Name: transient expression in red beet of a biopharmaceutical candidate vaccine for type-1 diabetes
Uploaded: 2019-03-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הפרויקט המשותף "שימוש בצמחים לייצור חיסון אכיל סוכרת אוטואימונית (eDIVA)" (מזהה הפרוייקט: 891854) ממומן על ידי האוניברסיטה של ורונה, במסגרת השיחה 2014.

1. אדום טיפוח סלק ותרד
<ol><li>לגדל סלק אדום (דרב דלקתית קורות חיים Moulin Rouge) ותרד (ס הבר קורות חיים Industria) צמחים כדורים צמיחה, באמצעות µE 150 של עוצמת האור, 65% לחות יחסית, 12 h/כהה מחזור ב 23/21 ° C, בהתאמה.</li>
	<li>לאחר נביטת הזרעים, לדשן את הצמחים פעמיים בשבוע עם פתרון 1 g/L של דשן זמין מסחרית (טבל...

<ol>
	<li>Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edible+plants+for+oral+delivery+of+biopharmaceuticals.">Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).</li><li>Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+recombinant+protein+production+in+different+biofactories:+The+green+perspective.">Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective.</a> BioMed Research International. , (2014).</li><li>Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+recovery+of+recombinant+proteins+from+plants.">Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants.</a> Biotechnology Progress. 20 (4), 1001-1014 (2004).</li><li>Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-made+pharmaceuticals+for+the+prevention+and+treatment+of+autoimmune+diseases:+Where+are+we?.">Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we?.</a> Expert Review of Vaccines. 9 (8), 957 (2010).</li><li>Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transfection+of+viral+replicons+for+efficient+transient+expression+in+plants.">Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants.</a> Nature Biotechnology. 23, (2005).</li><li>Ludvigsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+treatment+of+type+1+diabetes+in+childhood.">Update on treatment of type 1 diabetes in childhood.</a> Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).</li><li>Merlin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+GAD65+production+in+plants+using+the+MagnICON+transient+expression+system:+Optimization+of+upstream+production+and+downstream+processing.">Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing.</a> Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).</li><li>Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Analysis+of+Recombinant+Protein+Expression+in+Different+Biofactories:+Bacteria,+Insect+Cells+and+Plant+Systems.">A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).</li><li>Dal Santo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+terroir+concept+interpreted+through+grape+berry+metabolomics+and+transcriptomics.">The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics.</a> Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfiltration+as+an+effective+and+scalable+strategy+of+gene+delivery+for+production+of+pharmaceutical+proteins.">Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins.</a> Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).</li><li>Bertini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+type-1+diabetes+vaccine+candidate+using+edible+plants+expressing+a+major+autoantigen.">Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen.</a> Frontiers in Plant Science. 9, (2018).</li><li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+planta+expression+of+the+human+islet+autoantigen+glutamic+acid+decarboxylase+(GAD65).">Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65).</a> Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).</li><li>Sep&#250;lveda-Jim&#233;nez, G., Rueda-Ben&#237;tez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+red+beet+(Beta+vulgaris)+UDP-glucosyltransferase+gene+induced+by+wounding,+bacterial+infiltration+and+oxidative+stress.">A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress.</a> Journal of Experimental Botany. 56, (2005).</li><li>Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+for+enhancing+oral+bioavailability+of+peptides+and+proteins.">Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins.</a> International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).</li><li>. Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction Available from: <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction">https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction</a> (2015)</li><li>Kamei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexation+hydrogels+for+intestinal+delivery+of+interferon+beta+and+calcitonin.">Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin.</a> Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).</li><li>Tuesca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexation+hydrogels+for+oral+insulin+delivery:+effects+of+polymer+dosing+on+in+vivo+efficacy.">Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).</li><li>Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+yield+of+recombinant+pharmaceutical+proteins+in+plants.">Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants.</a> Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).</li><li>Dhama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-based+oral+vaccines+for+human+and+animal+pathogens+&#8211;+a+new+era+of+prophylaxis:+current+and+future+perspectives.">Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens &#8211; a new era of prophylaxis: current and future perspectives.</a> Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447, 75-93 (2013).</li><li>Hefferon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconceptualizing+cancer+immunotherapy+based+on+plant+production+systems.">Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems.</a> Future science. O3, (2017).</li></ol>

