Name: transient expression in red beet of a biopharmaceutical candidate vaccine for type-1 diabetes
Uploaded: 2019-03-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dal progetto congiunto "L'uso delle piante per la produzione di un vaccino commestibile di diabete autoimmune (eDIVA)" (progetto ID: 891854) finanziato dall'Università di Verona nell'ambito della chiamata 2014.

1. rossa coltivazione di bietola e spinaci
<ol><li>Coltivare la barbabietola rossa (b. vulgaris cv Moulin Rouge) e spinaci (S. oleracea cv Industria) piante in una camera di crescita, utilizzando 150 µE di intensità della luce, 65% di umidità relativa, ciclo luce/buio di 12 h a 23/21 ° C, rispettivamente.</li>
	<li>Dopo la germinazione dei semi, fertilizzare le piante due volte a settimana con una soluzione di 1 g/L di un fertilizzante disponibile in commercio (Tabella materiali)....

<ol>
	<li>Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edible+plants+for+oral+delivery+of+biopharmaceuticals.">Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).</li><li>Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+recombinant+protein+production+in+different+biofactories:+The+green+perspective.">Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective.</a> BioMed Research International. , (2014).</li><li>Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+recovery+of+recombinant+proteins+from+plants.">Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants.</a> Biotechnology Progress. 20 (4), 1001-1014 (2004).</li><li>Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-made+pharmaceuticals+for+the+prevention+and+treatment+of+autoimmune+diseases:+Where+are+we?.">Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we?.</a> Expert Review of Vaccines. 9 (8), 957 (2010).</li><li>Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transfection+of+viral+replicons+for+efficient+transient+expression+in+plants.">Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants.</a> Nature Biotechnology. 23, (2005).</li><li>Ludvigsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+treatment+of+type+1+diabetes+in+childhood.">Update on treatment of type 1 diabetes in childhood.</a> Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).</li><li>Merlin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+GAD65+production+in+plants+using+the+MagnICON+transient+expression+system:+Optimization+of+upstream+production+and+downstream+processing.">Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing.</a> Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).</li><li>Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Analysis+of+Recombinant+Protein+Expression+in+Different+Biofactories:+Bacteria,+Insect+Cells+and+Plant+Systems.">A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).</li><li>Dal Santo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+terroir+concept+interpreted+through+grape+berry+metabolomics+and+transcriptomics.">The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics.</a> Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfiltration+as+an+effective+and+scalable+strategy+of+gene+delivery+for+production+of+pharmaceutical+proteins.">Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins.</a> Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).</li><li>Bertini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+type-1+diabetes+vaccine+candidate+using+edible+plants+expressing+a+major+autoantigen.">Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen.</a> Frontiers in Plant Science. 9, (2018).</li><li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+planta+expression+of+the+human+islet+autoantigen+glutamic+acid+decarboxylase+(GAD65).">Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65).</a> Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).</li><li>Sep&#250;lveda-Jim&#233;nez, G., Rueda-Ben&#237;tez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+red+beet+(Beta+vulgaris)+UDP-glucosyltransferase+gene+induced+by+wounding,+bacterial+infiltration+and+oxidative+stress.">A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress.</a> Journal of Experimental Botany. 56, (2005).</li><li>Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+for+enhancing+oral+bioavailability+of+peptides+and+proteins.">Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins.</a> International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).</li><li>. Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction Available from: <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction">https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction</a> (2015)</li><li>Kamei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexation+hydrogels+for+intestinal+delivery+of+interferon+beta+and+calcitonin.">Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin.</a> Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).</li><li>Tuesca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexation+hydrogels+for+oral+insulin+delivery:+effects+of+polymer+dosing+on+in+vivo+efficacy.">Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).</li><li>Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+yield+of+recombinant+pharmaceutical+proteins+in+plants.">Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants.</a> Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).</li><li>Dhama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-based+oral+vaccines+for+human+and+animal+pathogens+&#8211;+a+new+era+of+prophylaxis:+current+and+future+perspectives.">Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens &#8211; a new era of prophylaxis: current and future perspectives.</a> Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447, 75-93 (2013).</li><li>Hefferon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconceptualizing+cancer+immunotherapy+based+on+plant+production+systems.">Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems.</a> Future science. O3, (2017).</li></ol>

In questo studio abbiamo mostrato analisi preliminare per la progettazione di un candidato vaccino orale per il diabete autoimmune. La proteina dell'obiettivo per questo esperimento era una forma mutata dell'umana 65 kDa glutammato decarbossilasi, quali produzione e funzionalità sono facilmente rilevabili e misurabili12. Sua espressione nei tessuti vegetali commestibili diversi è stata mediata da vettori5, che mediare un elevato livello di produzione di proteine ricombina...

