Name: transient expression in red beet of a biopharmaceutical candidate vaccine for type-1 diabetes
Uploaded: 2019-03-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes at JoVE.com

Эта работа была поддержана совместного проекта «Использование растений для производства съедобных вакцины аутоиммунный диабет (eDIVA)» (проект ID: 891854) финансируется Веронский университет – в рамках вызова 2014.

1. красный выращивания свеклы и шпинатом
<ol><li>Расти красной свеклы (B. vulgaris cv Мулен Руж) и шпината (S. oleracea cv Industria) растений в камере роста, используя 150 µE интенсивности света, относительная влажность 65%, 12 h свет/темно цикла в 23/21 ° C, соответственно.</li>
	<li>После прорастания семян Удо?...

<ol>
	<li>Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edible+plants+for+oral+delivery+of+biopharmaceuticals.">Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).</li><li>Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+recombinant+protein+production+in+different+biofactories:+The+green+perspective.">Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective.</a> BioMed Research International. , (2014).</li><li>Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+recovery+of+recombinant+proteins+from+plants.">Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants.</a> Biotechnology Progress. 20 (4), 1001-1014 (2004).</li><li>Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-made+pharmaceuticals+for+the+prevention+and+treatment+of+autoimmune+diseases:+Where+are+we?.">Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we?.</a> Expert Review of Vaccines. 9 (8), 957 (2010).</li><li>Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transfection+of+viral+replicons+for+efficient+transient+expression+in+plants.">Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants.</a> Nature Biotechnology. 23, (2005).</li><li>Ludvigsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+treatment+of+type+1+diabetes+in+childhood.">Update on treatment of type 1 diabetes in childhood.</a> Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).</li><li>Merlin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+GAD65+production+in+plants+using+the+MagnICON+transient+expression+system:+Optimization+of+upstream+production+and+downstream+processing.">Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing.</a> Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).</li><li>Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Analysis+of+Recombinant+Protein+Expression+in+Different+Biofactories:+Bacteria,+Insect+Cells+and+Plant+Systems.">A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).</li><li>Dal Santo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+terroir+concept+interpreted+through+grape+berry+metabolomics+and+transcriptomics.">The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics.</a> Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfiltration+as+an+effective+and+scalable+strategy+of+gene+delivery+for+production+of+pharmaceutical+proteins.">Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins.</a> Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).</li><li>Bertini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+type-1+diabetes+vaccine+candidate+using+edible+plants+expressing+a+major+autoantigen.">Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen.</a> Frontiers in Plant Science. 9, (2018).</li><li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+planta+expression+of+the+human+islet+autoantigen+glutamic+acid+decarboxylase+(GAD65).">Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65).</a> Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).</li><li>Sep&#250;lveda-Jim&#233;nez, G., Rueda-Ben&#237;tez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+red+beet+(Beta+vulgaris)+UDP-glucosyltransferase+gene+induced+by+wounding,+bacterial+infiltration+and+oxidative+stress.">A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress.</a> Journal of Experimental Botany. 56, (2005).</li><li>Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+for+enhancing+oral+bioavailability+of+peptides+and+proteins.">Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins.</a> International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).</li><li>. Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction Available from: <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction">https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction</a> (2015)</li><li>Kamei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexation+hydrogels+for+intestinal+delivery+of+interferon+beta+and+calcitonin.">Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin.</a> Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).</li><li>Tuesca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexation+hydrogels+for+oral+insulin+delivery:+effects+of+polymer+dosing+on+in+vivo+efficacy.">Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).</li><li>Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+yield+of+recombinant+pharmaceutical+proteins+in+plants.">Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants.</a> Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).</li><li>Dhama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-based+oral+vaccines+for+human+and+animal+pathogens+&#8211;+a+new+era+of+prophylaxis:+current+and+future+perspectives.">Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens &#8211; a new era of prophylaxis: current and future perspectives.</a> Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447, 75-93 (2013).</li><li>Hefferon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconceptualizing+cancer+immunotherapy+based+on+plant+production+systems.">Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems.</a> Future science. O3, (2017).</li></ol>

В этом исследовании мы показали предварительный анализ для разработки кандидат оральная вакцина для аутоиммунного диабета. Целевого белка для этого эксперимента был мутировал форме человека 65 кДа Глутаматдекарбоксилаза, которых производство и функциональность являются легко обнар?...