במחקר זה הראינו ניתוח ראשוני על עיצוב האתר של חיסון אוראלי מועמד לטיפול בסוכרת אוטואימונית. החלבון היעד עבור ניסוי זה היה בצורת מוטציה kDa 65 בני אדם Decarboxylase גלוטמט, אשר ייצור ופונקציונליות הם לזיהוי בקלות וניתנת למדידה12. הביטוי שלה ברקמות צמח מאכל שונים הייתה מתווכת על-ידי וקטו...

מאז המהפכה ביולוגיה מולקולרית צמח בשנות ה-80, מערכות מבוססות-מפעל לייצור ביופרמצבטיקה יכול להיחשב כאלטרנטיבה למערכות מסורתית המבוססת על חיידקים בתרבית של תאים1. צמחים להציג כמה יתרונות על פני פלטפורמות מסורתי, עם מדרגיות, עלות האפקטיביות והבטיחות להיות הרלוונטיים ביותר2. המוצר רקומביננטי ניתן לטהר מרקמות הצמח טרנספורמציה, ואז מנוהל, גם parenterally או בעל פה, יתר על כן, צמח מאכל טרנספורמציה ניתן להשתמש ישירות עבור משלוח אוראלי. תוואי אוראלי בו זמנית מקדם חסינות הרירית ומערכתית, זה מבטל את הצורך של מחטים וצוותים רפואיים מיוחדים. יתר על כן, משלוח אוראלי מבטלת את העיבוד במורד הזרם מורכבים, עובייה בד כ 80% של העלות הייצור הכולל של חלבון רקומביננטי3. כל היתרונות הללו יכול להיות מתורגם חסכון בעלויות ייצור, אספקה, העבודה הפחתת העלויות של כל מנה, לבצע את התרופה במחיר נוח רוב האוכלוסייה הכללית.
מספר אסטרטגיות, הן עבור שינוי יציב, ביטוי ארעי, פותחו לייצור של חומרים בצמחים. ביניהם, מערכת מבוססת-וירוס הביטוי צמח המפורקים תשואה גבוהה (למשל, magnICON) מספק ביצועים מעולים מובילים תפוקה גבוהה של חומרים על צירי זמן קצר יחסית4. דוגמאות רבות של ביטוי ארעי באמצעות מערכת מבוססת-וירוס הביטוי צמח בצמחים benthamiana טבק ידווחו, להיות המארח ייצור תקן הזהב. עם זאת, צמח מודל זה לא נחשב זן אכיל בשל של אלקלואידים אחרים מטבוליטים רעילים שאינן שהצטברו העלים שלו.
בעבודה זו, אנו מתארים את ההשוואה בין שתי מערכות צמח אכיל, סלק אדום (בטא דלקתית קורות חיים Moulin Rouge) ותרד (Spinacea הבר קורות חיים תעשייה), עבור הביטוי של שתי צורות המועמד איזופורם 65 kDa חומצה גלוטמית decarboxylase (GAD65), בוצע על ידי המפעל מבוסס-וירוס המומנט5. GAD65 autoantigen העיקריים הקשורים לסוכרת סוג 1 (T1D) וזה כרגע תחת חקירה בניסויים קליניים אנושי כדי למנוע או לעכב את T1D על ידי גרימת רגישות6. הייצור של GAD65 בצמחים בהרחבה נחקרה במין צמח מודל כמו טבק tabacum ו- benthamiana (ש ע)4,5,6,7. כאן, אנו מתארים את השימוש מיני צמחים אכילים לייצור המולקולה ברקמות זה הכוונה על משלוח אוראלי ישירה. מנקודת מבט טכנית, אנחנו למד ונבחר את המערכת עבור הצמח agroinfiltration ואת פלטפורמת צמח אכיל לייצור GAD65 על-ידי הערכת פרמטרים שונים: רמות הביטוי חלבון רקומביננטי, החיוב מיקרוביאלי שיורית בצמח רקמות מיועד משלוח אוראלי, ההתנגדות של GAD65 כדי עיכול קיבה ולאחר את אקוויוולנטיות של הצמחים טרנספורמציה עם סוג הפרוע.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2-&#956;m Minisart RC4 membrane filters</td>
			<td>Sartorius-Stedim</td>
			<td>17764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8211;mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td>pH 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27221</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td>Toxic &#8211; 0.1 M stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Bacteriological Grade</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0949</td>
			<td>15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-eGFP antibody</td>
			<td>ABCam</td>
			<td>ab290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAD 65/67 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-LHCB2 antibody</td>
			<td>Agrisera</td>
			<td>AS01 003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 &#956;m) Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Guard Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 &#956;m) Guard&#160; Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CalMag Grower</td>
			<td>Peter Excel</td>
			<td>15-5-15</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>C0109</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708370</td>
			<td>ChemiDoc Touch Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5927</td>
			<td>Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence reader</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>&#160;1420-011</td>
			<td>VICTOR Multilabel Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td>15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1758</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 &#956;m) Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC Guard Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 &#956;m) Guard&#160; Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6154</td>
			<td>Do not freeze/thaw too many times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Autosampler</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>System Gold 508 Autosampler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>System Gold 128 Solvent Module HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>24137</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K4000</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol solution</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td>Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizator</td>
			<td>5Pascal</td>
			<td>LIO5P0000DGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectometer</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>&#160; -</td>
			<td>Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk-blocking solution</td>
			<td>Ristora</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>3 % in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282</td>
			<td>&#160;Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulase membrane</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase substrate ECL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2235</td>
			<td>Light sensitive material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Vacuum Press</td>
			<td>VWR</td>
			<td>111400000098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643</td>
			<td>Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643</td>
			<td>Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>R0146</td>
			<td>Toxic &#8211; 25 mg/mL stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium dodecyl sulphate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metabisulphite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7681-57-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator system</td>
			<td>Soltec</td>
			<td>090.003.0003</td>
			<td>Sonica&#174; 2200 MH; frequency 40 khz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent fixed 300-&#181;L insert glass tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11573680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>TRP03</td>
			<td>10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Heto</td>
			<td>3878 F1-3</td>
			<td>Speed-vac System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>39253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y1333</td>
			<td>5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient expression in red beet of a biopharmaceutical candidate vaccine for type-1 diabetes

