Name: transient expression in red beet of a biopharmaceutical candidate vaccine for type-1 diabetes
Uploaded: 2019-03-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelo projeto comum "O uso de plantas para a produção de uma vacina comestível de diabetes auto-imune (eDIVA)" (projeto ID: 891854) financiado pela Universidade de Verona, no âmbito da chamada de 2014.

1. vermelho cultivo de beterraba e espinafre
<ol><li>Crescer a beterraba vermelha (b. vulgaris cv Moulin Rouge) e espinafre (S. oleracea cv Industria) plantas em uma câmara de crescimento, usando 150 µE de intensidade da luz, umidade relativa de 65%, ciclo claro/escuro de 12 h 23/21 ° c, respectivamente.</li>
	<li>Após a germinação de sementes, adubar as plantas duas vezes por semana com uma solução de 1 g/L de um fertilizante comercialmente disponível (Tabela de materiais). ...

<ol>
	<li>Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edible+plants+for+oral+delivery+of+biopharmaceuticals.">Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).</li><li>Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+recombinant+protein+production+in+different+biofactories:+The+green+perspective.">Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective.</a> BioMed Research International. , (2014).</li><li>Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+recovery+of+recombinant+proteins+from+plants.">Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants.</a> Biotechnology Progress. 20 (4), 1001-1014 (2004).</li><li>Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-made+pharmaceuticals+for+the+prevention+and+treatment+of+autoimmune+diseases:+Where+are+we?.">Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we?.</a> Expert Review of Vaccines. 9 (8), 957 (2010).</li><li>Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transfection+of+viral+replicons+for+efficient+transient+expression+in+plants.">Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants.</a> Nature Biotechnology. 23, (2005).</li><li>Ludvigsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+treatment+of+type+1+diabetes+in+childhood.">Update on treatment of type 1 diabetes in childhood.</a> Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).</li><li>Merlin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+GAD65+production+in+plants+using+the+MagnICON+transient+expression+system:+Optimization+of+upstream+production+and+downstream+processing.">Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing.</a> Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).</li><li>Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Analysis+of+Recombinant+Protein+Expression+in+Different+Biofactories:+Bacteria,+Insect+Cells+and+Plant+Systems.">A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).</li><li>Dal Santo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+terroir+concept+interpreted+through+grape+berry+metabolomics+and+transcriptomics.">The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics.</a> Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfiltration+as+an+effective+and+scalable+strategy+of+gene+delivery+for+production+of+pharmaceutical+proteins.">Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins.</a> Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).</li><li>Bertini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+type-1+diabetes+vaccine+candidate+using+edible+plants+expressing+a+major+autoantigen.">Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen.</a> Frontiers in Plant Science. 9, (2018).</li><li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+planta+expression+of+the+human+islet+autoantigen+glutamic+acid+decarboxylase+(GAD65).">Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65).</a> Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).</li><li>Sep&#250;lveda-Jim&#233;nez, G., Rueda-Ben&#237;tez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+red+beet+(Beta+vulgaris)+UDP-glucosyltransferase+gene+induced+by+wounding,+bacterial+infiltration+and+oxidative+stress.">A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress.</a> Journal of Experimental Botany. 56, (2005).</li><li>Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+for+enhancing+oral+bioavailability+of+peptides+and+proteins.">Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins.</a> International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).</li><li>. Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction Available from: <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction">https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction</a> (2015)</li><li>Kamei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexation+hydrogels+for+intestinal+delivery+of+interferon+beta+and+calcitonin.">Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin.</a> Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).</li><li>Tuesca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexation+hydrogels+for+oral+insulin+delivery:+effects+of+polymer+dosing+on+in+vivo+efficacy.">Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).</li><li>Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+yield+of+recombinant+pharmaceutical+proteins+in+plants.">Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants.</a> Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).</li><li>Dhama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-based+oral+vaccines+for+human+and+animal+pathogens+&#8211;+a+new+era+of+prophylaxis:+current+and+future+perspectives.">Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens &#8211; a new era of prophylaxis: current and future perspectives.</a> Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447, 75-93 (2013).</li><li>Hefferon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconceptualizing+cancer+immunotherapy+based+on+plant+production+systems.">Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems.</a> Future science. O3, (2017).</li></ol>

Neste estudo mostramos análise preliminar para a concepção de uma vacina oral contra o candidato para diabetes auto-imune. A proteína do alvo para este experimento foi uma forma mutante do humano 65 kDa glutamato descarboxilase, que produção e funcionalidade são facilmente detectáveis e mensuráveis12. Sua expressão em tecidos diferentes vegetais comestíveis foi mediado por vetores5, que mediar um elevado nível de produção de proteínas recombinantes em um per?...