После революции молекулярной биологии растений в 1980-х систем на базе завода для производства биофармацевтических препаратов может рассматриваться как альтернатива традиционным системам на основе клеток микробов и млекопитающих1. Растения отображать несколько преимуществ перед традиционными платформами, с масштабируемости, эффективности и безопасности, будучи наиболее релевантные2. Рекомбинантных продукта может быть очищенной от преобразованного растительной ткани и затем управлением, либо парентерально или устно и, Кроме того, преобразованные съедобных растений может использоваться непосредственно для перорального. Пероральном одновременно содействует слизистых оболочек и системного иммунитета, и это устраняет необходимость иглы и специализированного медицинского персонала. Кроме того перорального устраняет сложной обработке, который обычно приходится 80% от стоимости всего производство рекомбинантных белков3. Все эти преимущества могут быть переведены в экономии средств производства, поставок и труда, снижения расходов по каждой дозы, что делает препарат доступным для большинства мирового населения.
Несколько стратегий, как стабильная трансформации и переходных выражение, были разработаны для производства рекомбинантных белков в растениях. Среди них высокодоходные деконструкции завод на базе вирус выражение системы (например, magnICON) обеспечивает превосходную производительность ведущих высокие урожаи рекомбинантных белков в относительно короткие сроки4. Многие примеры переходных выражения с использованием системы на основе вирус выражение завод в растения Nicotiana benthamiana сообщается, будучи принимающей золотой стандарт производства. Однако эта модель завод не рассматривается как съедобных видов алкалоидов и других токсичных метаболитов, которые накапливаются в его листьях.
В этой работе, мы описываем сравнение между двумя системами съедобных растений, красная свекла (бета vulgaris cv Мулен Руж) и шпинат (Spinacea oleracea cv Industria), для выражения два кандидата форм 65 кДа изоформы глутаминовой кислоты Декарбоксилаза (GAD65), проведенного на заводе на базе вирус векторы5. GAD65 основных аутоантиген, связанные с диабетом 1 типа (T1D) и это в настоящее время под следствием в человека клинические испытания, чтобы предотвратить или отсрочить T1D, вызывая терпимости6. Производство GAD65 в растения широко учился в модель видов растений Nicotiana tabacum и н. benthamiana4,5,6,7. Здесь мы описывают использование видов съедобных растений для производства молекулы в тканях, которые могут быть предназначены для прямой доставки устные. С технической точки зрения, мы изучали и выбрали системы для agroinfiltration растений и съедобных растений платформы GAD65 производства путем оценки различных параметров: рекомбинантных белков уровнях, остаточная микробной заряд на заводе ткани, предназначенные для перорального, сопротивление GAD65 желудочного пищеварения и биоэквивалентности трансформированных растений с дикого типа.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2-&#956;m Minisart RC4 membrane filters</td>
			<td>Sartorius-Stedim</td>
			<td>17764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8211;mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td>pH 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27221</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td>Toxic &#8211; 0.1 M stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Bacteriological Grade</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0949</td>
			<td>15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-eGFP antibody</td>
			<td>ABCam</td>
			<td>ab290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAD 65/67 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-LHCB2 antibody</td>
			<td>Agrisera</td>
			<td>AS01 003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 &#956;m) Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Guard Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 &#956;m) Guard&#160; Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CalMag Grower</td>
			<td>Peter Excel</td>
			<td>15-5-15</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>C0109</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708370</td>
			<td>ChemiDoc Touch Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5927</td>
			<td>Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence reader</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>&#160;1420-011</td>
			<td>VICTOR Multilabel Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td>15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1758</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 &#956;m) Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC Guard Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 &#956;m) Guard&#160; Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6154</td>
			<td>Do not freeze/thaw too many times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Autosampler</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>System Gold 508 Autosampler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>System Gold 128 Solvent Module HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>24137</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K4000</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol solution</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td>Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizator</td>
			<td>5Pascal</td>
			<td>LIO5P0000DGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectometer</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>&#160; -</td>
			<td>Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk-blocking solution</td>
			<td>Ristora</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>3 % in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282</td>
			<td>&#160;Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulase membrane</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase substrate ECL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2235</td>
			<td>Light sensitive material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Vacuum Press</td>
			<td>VWR</td>
			<td>111400000098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643</td>
			<td>Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643</td>
			<td>Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>R0146</td>
			<td>Toxic &#8211; 25 mg/mL stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium dodecyl sulphate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metabisulphite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7681-57-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator system</td>
			<td>Soltec</td>
			<td>090.003.0003</td>
			<td>Sonica&#174; 2200 MH; frequency 40 khz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent fixed 300-&#181;L insert glass tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11573680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>TRP03</td>
			<td>10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Heto</td>
			<td>3878 F1-3</td>
			<td>Speed-vac System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>39253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y1333</td>
			<td>5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient expression in red beet of a biopharmaceutical candidate vaccine for type-1 diabetes