הצמח בחקלאות מולקולרי הוא השימוש של צמחים כדי לייצר מולקולות של עניין. בפרספקטיבה הזו, צמחים עשוי לשמש הן ריאקטורים על ההפקה ועל טיהור עוקבות של המוצר הסופי, למסירה אוראלי ישירה של חלבונים heterologous בעת שימוש מיני צמחים אכילים. בעבודה זו, אנו מציגים הפיתוח של חיסון אוראלי המועמד נגד סוכרת סוג 1 (T1D) מערכות צמח אכיל בעזרת טכנולוגיה מבוססת-וירוס דנ א רקומביננטי צמח המפורקים, הנכללת הסתננות ואקום. התוצאות שלנו מראים כי סלק אדום פונדקאי מתאים לביטוי ארעית autoantigen נגזר האנושי קשור T1D, נחשב מועמד מבטיח כמו חיסון T1D. עלים לייצר את autoantigen מאופיינים ביסודיות שלהם עמידות עיכול קיבה, נוכחות של מטען חיידקי שיורית, שלהם פרופיל מטבולי המשני, נותן סקירה כללית של תהליך הייצור לשימוש פוטנציאלי הצמחים עבור משלוח אוראלי ישירה של חלבון heterologous. הניתוח שלנו הראה השפלה כמעט מוחלטת של המועמד הליחה חיסון אוראלי בעקבות עיכול קיבה מדומה, רומז כי אסטרטגיית כימוס בייצור של החיסון גד הצמחי נדרש.

בעבודה זו, מוצג את זרימת העבודה עבור הפיתוח של חיסון אוראלי ברקמות הצמח אכיל. המוקד של עבודה זו היא הביטוי של חלבון המטרה זן צמח אכיל מארח אפיון חיסון אוראלי פוטנציאליים.
הצעד הראשון מעורב הערכת ההתאמה של הטכנולוגיה מבוססת-וירוס הביטוי צמ...