Desde a revolução de biologia molecular de plantas na década de 1980, os sistemas à base de plantas para a produção de biofármacos podem ser considerados como uma alternativa aos tradicionais sistemas baseados em células de mamíferos e microbiana1. As plantas exibem várias vantagens sobre plataformas tradicionais, com escalabilidade, custo-efetividade e segurança, sendo os mais relevantes2. O produto recombinante pode ser purificado a partir do tecido de planta transformada e administrado, também por via parentérica ou por via oral e, além disso, planta comestível transformada pode ser usada diretamente para entrega oral. Via oral simultaneamente promove a imunidade da mucosa e sistêmica, e elimina a necessidade de agulhas e pessoal médico especializado. Além disso, entrega oral elimina o complexo processamento a jusante, que normalmente responde por 80% do custo total de fabricação de uma proteína recombinante3. Todas essas vantagens podem ser traduzidas em economia de produção, suprimentos e mão de obra reduzindo os custos de cada dose, tornando a droga acessível à maioria da população mundial.
Várias estratégias, tanto para a transformação estável e expressão transiente, foram desenvolvidas para a produção de proteínas recombinantes em plantas. Entre eles, um sistema de expressão baseada em vírus de planta desconstruída de alto rendimento (por exemplo, magnICON) fornece desempenho superior levando altos rendimentos de proteínas recombinantes em prazos relativamente curtos4. Muitos exemplos de expressão transiente, usando o sistema de expressão baseada em vírus de planta em plantas de Nicotiana benthamiana são relatados, sendo o host de produção padrão-ouro. No entanto, esta planta de modelo não é considerada como uma espécie comestível devido os alcaloides e outros metabolitos tóxicos que são acumulados em suas folhas.
Neste trabalho, descrevemos a comparação entre dois sistemas de plantas comestíveis, beterraba vermelha (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) e espinafre (Spinacea oleracea cv Industria), para a expressão de duas formas de candidato do isoform 65 kDa de ácido glutâmico descarboxilase (GAD65), realizado pela planta baseados em vírus vetores5. GAD65 é um autoantigen importante associada a Diabetes tipo 1 (T1D) e é atualmente sob investigação em ensaios clínicos humanos para impedir ou atrasar T1D através da indução de tolerância6. A produção de GAD65 em plantas tem sido estudada extensivamente em espécies de plantas de modelo como tabacum do Nicotiana benthamiana s.4,5,6,e7. Aqui, descrevemos a utilização de espécies vegetais comestíveis para a produção da molécula em tecidos que pode ser destinada a uma entrega oral direta. Do ponto de vista técnico, estudamos e selecionado o sistema de agroinfiltration da planta e a plataforma de planta comestível para produção de GAD65 avaliando parâmetros diferentes: a expressão da proteína recombinante os níveis, a carga microbiana residual em planta tecido destinado a entrega oral, a resistência de GAD65 para a digestão gástrica e a bioequivalência das plantas transformadas com o tipo selvagem.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2-&#956;m Minisart RC4 membrane filters</td>
			<td>Sartorius-Stedim</td>
			<td>17764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8211;mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td>pH 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27221</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td>Toxic &#8211; 0.1 M stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Bacteriological Grade</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0949</td>
			<td>15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-eGFP antibody</td>
			<td>ABCam</td>
			<td>ab290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAD 65/67 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-LHCB2 antibody</td>
			<td>Agrisera</td>
			<td>AS01 003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 &#956;m) Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Guard Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 &#956;m) Guard&#160; Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CalMag Grower</td>
			<td>Peter Excel</td>
			<td>15-5-15</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>C0109</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708370</td>
			<td>ChemiDoc Touch Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5927</td>
			<td>Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence reader</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>&#160;1420-011</td>
			<td>VICTOR Multilabel Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td>15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1758</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 &#956;m) Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC Guard Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 &#956;m) Guard&#160; Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6154</td>
			<td>Do not freeze/thaw too many times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Autosampler</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>System Gold 508 Autosampler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>System Gold 128 Solvent Module HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>24137</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K4000</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol solution</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td>Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizator</td>
			<td>5Pascal</td>
			<td>LIO5P0000DGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectometer</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>&#160; -</td>
			<td>Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk-blocking solution</td>
			<td>Ristora</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>3 % in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282</td>
			<td>&#160;Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulase membrane</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase substrate ECL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2235</td>
			<td>Light sensitive material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Vacuum Press</td>
			<td>VWR</td>
			<td>111400000098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643</td>
			<td>Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643</td>
			<td>Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>R0146</td>
			<td>Toxic &#8211; 25 mg/mL stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium dodecyl sulphate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metabisulphite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7681-57-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator system</td>
			<td>Soltec</td>
			<td>090.003.0003</td>
			<td>Sonica&#174; 2200 MH; frequency 40 khz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent fixed 300-&#181;L insert glass tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11573680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>TRP03</td>
			<td>10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Heto</td>
			<td>3878 F1-3</td>
			<td>Speed-vac System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>39253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y1333</td>
			<td>5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient expression in red beet of a biopharmaceutical candidate vaccine for type-1 diabetes