Dopo la rivoluzione di biologia molecolare vegetale del 1980, sistemi basati su impianto per la produzione di prodotti biofarmaceutici possono essere considerati come un'alternativa ai sistemi tradizionali basati su cellule microbiche e mammiferi1. Piante mostrano diversi vantaggi rispetto ai tradizionali piattaforme, con scalabilità, economicità e sicurezza essendo il più rilevanti2. Il prodotto ricombinante può essere purificato da tessuti vegetali trasformati e quindi somministrato, sia per via parenterale o per via orale e, inoltre, trasformata pianta commestibile può essere utilizzata direttamente per la consegna orale. Via orale contemporaneamente promuove l'immunità mucosa e sistemica, ed elimina la necessità per gli aghi e personale medico specializzato. Inoltre, la consegna orale Elimina la complessa elaborazione a valle, che normalmente rappresenta l'80% del costo totale di produzione di una proteina ricombinante3. Tutti questi vantaggi possono essere tradotte in risparmio in produzione, di forniture e di lavoro riducendo i costi di ogni dose, rendendo il farmaco a prezzi accessibili alla maggior parte della popolazione mondiale.
Diverse strategie, sia per la trasformazione stabile ed espressione transitoria, sono state sviluppate per la produzione di proteine ricombinanti in pianta. Fra loro, un sistema di espressione basata su virus ad alto rendimento decostruito pianta (per esempio, magnICON) fornisce prestazioni superiori che portano alti rendimenti di proteine ricombinanti sulle scale cronologiche relativamente breve4. Molti esempi di espressione transiente utilizzando il sistema di espressione basata su virus vegetali in piante di Nicotiana benthamiana sono segnalati, essendo l'host di produzione aurea. Tuttavia, questa pianta di modello non è considerata una specie commestibile a causa gli alcaloidi e altri metaboliti tossici che si accumulano nelle sue foglie.
In questo lavoro descriviamo il confronto tra due sistemi di pianta commestibile, barbabietola rossa (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) e spinaci (Spinacea oleracea cv Industria), per l'espressione delle due forme di candidato dell'isoforma 65 kDa di acido glutammico decarbossilasi (GAD65), l'impianto basato su virus vettori5. GAD65 è un autoantigen principale associato al diabete di tipo 1 (T1D) ed è attualmente sotto inchiesta nei test clinici umani per impedire o ritardare il T1D inducendo tolleranza6. La produzione di GAD65 nelle piante è stata studiata estesamente in specie di piante modello come Nicotiana tabacum e benthamiana N.4,5,6,7. Qui, descriviamo l'uso di specie vegetali commestibili per la produzione della molecola nei tessuti che può essere destinata per una consegna orale diretta. Da un punto di vista tecnico, abbiamo studiato e selezionato il sistema per pianta agroinfiltrazione e la piattaforma di pianta commestibile per la produzione di GAD65 valutando diversi parametri: livelli di espressione della proteina ricombinante, la carica microbica residua nell'impianto tessuto significato per somministrazione orale, la resistenza di GAD65 alla digestione gastrica e la bioequivalenza delle piante trasformate con il tipo selvaggio.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2-&#956;m Minisart RC4 membrane filters</td>
			<td>Sartorius-Stedim</td>
			<td>17764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8211;mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td>pH 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27221</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td>Toxic &#8211; 0.1 M stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Bacteriological Grade</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0949</td>
			<td>15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-eGFP antibody</td>
			<td>ABCam</td>
			<td>ab290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAD 65/67 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-LHCB2 antibody</td>
			<td>Agrisera</td>
			<td>AS01 003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 &#956;m) Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Guard Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 &#956;m) Guard&#160; Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CalMag Grower</td>
			<td>Peter Excel</td>
			<td>15-5-15</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>C0109</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708370</td>
			<td>ChemiDoc Touch Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5927</td>
			<td>Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence reader</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>&#160;1420-011</td>
			<td>VICTOR Multilabel Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td>15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1758</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 &#956;m) Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC Guard Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 &#956;m) Guard&#160; Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6154</td>
			<td>Do not freeze/thaw too many times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Autosampler</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>System Gold 508 Autosampler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>System Gold 128 Solvent Module HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>24137</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K4000</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol solution</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td>Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizator</td>
			<td>5Pascal</td>
			<td>LIO5P0000DGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectometer</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>&#160; -</td>
			<td>Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk-blocking solution</td>
			<td>Ristora</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>3 % in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282</td>
			<td>&#160;Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulase membrane</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase substrate ECL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2235</td>
			<td>Light sensitive material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Vacuum Press</td>
			<td>VWR</td>
			<td>111400000098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643</td>
			<td>Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643</td>
			<td>Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>R0146</td>
			<td>Toxic &#8211; 25 mg/mL stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium dodecyl sulphate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metabisulphite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7681-57-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator system</td>
			<td>Soltec</td>
			<td>090.003.0003</td>
			<td>Sonica&#174; 2200 MH; frequency 40 khz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent fixed 300-&#181;L insert glass tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11573680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>TRP03</td>
			<td>10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Heto</td>
			<td>3878 F1-3</td>
			<td>Speed-vac System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>39253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y1333</td>
			<td>5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient expression in red beet of a biopharmaceutical candidate vaccine for type-1 diabetes