Завод молекулярных земледелие является использование растений для производства молекулы интерес. В этой перспективе растения могут использоваться как биореакторов для последующей очистки конечного продукта и производства и прямых перорального гетерологичных белков при использовании видов съедобных растений. В этой работе мы представляем развития кандидата оральная вакцина против диабета 1 типа (T1D) в системах съедобных растений с использованием деконструкции растений на основе вирус рекомбинатной технологии дна, поставляется с вакуумной инфильтрации. Наши результаты показывают, что красная свекла является подходящей принимающей для переходных выражение человека производные аутоантиген, связанные с T1D, считается перспективным кандидатом как T1D вакцина. Листья, производства аутоантиген были тщательно характерны для их сопротивление желудочного пищеварения, наличие остаточного заряда бактерий и их вторичного метаболизма профиля, давая обзор процесса производства для потенциального использования растений для прямого перорального гетерологичных белка. Наш анализ показал почти полной деградации лиофилизированной кандидат пероральной вакциной после имитации желудочного пищеварения, предполагая, что стратегию инкапсуляции в производстве вакцины растительного ГАД не требуется.

В этой работе представлен рабочий процесс для развития устной вакцины в тканях съедобных растений. В центре внимания этой работы является выражением целевого белка в съедобных принимающей видов растений и характеристика потенциальных пероральной вакциной.
<p class="jo...

Watch this Scientific Journal Video about Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes at JoVE.com

Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes

Переходных выражение в красной свеклы биофармацевтической кандидат вакцины для типа-1 мочеизнурения

Здесь мы представляем протокол производить кандидат оральная вакцина против диабета типа 1 в съедобных растений.

Plant molecular farming is the use of plants to produce molecules of interest. In this perspective, plants may be used both as bioreactors for the ...

