04 Millibar für 72 Stunden. Dann lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Wenn Sie bereit sind, fortzufahren, schleifen Sie die Blätter zu einem feinen Pulver und lagern Sie bei Raumtemperatur in einem verschlossenen Behälter mit Kieselgel, um die Feuchtigkeit auszuschließen.Für die Magenverdauungssimulation 100 Milligramm der fein gemahlenen gefriergetrockneten roten Rübenblätter wiegen und in sechs MilliliterN PBS wieder aufsetzen. Verwenden Sie sechs molare Salzsäure, um den pH-Wert der Probe auf zwei einzustellen. Fügen Sie vier Milligramm pro Milliliter Pepsin aus der Magenschleimhaut von Schweinen und 10 Millimolar-Salzsäure hinzu, um eine endgültige Pepsinkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter zu erhalten.Schütteln Sie die Probe bei 37 Grad Celsius für 120 Minuten. Als Nächstes verwenden Sie Natriumhydroxid, um den pH-Wert der Probe auf acht einzustellen und das Pepsin zu inaktivieren. 750 Mikroliter-Aliquots jeder Probe in Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und die Aliquots bei 20 000 mal G und bei vier Grad Celsius für 20 Minuten zentrifugieren.Sammeln Sie jeden Überstand separat, und setzen Sie jedes Pellet in einem überstandenen Volumen des Ladepuffers wieder auf. Analysieren Sie dann sowohl den Überstand als auch das resuspendierte Pellet durch Western Blot-Analyse. Für die Zellintegritätsanalyse zwei Proben von 100 Milligramm der fein gemahlenen gefriergetrockneten Roten Rübenblätter vorbereiten und beide in sechs MilliliterPBS wieder aussetzen.Verwenden Sie sechs molare Salzsäure, um den pH-Wert einer Probe auf zwei anzupassen. Schütteln Sie beide Proben bei 37 Grad Celsius für 120 Minuten. Dann aliquot 750 Mikroliter jeder Probe zu Mikrozentrifugenröhrchen.Zentrifuge bei 20.000 mal G und bei 4 Grad Celsius für 20 Minuten. Sammeln Sie jeden Überstand separat, und setzen Sie jedes Pellet in einem überstandenen Volumen des Ladepuffers wieder auf. Analysieren Sie dann sowohl den Überstand als auch das resuspendierte Pellet durch Western Blot-Analyse.Wiegen Sie zunächst 100 Milligramm der fein gemahlenen gefriergetrockneten Roten Rübenblätter und setzen Sie sie in acht Millilitern steriler PBS wieder auf. Wirbel für eine Minute. Platte einen Milliliter jedes gefriergetrockneten Blatthomogenats in einem der fünf vorbereiteten selektiven LB-Medien.Die Platten drei Tage lang bei 28 Grad Celsius bebrüten. Danach zählen Sie die auf jeder Platte angebauten Agrobacteriumkolonien und berechnen die restliche bakterielle Ladung als Anzahl der koloniebildenden Einheiten pro Milliliter des gefriergetrockneten Blatthomogenats. In dieser Arbeit wird ein oraler Impfstoff in essbarem Pflanzengewebe entwickelt.Rote Rüben- und Spinatpflanzen werden manuell mit Suspensionen von A.tumefaciens mit EGFP-rekombinanten Expressionsvektoren agrofiltriert, und die fluoreszierende Proteinexpression wird durch Western Blot-Analyse visualisiert und unter UV-Licht quantifiziert. Das Rote-Rüben-System zeichnet sich durch eine höhere EGFP-Expression aus und erreicht nach der Infektion etwa 544 Mikrogramm pro Gramm frischem Blattgewicht, während der Spinat nach der Infektion nur einen Höchstwert von etwa 113,4 Mikrogramm pro Gramm frischem Blattgewicht erreichte. Aus diesem Grund wird die Rote Rübe als Ausdruckshost für alle nachfolgenden Experimente ausgewählt.Die Pflanzen werden dann mit einer A.tumefaciens Suspension vakuuminfiltriert. Nach der TSP-Extraktion aus Agroinfiltrationsblättern werden die Proben mit Western Blot analysiert, und das rekombinante Protein wird durch eine Densitometrie-Analyse relativ quantifiziert. Schließlich werden die Parameter für die Entwicklung eines potenziellen oralen Impfstoffs bewertet.Wie hier gesehen, wird das Zielprotein nach dem Lyophilisierungsprozess als stabil angesehen. Die Magenverdauung wird simuliert, indem das Magenenzym Pepsin zu gefriergetrocknetem Material hinzugefügt wird, entweder auf eine Endkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter oder ein Verhältnis von eins zu 20 zu TSP. Beide Verdauungsbehandlungen führen zum Abbau des rekombinanten Proteins.Das Fehlen eines spezifischen Signals in den Pelletproben nach der Pepsinverdauung deutet darauf hin, dass die Pflanzenzellen nach dem Einfrieren ihre Integrität verloren haben, was zum Abbau des Zielproteins führte. Das Verfahren sollte sorgfältig an die Pflanzenarten in Bezug auf die Vakuuminfiltration und an das Ziel rekombinantes Protein in Bezug auf die Zeitverlaufsanalyse angepasst werden. Das Nachweisverfahren könnte auch zur Herstellung von Biopharmazeuten verwendet werden, die zur oralen Abgabe bestimmt sind, wie Impfstoff e.B. Impfstoff und Antikörper.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Forschung

Biotechnik

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The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

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