L'agricoltura molecolare vegetale è l'uso delle piante per produrre molecole di interesse. In questa prospettiva, piante possono essere utilizzati sia come bioreattori per la produzione e la successiva purificazione del prodotto finale e per la consegna orale diretta delle proteine eterologhe quando utilizzo di specie vegetali commestibili. In questo lavoro, vi presentiamo lo sviluppo di un candidato vaccino orale contro il diabete di tipo 1 (T1D) nei sistemi di pianta commestibile utilizzando la tecnologia di pianta decostruito basati sul virus del DNA ricombinante, consegnata con infiltrazione vuoto. I nostri risultati indicano che una barbabietola rossa è un host adatto per l'espressione transitoria di un autoantigen derivato umano associato al T1D, considerato un candidato promettente come un vaccino di T1D. Foglie producendo il autoantigen accuratamente sono stati caratterizzati per la loro resistenza alla digestione gastrica, per la presenza di carica batterica residua e per il loro profilo metabolico secondario, dando una panoramica del processo produttivo per l'uso potenziale di piante per la consegna orale diretta di una proteina eterologa. La nostra analisi ha mostrato quasi completa degradazione del vaccino candidato liofilizzato orale seguendo una digestione gastrica simulata, suggerendo che è necessaria una strategia di incapsulamento nella fabbricazione del vaccino GAD pianta-derivati.

In questo lavoro, il flusso di lavoro per lo sviluppo di un vaccino orale nei tessuti vegetali commestibili è presentato. Il focus di questo lavoro è l'espressione di una proteina dell'obiettivo in una specie di pianta commestibile host e la caratterizzazione del potenziale vaccino orale.
Il primo passo ha coinvolto la valutazione dell'idoneità della tecnologia di espressione basata su virus della centrale per la produzione d...

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Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes

Espressione transiente in barbabietola rossa di un vaccino di biofarmaceutica candidato per il diabete di tipo 1

Qui, presentiamo un protocollo per la produzione di un candidato vaccino orale contro il diabete di tipo 1 in una pianta commestibile.

Plant molecular farming is the use of plants to produce molecules of interest. In this perspective, plants may be used both as bioreactors for the ...