Watch this Scientific Journal Video about Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes at JoVE.com

Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes

ארעי ביטוי סלק אדום של חיסון ביולוגיות המועמד לסוכרת מסוג 1

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר מועמד חיסון אוראלי נגד סוכרת מסוג 1 במפעל אכיל.

Plant molecular farming is the use of plants to produce molecules of interest. In this perspective, plants may be used both as bioreactors for the ...

בין האסטרטגיות השונות לייצור חלבון רקומביננטי בצמחים, ביטוי VERS על בסיס צמחי מפורק מספק ביצועים מעולים, מה שמוביל לתשואות גבוהות על פני מסגרת זמן קצרה יחסית. שכפול של טכנולוגיה זו לייצור חיסון אוראלי טומן בחובו פוטנציאל גדול להפוך לחלופה לחיסונים קונבנציונליים בעתיד הקרוב. עלי סלק אדומים Lyophilized טרנספורמציה ארעית צובר כמות של אנטיגנים צילום מתאים אינדוקציה סובלנות אוראלית במניעת סוכרת מסוג אחד.פרוטוקול ניסיוני זה יכול להיות מורחב למינים אכילים רבים ושונים לאחר הערכה מקרה לגופו של הצטברות חלבון רקומביננטי. הדגמת ההליך תהיה אדוארדו ברתיני, מתיה סנטוני, אנה קוקורולו ורוברטה זמפיירי. כדי להתחיל בהליך זה, לגדל סלק אדום וצמחי תרד בתא צמיחה כמתואר בפרוטוקול הטקסט.לאחר נביטת זרעים, להפרות את הצמחים פעמיים בשבוע עם פתרון של דשן זמין מסחרית בריכוז של גרם אחד לליטר. למילוי אגרו-סינון, יש להשתמש בתרד בן חמישה שבועות ובצמחי סלק אדומים בני שישה שבועות. לאחר בניית וקטורים ביטוי הצמח, לחסן את שלושת טרנספורמנטים A.tumefaciens ב 50 מיליליטר של מדיום LB המכיל ריפאמפיץ בריכוז של 50 מיקרוגרם למיליליטר ואנטיביוטיקה ספציפית וקטור כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.לגדול על ידי רועד לילה ב 28 מעלות צלזיוס. למחרת, גלולה תרבות חיידקים על ידי צנטריפוגה ב 4500 פעמים G במשך 20 דקות. תן שימוש חוזר את גלולה ב 100 מיליליטר של חיץ חדירה המכיל 10 MES מילימולרית ו 10 מגנזיום גופרתי מילימולארי.דגירה המתלים בטמפרטורת החדר במשך שלוש שעות. מערבבים נפח שווה של מתלה חיידקי המכיל את אחד המודולים המוצגים כאן, עם חמשת המודולים הראשיים ומודול האיטגרייס. באמצעות מזרק ללא מחט, להוציא חמישה מיליליטר של תערובת ההשעיה.לחץ על קצה המזרק על החלק התחתון של עלה הצמח תוך הפעלת בעדינות נגד לחץ בצד השני של העלה. הסתננו לשלושת העלים המורחבים לחלוטין, החל מהעלים, עבור כל צמח. סמן את העלים המותנים עם תג הנייר על גזע העלה.ואז להחזיר את הצמחים לתא הצמיחה בתנאים סטנדרטיים. בימים 4 עד 14 לאחר ההדבקה, לאסוף את העלים agroinfiltrated ולהקפיא אותם בחנקן נוזלי. אחסן את רקמת הצמח במינוס 80 מעלות צלזיוס.ראשית, לגדל בנפרד את שלושת טרנספורמנטים A.tumefaciens ב 50 מיליליטר של מדיום LB המכיל ריפאמפיצין בריכוז של 50 microliters למיליליטר, ואנטיביוטיקה ספציפית וקטור מתאים על ידי רועד לילה ב 28 מעלות צלזיוס. למחרת, גלולה תרבות חיידקים על ידי צנטריפוגה ב 4500 פעמים G במשך 20 דקות. תן את גלולה ב 1 ליטר של חיץ חדירה ל OD600 של 0.35, ולהדגיר את המתלים בטמפרטורת החדר במשך שלוש שעות.