Name: transient expression in red beet of a biopharmaceutical candidate vaccine for type-1 diabetes
Uploaded: 2019-03-19T15:00:00
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この作品は「自己免疫性糖尿病食用ワクチン (eDIVA) 生産ため植物の使用」の共同プロジェクトによって支えられた (プロジェクト ID: 891854) 呼び出し 2014 のフレームワークで、ヴェローナ大学によって資金を供給。

1. 赤いビーツとホウレンソウの栽培
<ol><li>赤カブを育てる (B の尋常性 cvムーラン ルージュ) とほうれん草 (s. キャベツ cvインドゥストリア) 23/21 ° C でそれぞれ照度, 相対湿度 65%, 12 時間の明暗サイクルの 150 Με を使用して成長部屋の植物。</li>
	<li>種子発芽後市販肥料 (材料表) の 1 グラム/L の溶液で週二回植物を肥やしなさい。Agroinfiltration 5 週齢ほうれん草と 6 ?...

<ol>
	<li>Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edible+plants+for+oral+delivery+of+biopharmaceuticals.">Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).</li><li>Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+recombinant+protein+production+in+different+biofactories:+The+green+perspective.">Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective.</a> BioMed Research International. , (2014).</li><li>Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+recovery+of+recombinant+proteins+from+plants.">Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants.</a> Biotechnology Progress. 20 (4), 1001-1014 (2004).</li><li>Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-made+pharmaceuticals+for+the+prevention+and+treatment+of+autoimmune+diseases:+Where+are+we?.">Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we?.</a> Expert Review of Vaccines. 9 (8), 957 (2010).</li><li>Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transfection+of+viral+replicons+for+efficient+transient+expression+in+plants.">Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants.</a> Nature Biotechnology. 23, (2005).</li><li>Ludvigsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+treatment+of+type+1+diabetes+in+childhood.">Update on treatment of type 1 diabetes in childhood.</a> Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).</li><li>Merlin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+GAD65+production+in+plants+using+the+MagnICON+transient+expression+system:+Optimization+of+upstream+production+and+downstream+processing.">Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing.</a> Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).</li><li>Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Analysis+of+Recombinant+Protein+Expression+in+Different+Biofactories:+Bacteria,+Insect+Cells+and+Plant+Systems.">A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).</li><li>Dal Santo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+terroir+concept+interpreted+through+grape+berry+metabolomics+and+transcriptomics.">The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics.</a> Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfiltration+as+an+effective+and+scalable+strategy+of+gene+delivery+for+production+of+pharmaceutical+proteins.">Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins.</a> Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).</li><li>Bertini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+type-1+diabetes+vaccine+candidate+using+edible+plants+expressing+a+major+autoantigen.">Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen.</a> Frontiers in Plant Science. 9, (2018).</li><li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+planta+expression+of+the+human+islet+autoantigen+glutamic+acid+decarboxylase+(GAD65).">Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65).</a> Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).</li><li>Sep&#250;lveda-Jim&#233;nez, G., Rueda-Ben&#237;tez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+red+beet+(Beta+vulgaris)+UDP-glucosyltransferase+gene+induced+by+wounding,+bacterial+infiltration+and+oxidative+stress.">A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress.</a> Journal of Experimental Botany. 56, (2005).</li><li>Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+for+enhancing+oral+bioavailability+of+peptides+and+proteins.">Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins.</a> International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).</li><li>. Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction Available from: <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction">https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction</a> (2015)</li><li>Kamei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexation+hydrogels+for+intestinal+delivery+of+interferon+beta+and+calcitonin.">Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin.</a> Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).</li><li>Tuesca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexation+hydrogels+for+oral+insulin+delivery:+effects+of+polymer+dosing+on+in+vivo+efficacy.">Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).</li><li>Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+yield+of+recombinant+pharmaceutical+proteins+in+plants.">Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants.</a> Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).</li><li>Dhama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-based+oral+vaccines+for+human+and+animal+pathogens+&#8211;+a+new+era+of+prophylaxis:+current+and+future+perspectives.">Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens &#8211; a new era of prophylaxis: current and future perspectives.</a> Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447, 75-93 (2013).</li><li>Hefferon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconceptualizing+cancer+immunotherapy+based+on+plant+production+systems.">Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems.</a> Future science. O3, (2017).</li></ol>