Tra le diverse strategie per la produzione di proteine ricombinanti nelle piante, l'espressione VERS a base vegetale decostruita fornisce prestazioni superiori, portando a rese elevate in un lasso di tempo relativamente breve. La replicazione di questa tecnologia per la produzione di un vaccino orale ha un grande potenziale per diventare un'alternativa ai vaccini convenzionali nel prossimo futuro. Le foglie di barbabietola rossa liofilizzate trasformate transitoriamente accumulano una quantità di antigeni fotografici adatti all'induzione della tolleranza orale nella prevenzione del diabete di tipo uno.Questo protocollo sperimentale potrebbe essere esteso a molte specie commestibili diverse dopo una valutazione caso per caso dell'accumulo di proteine ricombinanti. A manifestare la procedura saranno Edoardo Bertini, Mattia Santoni, Anna Cuccurullo e Roberta Zampieri. Per iniziare questa procedura, coltivare barbabietole rosse e piante di spinaci in una camera di crescita come delineato nel protocollo di testo.Dopo la germinazione dei semi, fertilizzare le piante due volte a settimana con una soluzione di fertilizzante disponibile in commercio a una concentrazione di un grammo per litro. Per l'agroinfiltrazione, utilizzare spinaci di cinque settimane e piante di barbabietola rossa di sei settimane. Dopo aver costruito i vettori di espressione vegetale, inoculare i tre trasformatori A.tumefaciens in 50 millilitri di mezzo LB contenente rifampicina ad una concentrazione di 50 microgrammi per millilitro e antibiotici specifici del vettore come delineato nel protocollo di testo.Cresci tremando durante la notte a 28 gradi Celsius. Il giorno dopo, pellet le colture batteriche centrifugando a 4500 volte G per 20 minuti. Rimescolare il pellet in 100 millilitri di tampone di infiltrazione contenente MES millimolare e solfato di magnesio millimolare.Incubare le sospensioni a temperatura ambiente per tre ore. Mescolare un volume uguale di una sospensione batterica contenente uno dei moduli qui mostrati, con il modulo a cinque numeri primi e il modulo integrase. Usando una siringa senza ago, eserti cinque millilitri della miscela di sospensioni.Premere la punta della siringa contro la parte inferiore della foglia della pianta mentre si applica delicatamente contro pressione sull'altro lato della foglia. Infiltrarsi nelle prime tre foglie completamente espanse, a partire dall'apice, per ogni pianta. Etichettare le foglie agroinfiltrate con l'etichetta di carta sul gambo fogliare.Quindi riportare le piante alla camera di crescita in condizioni standard. Nei giorni da quattro a 14 post-infezione, raccogliere le foglie agroinfiltrate e congelarle in azoto liquido. Conservare questo tessuto vegetale a meno 80 gradi Celsius.In primo luogo, coltivare separatamente i tre trasformatori A.tumefaciens in 50 millilitri di mezzo LB contenente rifampicina ad una concentrazione di 50 microlitri per millilitro e antibiotici appropriati specifici per vettore tremando durante la notte a 28 gradi Celsius. Il giorno dopo, pellet le colture batteriche centrifugando a 4500 volte G per 20 minuti. Resuspend il pellet in 1 litro di tampone di infiltrazione a un OD600 di 0,35 e incubare le sospensioni a temperatura ambiente per tre ore.Aggiungere quindi lo 0,01% del detersivo ad ogni sospensione. Mescolare un volume uguale di una sospensione batterica contenente uno dei moduli qui mostrati con il modulo a cinque numeri primi e il modulo integrase. Inserire una pianta di barbabietola rossa vecchia di sei settimane nel supporto.Invertire il supporto e posizionarlo sopra un becher contenente due litri di un bagno di infiltrazione per immergere le foglie nella sospensione di infiltrazione. Successivamente, trasferire il bagno di infiltrazione con la pianta sommersa nella camera di infiltrazione e chiuderlo. Accendere la pompa per vuoto e aprire la valvola di aspirazione sottovuoto sulla camera di infiltrazione.Una volta che la pressione nella camera è scesa a 90 millibar, mantenere il vuoto per tre minuti. Quindi rilasciare il vuoto per 45 secondi. Quando la camera è tornata alla pressione atmosferica, aprire la camera e rimuovere la pianta infiltrata dal bagno batterico.Riportare la pianta alla camera di crescita. Il giorno della massima espressione, raccogliere le foglie infiltrate e congelarle in azoto liquido come descritto in precedenza. In primo luogo, raccogliere il delta agroinfiltrato sottovuoto 87 GAD65mut esprimendo foglie di barbabietola rossa al picco di espressione e congelarle in azoto liquido.Liofilizzare le foglie congelate a meno 50 gradi Celsius e a 0,04 millibar per 72 ore. Quindi conservali a meno 80 gradi Celsius. Quando