Agricultura molecular de plantas é o uso de plantas para produzir moléculas de interesse. Nesta perspectiva, plantas podem ser utilizadas tanto como biorreatores para produção e purificação subsequente do produto final e para a entrega oral direta de proteínas heterólogos quando utilizar espécies de plantas comestíveis. Neste trabalho, apresentamos o desenvolvimento de uma vacina oral do candidato contra Diabetes tipo 1 (T1D) em sistemas de planta comestível, usando a tecnologia de baseados em vírus recombinante DNA planta desconstruída, entregada com infiltração de vácuo. Nossos resultados mostram que a beterraba vermelha é um hospedeiro adequado para a expressão transiente de um autoantigen derivada humana associada à T1D, considerado um candidato promissor como vacina T1D. Folhas, produzindo o autoantigen completamente foram caracterizadas por sua resistência à digestão gástrica, a presença de carga bacteriana residual e por seu perfil metabólico secundário, dando uma visão geral sobre a produção de processo para o potencial de uso de plantas para entrega oral directa de uma proteína heteróloga. Nossa análise mostrou quase completa degradação da vacina oral liofilizado candidato seguindo uma simulado digestão gástrica, sugerindo que uma estratégia de encapsulamento na fabricação da vacina de origem vegetal GAD é necessária.

Neste trabalho, é apresentado o fluxo de trabalho para o desenvolvimento de uma vacina oral em tecidos vegetais comestíveis. O foco deste trabalho é a expressão de uma proteína do alvo em uma espécie de planta comestível do anfitrião e a caracterização da vacina oral potencial.
A primeira etapa envolveu a avaliação da adequação da tecnologia de expressão baseada em vírus planta para a produção de proteínas rec...

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Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes

Expressão transiente em beterraba vermelha de uma vacina candidata biofarmacêutica para Diabetes tipo-1

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir um candidato de vacina oral contra a diabetes tipo 1 em uma planta comestível.

Plant molecular farming is the use of plants to produce molecules of interest. In this perspective, plants may be used both as bioreactors for the ...