本研究では、自己免疫の糖尿病のための候補者の経口ワクチンの設計のための予備的な分析を示した。この実験のターゲット蛋白質は人間 65 kDa の生産と機能が、容易に検出および測定可能な12グルタミン酸脱炭酸酵素の変異する形式だった別の食用の植物の組織での発現ベクトル5では非常に短い時間枠で組換えタンパク質生産の高いレベルを仲介媒介だ?...

1980 年代に植物分子生物学の革命以来バイオ医薬品の生産のための植物ベースのシステムは、微生物や哺乳動物細胞1に基づく従来のシステムに代わるものとして考えることが。植物は、スケーラビリティ、費用対効果と安全が最も関連性の高い2伝統的なプラットフォーム上のいくつかの利点を表示します。遺伝子組換え製品の形質転換体組織から精製や、経口的、どちらか口頭配達の直接変換の食用植物を使用ことができます経口投与し、また、することができます。経口ルートは同時に粘膜と全身の免疫を促進し、針や専門の医療関係者のための必要があります。さらに、口頭配達は通常組換え蛋白質3の総製造費用の 80% を占めている複雑なダウン ストリーム処理を排除します。すべてのこれらの利点は、生産、供給および労働の各投与量、世界の人口のほとんどが薬を手頃な価格のコスト削減で節約に翻訳できます。
安定した変換と過渡式の両方のいくつかの戦略は、植物における遺伝子組換え蛋白質の生産のために開発されました。その中で、高収率解体工場式のウイルス ベース システム (例えば、magnICON) は比較的短いタイム スケール4で組換えタンパク質の高収率をリードする優れた性能を提供します。ベンサミアーナ タバコ植物の植物ウイルス ベースの式を用いた一過性発現の多くの例が報告されているゴールド スタンダード本番ホストをされています。ただし、このモデルの植物はアルカロイドとその葉の蓄積は、他の毒性代謝産物により食用種とみなされない。
この作品は、赤ビート 2 つの食用植物システムの比較について述べる (ベータ版尋常 cvムーラン ルージュ) とほうれん草 (及ぼす oleracea cvインドゥストリア)、グルタミン酸の 65 kDa のアイソ フォームの 2 つの候補形式の表現のため脱炭酸酵素 (GAD65) 植物ウイルス ベースで実施の5 をベクトルします。GAD65 はタイプ 1 の糖尿病 (T1D) に関連付けられている主要な自己抗原と、それは現在または許容値6を誘導することによって T1D を遅延するを防ぐため人間臨床試験で調査中。植物における GAD65 の生産は、タバコと(名) ベンサミアーナ4,5,6,7としてモデル植物で広く研究されています。ここでは、直接口頭配達のために意味することができます組織の分子の生産のための食用植物の種の使用について述べる。ビューの技術的な観点から検討し、異なるパラメーターを評価することによって植物の agroinfiltration のシステムと GAD65 の生産のための食用植物プラットフォームを選択: 組換え蛋白質の表現のレベル、残留微生物工場にて組織の口頭配達、胃の消化に GAD65 の抵抗と野生型に変換された植物の同等のためのもの。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2-&#956;m Minisart RC4 membrane filters</td>
			<td>Sartorius-Stedim</td>
			<td>17764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8211;mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td>pH 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27221</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td>Toxic &#8211; 0.1 M stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Bacteriological Grade</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0949</td>
			<td>15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-eGFP antibody</td>
			<td>ABCam</td>
			<td>ab290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAD 65/67 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-LHCB2 antibody</td>
			<td>Agrisera</td>
			<td>AS01 003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 &#956;m) Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Guard Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 &#956;m) Guard&#160; Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CalMag Grower</td>
			<td>Peter Excel</td>
			<td>15-5-15</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>C0109</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708370</td>
			<td>ChemiDoc Touch Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5927</td>
			<td>Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence reader</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>&#160;1420-011</td>
			<td>VICTOR Multilabel Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td>15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1758</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 &#956;m) Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC Guard Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 &#956;m) Guard&#160; Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6154</td>
			<td>Do not freeze/thaw too many times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Autosampler</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>System Gold 508 Autosampler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>System Gold 128 Solvent Module HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>24137</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K4000</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol solution</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td>Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizator</td>
			<td>5Pascal</td>
			<td>LIO5P0000DGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectometer</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>&#160; -</td>
			<td>Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk-blocking solution</td>
			<td>Ristora</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>3 % in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282</td>
			<td>&#160;Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulase membrane</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase substrate ECL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2235</td>
			<td>Light sensitive material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Vacuum Press</td>
			<td>VWR</td>
			<td>111400000098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643</td>
			<td>Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643</td>
			<td>Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>R0146</td>
			<td>Toxic &#8211; 25 mg/mL stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium dodecyl sulphate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metabisulphite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7681-57-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator system</td>
			<td>Soltec</td>
			<td>090.003.0003</td>
			<td>Sonica&#174; 2200 MH; frequency 40 khz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent fixed 300-&#181;L insert glass tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11573680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>TRP03</td>
			<td>10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Heto</td>
			<td>3878 F1-3</td>
			<td>Speed-vac System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>39253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y1333</td>
			<td>5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient expression in red beet of a biopharmaceutical candidate vaccine for type-1 diabetes