è pronto per procedere, macinare le foglie in una polvere fine e conservare a temperatura ambiente in un contenitore sigillato con gel di silice per escludere l'umidità.Per la simulazione della digestione gastrica, pesare 100 milligrammi delle foglie di barbabietola rossa liofilizzato finemente macinate e riprenderle in sei millilitri di PBS. Utilizzare sei acido cloridrico molare per regolare il pH del campione a due. Aggiungere quattro milligrammi per millilitri pepsina dalla mucosa gastrica suina e 10 millimolare acido cloridrico, per ottenere una concentrazione finale di pepsina di un milligrammo per millilitro.Agitare il campione a 37 gradi Celsius per 120 minuti. Quindi, utilizzare idrossido di sodio per regolare il pH del campione a otto e inattivare la pepsina. Trasferire 750 aliquote microliter di ciascun campione in tubi di microcentrifugo e centrifugare le aliquote a 20.000 volte G e a quattro gradi Celsius per 20 minuti.Raccogliere ogni supernatante separatamente e rimescolare ogni pellet in un unico volume supernatante di tampone di carico. Quindi analizzare sia il supernatante che il pellet rimescolato mediante analisi western blot. Per l'analisi dell'integrità cellulare, preparare due campioni di 100 milligrammi delle foglie di barbabietola rossa liofilizzato finemente macinate e rimorsi entrambi in sei millilitri di PBS.Utilizzare sei acido cloridrico molare per regolare il pH di un campione a due. Agitare entrambi i campioni a 37 gradi Celsius per 120 minuti. Quindi aliquote 750 microlitri di ciascun campione a tubi a microcentrifugo.Centrifuga a 20.000 volte G e a 4 gradi Celsius per 20 minuti. Raccogliere ogni supernatante separatamente e rimescolare ogni pellet in un unico volume supernatante di tampone di carico. Quindi analizzare sia il supernatante che il pellet rimescolato mediante analisi western blot.In primo luogo, pesare 100 milligrammi delle foglie di barbabietola rossa liofilizzato finemente macinate e riprenderle in otto millilitri di PBS sterile. Vortice per un minuto. Piatto un millilitro di ogni omogeneato di foglie liofilizzato in uno dei cinque mezzi LB selettivi preparati.Incubare le piastre a 28 gradi Celsius per tre giorni. Dopodiché, conta le colonie di agrobatteri coltivate su ogni piatto e calcola la carica batterica residua come il numero di unità di formazione della colonia per millilitro dell'omogeneato di foglie liofilizzato. In questo lavoro, un vaccino orale è sviluppato nel tessuto vegetale commestibile.Le piante di barbabietola rossa e spinaci vengono manualmente agroinfiltrate con sospensioni di A.tumefaciens che trasportano vettori di espressione ricombinante EGFP, e l'espressione proteica fluorescente è vista dall'analisi western blot e quantificata sotto la luce UV. Il sistema di barbabietole rosse è caratterizzato da una maggiore espressione EGFP, raggiungendo circa 544 microgrammi per grammo di peso fogliare fresco a nove giorni dopo l'infezione, mentre gli spinaci hanno raggiunto solo un livello massimo di circa 113,4 microgrammi per grammo di peso fresco delle foglie su 11 giorni dopo l'infezione. Per questo motivo, la barbabietola rossa viene selezionata come host di espressione per tutti gli esperimenti successivi.Le piante vengono quindi infiltrate sottovuoto con una sospensione A.tumefaciens. Dopo l'estrazione del TSP dalle foglie di agroinfiltrazione, i campioni vengono analizzati dalla macchia occidentale e la proteina ricombinante viene relativamente quantificata da un'analisi densitometrica. Infine, vengono valutati i parametri per lo sviluppo di un potenziale vaccino orale.Come si vede qui, la proteina bersaglio è vista come stabile dopo il processo di lyophilization. La digestione gastrica viene simulata aggiungendo la pepsina enzima gastrica suina al materiale liofilizzato, a una concentrazione finale di un milligrammo per millilitro, o a un rapporto da uno a 20, a TSP. Entrambe le condizioni di trattamento digestivo si traducono in degradazione della proteina ricombinante.L'assenza di un segnale specifico nei campioni di pellet dopo la digestione della pepsina suggerisce che dopo la liofilizzazione, le cellule vegetali hanno perso la loro integrità, e questo ha portato alla degradazione proteica target. La procedura deve essere accuratamente adattata alle specie vegetali per quanto riguarda l'infiltrazione sottovuoto e alla proteina ricombinante bersaglio per quanto riguarda l'analisi del corso del tempo. La procedura di dimostrazione potrebbe essere utilizzata anche per la produzione di biofarmaci destinati alla somministrazione orale, come vaccini e anticorpi.

Research

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