Entre as diferentes estratégias de produção de proteína recombinante nas plantas, a expressão VERS baseada em plantas desconstruída proporciona desempenho superior, levando a altos rendimentos em um período relativo curto de tempo. A replicação dessa tecnologia para a produção de uma vacina oral tem um grande potencial para se tornar uma alternativa às vacinas convencionais em um futuro próximo. As folhas de beterraba vermelha liofilizadas transformadas transitoriamente acumulam uma quantidade de antígenos fotográficos adequados para indução de tolerância oral na prevenção do diabetes tipo um.Este protocolo experimental poderia ser estendido a muitas espécies comestíveis diferentes após uma avaliação caso a caso do acúmulo de proteínas recombinantes. Os que demonstrarão o procedimento serão Edoardo Bertini, Mattia Santoni, Anna Cuccurullo e Roberta Zampieri. Para iniciar esse procedimento, plante plantas de beterraba vermelha e espinafre em uma câmara de crescimento, conforme descrito no protocolo de texto.Após a germinação das sementes, fertilize as plantas duas vezes por semana com uma solução de fertilizante comercialmente disponível a uma concentração de um grama por litro. Para agroinfiltração, use espinafre de cinco semanas e plantas de beterraba vermelha de seis semanas. Após a construção dos vetores de expressão vegetal, inocular os três transformadores A.tumefaciens em 50 mililitros de meio LB contendo rifampicina a uma concentração de 50 microgramas por mililitro e antibióticos específicos do vetor, conforme descrito no protocolo de texto.Cresça tremendo durante a noite a 28 graus Celsius. No dia seguinte, pelota as culturas bacterianas por centrifugação a 4500 vezes G por 20 minutos. Resuspend a pelota em 100 mililitros de tampão de infiltração contendo 10 milimôlares MES e 10 mililitros de magnésio sulfato.Incubar as suspensões em temperatura ambiente por três horas. Misture um volume igual de uma suspensão bacteriana contendo um dos módulos aqui mostrados, com o módulo cinco prime e o módulo integrase. Usando uma seringa sem agulha, tire cinco mililitros da mistura de suspensão.Pressione a ponta da seringa contra a parte inferior da folha de plantas enquanto aplica suavemente contra a pressão do outro lado da folha. Infiltrar-se nas três primeiras folhas completamente expandidas, a partir do ápice, para cada planta. Rotule as folhas agroinfiladas com a etiqueta de papel na haste da folha.Em seguida, devolva as plantas à câmara de crescimento em condições padrão. Nos dias quatro a 14 pós-infecção, recolhe as folhas agroinfiladas e congela-as em nitrogênio líquido. Armazene este tecido vegetal a menos 80 graus Celsius.Primeiro, cultivar separadamente os três transformadores A.tumefaciens em 50 mililitros de meio LB contendo rifampicina a uma concentração de 50 microliters por mililitro, e antibióticos específicos de vetores apropriados balançando durante a noite a 28 graus Celsius. No dia seguinte, pelota as culturas bacterianas por centrifugação a 4500 vezes G por 20 minutos. Resuspente a pelota em 1 litro de tampão de infiltração para um OD600 de 0,35, e incubar as suspensões em temperatura ambiente por três horas.Em seguida, adicione 0,01% do detergente a cada suspensão. Misture um volume igual de uma suspensão bacteriana contendo um dos módulos aqui mostrados com o módulo cinco prime e o módulo integrase. Insira uma planta de beterraba vermelha de seis semanas no suporte.Inverta o suporte e coloque-o em cima de um béquer contendo dois litros de um banho de infiltração para submergir as folhas na suspensão de infiltração. Depois disso, transfira o banho de infiltração com a planta submersa para a câmara de infiltração e feche-a. Ligue a bomba de vácuo e abra a válvula de admissão de vácuo na câmara de infiltração.Uma vez que a pressão na câmara tenha caído para 90 milibar, mantenha o vácuo por três minutos. Em seguida, solte o vácuo por 45 segundos. Quando a câmara voltar à pressão atmosférica, abra a câmara e remova a planta infiltrada do banho bacteriano.Devolva a planta para a câmara de crescimento. No dia da expressão máxima, colhia as folhas infiltradas e congele-as em nitrogênio líquido como descrito anteriormente. Primeiro, colher o delta agroinfilto de vácuo 87 GAD65mut expressando folhas de beterraba vermelha no pico de expressão, e congelá-las em nitrogênio líquido.Lyophilize as folhas congeladas a menos 50 graus Celsius e a 0,04 milibar por 72 horas. Em seguida, armazená-los a menos 80 graus Celsius. Quando