分子農業の興味の分子を生成するために植物の使用であります。このような観点で植物が両方使用するバイオリアクターとして生産と最終製品のそれに続く浄化のため、異種蛋白質の直接の口頭配達の食用植物の種を使用する場合。この作品は、食用植物を用いて解体工場ウイルスによる組換え DNA 技術、真空浸潤と配信のタイプ 1 の糖尿病 (T1D) に対する候補の経口ワクチンの開発を紹介します。我々 の結果は、赤いビーツが T1D ワクチンとして有望な候補であると T1D に関連付けられている人間の派生疱瘡一過性発現に適したホストであることを示します。胃消化に対する抵抗力、細菌の残留電荷の存在および潜在的な使用のためのプロセス生産の概要を与える彼らの二次代謝プロファイル、自己抗原の生産葉が特徴付けられた徹底的に植物による異種タンパク質の直接の口頭配達のため。我々 の分析を示した次のシミュレートされた胃の消化は、GAD の植物由来ワクチンの製造にカプセル化戦略が必要なことを示唆している凍結候補の経口ワクチンのほぼ完全劣化。

この作品は、食用植物組織の経口ワクチンの開発のためのワークフローが表示されます。この作品の焦点は、食用宿主植物のターゲット蛋白質の発現と潜在的な経口ワクチンの評価です。
最初のステップでは、食用植物システムで組換えタンパク質を生産する植物ウイルス ベース式技術の適合性の評価を関与しています?...

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Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes

1 型糖尿病のバイオ医薬品候補ワクチンの赤カブの一過性発現

ここでは、食用植物の 1 型糖尿病に対する経口ワクチン候補を生成するためのプロトコルを提案する.

Plant molecular farming is the use of plants to produce molecules of interest. In this perspective, plants may be used both as bioreactors for the ...