Среди различных стратегий производства рекомбинантного белка в растениях, деконструкция растительного экспрессии VERS обеспечивает превосходную производительность, что приводит к высоким урожаям в течение относительно короткого периода времени. Репликация этой технологии для производства пероральной вакцины имеет большой потенциал, чтобы стать альтернативой обычным вакцинам в ближайшем будущем. Лиофилизированные красные листья свеклы, преходяще преобразованные, накапливают количество фото антигенов, пригодных для индукции пероральной толерантности при профилактике диабета типа 1.Этот экспериментальный протокол может быть распространен на множество различных съедобных видов после в каждом конкретном случае оценки рекомбинантного накопления белка. Демонстрацией процедуры будут Эдоардо Бертини, Маттиа Сантони, Анна Куккурулло и Роберта Зампьери. Чтобы начать эту процедуру, вырастить красную свеклу и шпинат растений в камере роста, как указано в текстовом протоколе.После прорастания семян оплодотворяют растения два раза в неделю раствором коммерчески доступных удобрений при концентрации одного грамма на литр. Для агроинфильтрации используйте пятинедельный шпинат и шестинедельные красные растения свеклы. После построения векторов экспрессии растений, привить три A.tumefaciens трансформантов в 50 миллилитров LB среды, содержащей рифампицин при концентрации 50 микрограмм на миллилитр и вектор конкретных антибиотиков, как указано в текстовом протоколе.Расти, встряхивая ночью при 28 градусах по Цельсию. На следующий день гранулы бактериальных культур центрифугирования в 4500 раз G в течение 20 минут. Повторное потребление гранул в 100 миллилитров инфильтрационного буфера, содержащего 10 миллимолярный МЕС и 10 миллимолярный сульфат магния.Инкубировать подвески при комнатной температуре в течение трех часов. Смешайте равный объем бактериальной суспензии, содержащей один из показанных здесь модулей, с пятью премьер-модулем и модулем integrase. Используя шприц без иглы, вывихни пять миллилитров суспензии смеси.Прижимайте кончик шприца к нижней стороне листьев растения, при этом мягко прижимая его к другой стороне листа. Проникнуть первые три полностью расширенных листьев, начиная с вершины, для каждого растения. Этикетка агроинфильтрованных листьев с бумажной биркой на стебле листа.Затем верните растения в камеру роста при стандартных условиях. В дни от 4 до 14 пост-инфекции, собирать агроинфильтрованные листья и заморозить их в жидком азоте. Храните эту растительную ткань при температуре минус 80 градусов по Цельсию.Во-первых, отдельно вырастить три A.tumefaciens трансформаторов в 50 миллилитров LB среды, содержащей рифампицин в концентрации 50 микролитров на миллилитр, и соответствующие вектор-специфические антибиотики, встряхивая ночь при 28 градусов по Цельсию. На следующий день гранулы бактериальных культур центрифугирования в 4500 раз G в течение 20 минут. Переподход гранулы в 1 литр буфера инфильтрации в OD600 0,35, и инкубировать подвески при комнатной температуре в течение трех часов.Затем добавьте 0,01% моющего средства к каждой подвеске. Смешайте равный объем бактериальной суспензии, содержащей один из показанных здесь модулей, с пятью главными модулями и модулем integrase. Вставьте одно шестинедельное красное растение свеклы в держатель.Переверните держатель и поместите его поверх стакана, содержащего два литра инфильтрационной ванны, чтобы погрузить листья в инфильтрацию подвески. После этого перенесите инфильтрацию ванны с погруженным растением в инфильтральную камеру и закройте ее. Включите вакуумный насос и откройте вакуумный клапан на инфильтрационной камере.После того, как давление в камере упало до 90 миллибар, поддерживать вакуум в течение трех минут. Затем отпустите вакуум на 45 секунд. Когда камера вернется к атмосферному давлению, откройте камеру и удалите проникшие растения из бактериальной ванны.Верните растение в камеру роста. В день максимального выражения, урожай проникли листья и заморозить их в жидком азоте, как описано ранее. Во-первых, урожай вакуумной агроинфильтрации дельта 87 GAD65mut выражая красные листья свеклы на пике выражения, и заморозить их в жидком азоте.Лиофилизировать замороженные листья при температуре минус 50 градусов по Цельсию и при температуре 0,04 миллибара в течение 72 часов. Затем храните их при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Когда готовы приступить, измельчить листья до мелкого порошка и хранить при комнатной температуре в герметичном контейнере с кремнеземом гель, чтобы исключить влагу.