לאחר מכן הוסף 0.01% של חומר הניקוי לכל השעיה. מערבבים נפח שווה של מתלה חיידקי המכיל את אחד המודולים המוצגים כאן עם חמשת המודולים הראשיים ומודול האיטגרייס. הכנס צמח סלק אדום אחד בן שישה שבועות למחזיק.להפוך את המחזיק ולהמקם אותו על גבי מקור המכיל שני ליטרים של אמבטיית הסתננות כדי להטביע את העלים בהשעיית החדירה. לאחר מכן, להעביר את אמבטיית ההסתננות עם הצמח שקוע לתא החדירה ולסגור אותו. הפעל את משאבת ואקום ולפתוח את שסתום צריכת ואקום על תא החדירה.ברגע שהלחץ בתא ירד ל-90 מ"מ, שמרו על הוואקום למשך שלוש דקות. ואז לשחרר את הוואקום במשך 45 שניות. כאשר התא חזר ללחץ אטמוספרי, פתח את התא והסר את הצמח שחדר מהאמבטיה החיידקית.להחזיר את הצמח לתא הצמיחה. ביום הביטוי המקסימלי, לקצור את העלים הסתננו להקפיא אותם בחנקן נוזלי כפי שתואר קודם לכן. ראשית, לקצור את הדלתא agroinfiltrated ואקום 87 GAD65mut מבטא עלים סלק אדום בשיא הביטוי, ולהקפיא אותם בחנקן נוזלי.ליופיליזציה של העלים הקפואים במינוס 50 מעלות צלזיוס וב-0.04 מיליבאר למשך 72 שעות. ואז לאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. כאשר מוכנים להמשיך, טוחנים את העלים לאבקה דקה ומאחסנים בטמפרטורת החדר במיכל אטום עם ג'ל סיליקה כדי לא לכלול את הלחות.לסימולציית עיכול הקיבה, שקלו 100 מיליגרם של עלי הסלק האדומים המיובשים בהקפאה עדינים, ותדלקו אותו מחדש בשישה מיליליטר של PBS. השתמש שש חומצה הידרוכלורית molar כדי להתאים את ה-pH מדגם לשניים. הוסף ארבעה מיליגרם למיליליטר פפסין מרירית קיבה חזירית, וחומצה הידרוכלורית 10 מילימולרית, כדי לקבל ריכוז פפסין סופי של מיליגרם אחד למיליליטר.לנער את המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 120 דקות. לאחר מכן, השתמש נתרן הידרוקסיד כדי להתאים את ה- pH מדגם לשמונה ולהשבית את הפפסין. מעבירים 750 מיליליטר של כל דגימה לצינורות מיקרוצנטריפוגה, ומעבירים את האליקוטים ב-20,000 פעמים G וב-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.לאסוף כל על-טבעי בנפרד, ולתלות מחדש כל גלולה בנפח אחד על-טבעי של מאגר טעינה. ואז לנתח הן את supernatant ואת גלולה resuspended על ידי ניתוח כתם מערבי. לניתוח שלמות התא, הכינו שתי דגימות של 100 מיליגרם של עלי הסלק האדומים המיובשים בהקפאה, והתינו מחדש בשישה מיליליטר של PBS.השתמש שישה חומצה הידרוכלורית molar כדי להתאים את ה- pH של מדגם אחד לשניים. לנער את שתי הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 120 דקות. ואז aliquot 750 microliters של כל מדגם לצינורות מיקרוצנטריפוגה.צנטריפוגה ב 20, 000 פעמים G וב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאסוף כל על-טבעי בנפרד, ולתלות מחדש כל גלולה בנפח אחד על-טבעי של מאגר טעינה. ואז לנתח הן את supernatant ואת גלולה resuspended על ידי ניתוח כתם מערבי.ראשית, לשקול 100 מיליגרם של עלי סלק אדומים מיובשים בהקפאה דק, ו resuspend אותו בשמונה מיליליטר של PBS סטרילי. וורטקס לדקה אחת. צלחת מיליליטר אחד של כל הומוגניט עלה מיובש בהקפאה באחת מחמשת המדיה LB סלקטיבי מוכן.