植物における組換えタンパク質の生産のための異なる戦略の中で、分解された植物ベースのVERS発現は、相対的な短い時間枠にわたって高い収率につながる優れた性能を提供する。経口ワクチンの製造のためのこの技術の複製は、近い将来、従来のワクチンに代わる大きな可能性を秘めています。一過性形質転換した凍結乾燥赤いビート葉は、1型糖尿病予防における経口耐性誘導に適した量のフォト抗原を蓄積する。この実験プロトコルは、組換えタンパク質蓄積のケースバイケース評価の後、多くの異なる食用種に拡張することができる。この手順のデモンストレーションは、エドアルド・ベルティーニ、マッティア・サントーニ、アンナ・ククルッロ、ロベルタ・ザンピエリです。この手順を開始するには、テキストプロトコルで概説されているように、成長室で赤いビートとほうれん草の植物を成長させます。種子の発芽後、1リットル当たり1グラムの濃度で市販の肥料の溶液で週2回植物を受精させる。アグロインフィルトレーションの場合は、5週間齢のほうれん草と6週間齢の赤いビート植物を使用してください。植物発現ベクターを構築した後、テキストプロトコルで概説されているように、リファンピシンを含むLB培地の3つのA.tumefacienを50ミリリットルのLB培地で、ミリリットル当たり50マイクログラムの濃度で、ベクター特異的抗生物質で接種する。摂氏28度で一晩振って成長する。翌日、4500倍Gで20分間遠心することにより細菌培養をペレット化した。10ミリモルMESと10ミリモル硫酸マグネシウムを含む浸潤緩衝液の100ミリリットルでペレットを再懸濁します。懸濁液を室温で3時間インキュベートする。ここに示すモジュールの1つを含む細菌懸濁液の等量を、5つの素数モジュールとインテグラーゼモジュールと混合します。注射器を針なしで使用し、5ミリリットルの懸濁液を取り出す。葉の反対側に軽くカウンター圧力をかけながら、シリンジの先端を植物葉の下側に押し付けます。最初の3つの完全に拡張された葉を、各植物の頂点から始めて浸入する。農浸し葉に葉の茎に紙のタグを付けてラベルを付けます。次に、植物を標準条件下で成長室に戻します。感染後4~14日目には、浸潤した葉を採取し、液体窒素で凍結する。この植物組織をマイナス80度で保管してください。まず、リファンピシンを含むLB培地の3つのA.tumefacienを1ミリリットル当たり50マイクロリットルの濃度で別々に成長させ、摂氏28度で一晩振ることによって適切なベクター特異的抗生物質を成長させる。翌日、4500倍Gで20分間遠心することにより細菌培養をペレット化した。1リットルの浸潤バッファーでペレットを0.35のOD600に再懸濁し、3時間室温で懸濁液をインキュベートする。その後、各懸濁液に洗剤の0.01%を加えます。ここに示すモジュールの1つを含む細菌懸濁液の等容数を5つの素数モジュールとインテグラーゼモジュールと混合します。1 6週齢の赤いビート工場をホルダーに挿入します。ホルダーを反転し、浸潤懸濁液中の葉を水没させるために浸潤浴の2リットルを含むビーカーの上に置きます。この後、浸潤槽に水没植物と浸潤浴を移し、それを閉じます。真空ポンプをオンにし、浸潤チャンバーの真空吸気バルブを開きます。チャンバー内の圧力が90ミリバールに落ちたら、3分間真空を維持します。その後、真空を45秒間放出します。チャンバーが大気圧に戻ったら、チャンバーを開き、浸潤した植物を細菌風呂から取り除きます。成長室に植物を返します。最大発現の日に、浸潤した葉を収穫し、前述のように液体窒素で凍結する。まず、発現ピーク時に赤いビートの葉を発現する真空アグローフィルトデルタ87GAD65mutを収穫し、液体窒素で凍結する。凍った葉をマイナス50度、0.04ミリバールで72時間凍結乾燥させます。その後、マイナス80度で保存します。先に進む準備ができたら、葉を細かい粉末に粉砕し、シリカゲルで密閉された容器に室温で保存し、水分を除外します。