estiver pronto para prosseguir, triture as folhas em um pó fino e guarde à temperatura ambiente em um recipiente selado com gel de sílica para excluir a umidade.Para a simulação de digestão gástrica, pesar 100 miligramas das folhas de beterraba vermelhas finamente congeladas e resuspensá-la em seis mililitros de PBS. Use seis ácidos clorídricos molares para ajustar o pH da amostra a dois. Adicione quatro miligramas por pepsina mililitros da mucosa gástrica suína, e 10 milimólars de ácido clorídrico, para obter uma concentração final de pepsina de um miligrama por mililitro.Agite a amostra a 37 graus Celsius por 120 minutos. Em seguida, use hidróxido de sódio para ajustar o pH amostral para oito e inativar a pepsina. Transfira 750 alíquotas de microliter de cada amostra para tubos de microcentrifuuagem, e centrifugar as alíquotas a 20.000 vezes G e a quatro graus Celsius por 20 minutos.Colete cada supernante separadamente e resuspense cada pelota em um volume supernacante de buffer de carregamento. Em seguida, analise tanto o supernasal quanto a pelota resuspended pela análise de manchas ocidentais. Para a análise de integridade celular, prepare duas amostras de 100 miligramas das folhas de beterraba vermelha finamente secas e resuspenque ambos em seis mililitros de PBS.Use seis ácidos clorídricos molares para ajustar o pH de uma amostra a duas. Agite ambas as amostras a 37 graus Celsius por 120 minutos. Em seguida, alíquota de 750 microliters de cada amostra para microcentrifugar tubos.Centrifugar a 20.000 vezes G e a 4 graus Celsius por 20 minutos. Colete cada supernante separadamente e resuspense cada pelota em um volume supernacante de buffer de carregamento. Em seguida, analise tanto o supernasal quanto a pelota resuspended pela análise de manchas ocidentais.Primeiro, pese 100 miligramas das folhas de beterraba vermelha finamente secas e resuspensá-la em oito mililitros de PBS estéreis. Vórtice por um minuto. Placa um mililitro de cada folha congelada homogeneizar em uma das cinco mídias lb seletivas preparadas.Incubar as placas a 28 graus Celsius por três dias. Depois disso, conte as colônias de agrobacterium cultivadas em cada placa, e calcule a carga bacteriana residual como o número de unidades formadoras de colônias por mililitro da folha congelada homogeneizado. Neste trabalho, uma vacina oral é desenvolvida em tecido vegetal comestível.As plantas de beterraba vermelha e espinafre são manualmente agroinfiladas com suspensões de A.tumefaciens carregando vetores de expressão recombinantes EGFP, e a expressão de proteína fluorescente é visualizada pela análise da mancha ocidental e quantificada sob luz UV. O sistema de beterraba vermelha é caracterizado por uma expressão EGFP mais alta, atingindo aproximadamente 544 microgramas por grama de peso de folha fresca em nove dias após a infecção, enquanto o espinafre atingiu apenas um nível máximo de aproximadamente 113,4 microgramas por grama de peso de folha fresca em 11 dias após a infecção. Por causa disso, a beterraba vermelha é selecionada como o hospedeiro de expressão para todos os experimentos subsequentes.As plantas são então infiltradas a vácuo com uma suspensão de a.tumefaciens. Após a extração de TSP a partir de folhas de agroinfiltração, as amostras são analisadas por mancha ocidental, e a proteína recombinante é relativamente quantificada por uma análise de densitometria. Por fim, são avaliados os parâmetros para o desenvolvimento de uma potencial vacina oral.Como visto aqui, a proteína alvo é vista como estável após o processo de liofilização. A digestão gástrica é simulada adicionando a pepsina de enzima gástrica suína ao material liofilizado, seja a uma concentração final de um miligrama por mililitro, ou uma razão de 1 a 20, ao TSP. Ambas as condições de tratamento digestivo resultam em degradação da proteína recombinante.A ausência de um sinal específico nas amostras de pelotas após a digestão da pepsina sugere que após a secagem congelante, as células vegetais perderam sua integridade, e isso levou à degradação da proteína alvo. O procedimento deve ser cuidadosamente adaptado às espécies vegetais em relação à infiltração a vácuo e à proteína recombinante alvo em relação à análise do curso de tempo. O procedimento de demonstração também pode ser utilizado para a produção de biofarmacêutico destinado à entrega oral, como vacina e anticorpos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Bioengenharia

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