דגירה הצלחות ב 28 מעלות צלזיוס במשך שלושה ימים. לאחר מכן, לספור את מושבות האגרובקטריום גדל על כל צלחת, ולחשב את המטען החיידקי שיורית כמספר המושבה להרכיב יחידות למיליליטר של הומוגונט עלה מיובש בהקפאה. בעבודה זו, חיסון אוראלי מפותח ברקמת צמח אכיל.צמחי סלק ותרד אדומים הם agroinfiltrated באופן ידני עם השעיות של A.tumefaciens נושאת וקטורים ביטוי רקומביננטי EGFP, ואת ביטוי חלבון פלואורסצנטי הוא דמיינו על ידי ניתוח כתם מערבי וכמת תחת אור UV. מערכת הסלק האדומה מאופיינת בביטוי EGFP גבוה יותר, המגיע לכ-544 מיקרוגרם לגרם משקל עלים טריים בתשעה ימים לאחר ההדבקה, בעוד התרד הגיע לרמה מקסימלית של כ-113.4 מיקרוגרם לגרם משקל עלים טריים ב-11 ימים לאחר ההדבקה. מסיבה זו, הסלק האדום נבחר כמארח הביטויים עבור כל הניסויים הבאים.לאחר מכן, צמחים חודרים לוואקום עם השעיה של איי-טופקינס. לאחר מיצוי TSP של עלי agroinfiltration, הדגימות מנותחות על ידי כתם מערבי, ואת החלבון רקומביננטי הוא לכמת יחסית על ידי ניתוח צפיפות. לבסוף, הפרמטרים לפיתוח חיסון אוראלי פוטנציאלי מוערכים.כפי שניתן לראות כאן, חלבון היעד נראה יציב לאחר תהליך lyophilization. עיכול קיבה מדומה על ידי הוספת פפסין אנזים קיבה חזירי לחומר מיובש בהקפאה, או לריכוז סופי של מיליגרם אחד למיליליטר, או יחס של 1 עד 20, ל- TSP. שני תנאי הטיפול במערכת העיכול גורמים להשפלה של החלבון הרקומביננטי.היעדר אות ספציפי בדגימות גלולה לאחר עיכול פפסין עולה כי לאחר ייבוש הקפאה, תאי הצמח איבדו את שלמותם, וזה הוביל השפלה חלבון היעד. ההליך צריך להיות מותאם בקפידה למינים הצמחים ביחס לחדירת ואקום ולחלבון רקומביננטי היעד ביחס לניתוח קורס זמן. הליך ההדגמה עשוי לשמש גם לייצור ביופארמה המיועדת ללידה דרך הפה, כמו חיסון ונוגדנים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

יצירת דו מימדי מצעים Patterned עבור החזקת חלבון ו-Cell

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

ליפידים מיצוי נייד עבור דילול ממוקד איזוטופ יציב ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית-Mass

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

יצירת חולף קרום התא הנקבוביות באמצעות מדפסת הזרקת דיו רגילה

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

עור קעקוע כגישה חדשה לאספקת חיסון ה-DNA

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

אפיון של מערכות מורכבות באמצעות העיצוב של גישת ניסויים: ביטוי חלבון חלוף בטבק כמקרה מבחן

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

ביטוי, בידוד וטיהור של מסיס ובלתי מסיסים חלבונים Biotinylated להתחדשות רקמת עצב

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

סביבת Microfluidic מבוקרת לדינמית חקירה של צבירת תאי דם האדום

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

המצאה של ננוצלולוז בקטריאלי המגנטי פונקציונלי עם חלקיקים של תחמוצת ברזל

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic זרימה צ&#39;יימברס שימוש מחדש דם למודל המוסטאסיס ואת טסיות עירוי<em&gt; במבחנה</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

פיתוח תאיים תלת ממד Organotypic דגם של אדם המעיים הריריים Grown במיקרוגרבטיציה

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...