胃消化シミュレーションの場合、乾燥した赤いビートの葉を細かく粉砕した100ミリグラムの重さを量り、PBSの6ミリリットルで再中断します。サンプルpHを2に調整するために6モル塩酸を使用してください。ブタ胃粘膜からペプシン当たり4ミリグラム、塩酸10ミリモルを加え、1ミリリットル当たり1ミリグラムの最終的なペプシン濃度を得る。37°Cでサンプルを120分間振ります。次に、水酸化ナトリウムを使用してサンプルpHを8に調整し、ペプシンを不活性化する。各サンプルの750マイクロリットルのアリコートをマイクロ遠心チューブに移し、20,000倍Gで4度の摂氏で遠心分離します。各上清を別々に集め、各ペレットを積み込みバッファーの1つの上清体積で再懸濁する。次いで、ウェスタンブロット分析により上清と再懸濁ペレットの両方を分析します。細胞の完全性分析のために、細かく粉砕された凍結乾燥した赤いビートの葉の100ミリグラムの2つのサンプルを準備し、PBSの6ミリリットルで両方を再中断します。1サンプルのpHを2個に調整するには、6モル塩酸を使用します。両方のサンプルを摂氏37度で120分間振ります。次に、各試料のアリコート750マイクロリットルをマイクロ遠心チューブにする。20,000倍Gで遠心分離機、摂氏4度で20分間。各上清を別々に集め、各ペレットを積み込みバッファーの1つの上清体積で再懸濁する。次いで、ウェスタンブロット分析により上清と再懸濁ペレットの両方を分析します。まず、細かく粉砕された凍結乾燥した赤いビートの葉の100ミリグラムを計量し、滅菌PBSの8ミリリットルでそれを再中断します。1分間渦。各凍結乾燥葉の1ミリリットルを、調製した5つの選択的LB培地のうちの1つにホモゲネートする。3日間摂氏28度でプレートをインキュベートします。この後、各プレートに成長したアグロバクテリウムコロニーを数え、凍結乾燥葉ホモジネートの1ミリリットル当たりのコロニー形成単位数として残存細菌電荷を算出する。この研究では、経口ワクチンが食用植物組織で開発される。赤いビートとほうれん草の植物は、EGFP組換え発現ベクターを運ぶA.tumefaciensの懸濁液で手動でアグロインフィルされ、蛍光タンパク質発現はウエスタンブロット分析によって可視化され、UV光下で定量されます。赤いビートシステムは、感染後9日間で新鮮な葉の重量のグラムあたり約544マイクログラムに達し、ほうれん草は感染後11日間に新鮮な葉の重量のグラム当たり約113.4マイクログラムの最大レベルに達しただけで、より高いEGFP発現を特徴とする。このため、赤いビートは、すべての後続の実験の式ホストとして選択されます。その後、植物はA.tumefaciens懸濁液で真空浸潤されます。農浸潤葉からのTSP抽出後、試料をウェスタンブロットで分析し、組換えタンパク質を濃度測定法解析により相対的に定量する。最後に、潜在的な経口ワクチンの開発のためのパラメータが評価される。ここで見られるように、標的タンパク質は凍結乾燥プロセスの後に安定であることがわかる。胃消化は、ブタ胃酵素ペプシンを凍結乾燥材料に加えることによってシミュレートされ、1ミリリットル当たり1ミリグラムの最終濃度、または1〜20の比率をTSPに加える。両方の消化処理条件は、組換えタンパク質の分解をもたらす。ペプシン消化後のペレットサンプルに特異的なシグナルがないことは、凍結乾燥後に植物細胞が完全性を失い、これが標的タンパク質分解につながったことを示唆している。この手順は、真空浸潤に関しては植物種に注意深く適応されるべきであり、タイムコース解析に関しては標的組換えタンパク質に適合させるべきである。デモンストレーション手順は、ワクチンや抗体などの経口送達を目的としたバイオ医薬品の製造にも使用される可能性があります。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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