Для моделирования пищеварения желудка, весят 100 миллиграммов мелко молотого заморозить сушеные листья красной свеклы, и повторно использовать его в шесть миллилитров PBS. Используйте шесть молярной соляной кислоты, чтобы настроить рН образца до двух. Добавьте четыре миллиграмма на миллилитр пепсина из свиной слизистой оболочки желудка и 10 миллимолярной соляной кислоты, чтобы получить окончательную концентрацию пепсина в один миллиграмм на миллилитр.Встряхните образец при 37 градусах по Цельсию в течение 120 минут. Далее используйте гидроксид натрия, чтобы настроить рН образца до восьми и инактивировать пепсин. Перенесите 750 микролитров алицитов каждого образца в микроцентрифуговые трубки и центрифугировать алициты при 20 000 раз G и при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут.Соберите каждый супернатант отдельно и повторно посовекуйте каждую гранулу в один сверхнатантный объем буфера загрузки. Затем проанализируйте как супернатант, так и перерасход гранул с помощью западного анализа помарки. Для анализа целостности клеток, подготовить два образца 100 миллиграммов мелко молотых лиофилизированных листьев красной свеклы, и повторно использовать как в шести миллилитров PBS.Используйте шесть молярной соляной кислоты, чтобы настроить рН одного образца до двух. Встряхните оба образца при 37 градусах по Цельсию в течение 120 минут. Затем aliquot 750 микролитров каждого образца для микроцентрифуг труб.Центрифуга при 20 000 раз G и при 4 градусах Цельсия в течение 20 минут. Соберите каждый супернатант отдельно и повторно посовекуйте каждую гранулу в один сверхнатантный объем буфера загрузки. Затем проанализируйте как супернатант, так и перерасход гранул с помощью западного анализа помарки.Во-первых, весят 100 миллиграммов мелко молотых лиофилизированных листьев красной свеклы и повторно помесят их в восемь миллилитров стерильных PBS. Вихрь на одну минуту. Плита один миллилитр каждого лиофилизированных листьев гомогената в одном из пяти подготовленных селективных СРЕДСТВ LB.Инкубировать пластины при 28 градусах по Цельсию в течение трех дней. После этого подсчитайте колонии агробактерий, выращенные на каждой тарелке, и вычислите остаточный бактериальный заряд как количество единиц колонии, образующих единицы на миллилитр лиофилизированных листьев гомогената. В этой работе, устная вакцина разработана в съедобных тканей растений.Красная свекла и шпинат растения вручную агроинфильтрированы с подвесками A.tumefaciens проведения EGFP рекомбинантных векторов выражения, и флуоресцентные экспрессии белка визуализируется западным анализом пятно и количественно под ультрафиолетовым светом. Красная система свеклы характеризуется более высоким выражением EGFP, достигая приблизительно 544 микрограммов на грамм веса свежего листа в течение девяти дней после заражения, в то время как шпинат достиг максимального уровня примерно 113,4 микрограмма на грамм веса свежего листа на 11 дней после заражения. Из-за этого красная свекла выбирается в качестве хоста выражения для всех последующих экспериментов.Заводы после этого вакуум проинфильтрированы с подвеской A.tumefaciens. После извлечения TSP из листьев агроинфильтрации, образцы анализируются западным пятном, и рекомбинантный белок относительно количественно анализ денситометрии. Наконец, оцениваются параметры разработки потенциальной пероральной вакцины.Как видно здесь, целевой белок считается стабильным после процесса лиофилизации. Пищеварение желудка моделируется путем добавления свиного желудочного фермента пепсина в лиофилизированный материал, либо к конечной концентрации одного миллиграмма на миллилитр, или отношение одного к 20, к TSP. Оба пищеварительных условия лечения приводят к деградации рекомбинантного белка.Отсутствие конкретного сигнала в образцах гранул после переваривания пепсинов говорит о том, что после замораживания сушки растительные клетки потеряли свою целостность, что привело к деградации целевого белка. Процедура должна быть тщательно адаптирована к видам растений в отношении вакуумной инфильтрации и целевого рекомбинантного белка в отношении анализа курса времени. Процедура демонстрации может также использоваться для производства биофармацевтических препаратов, предназначенных для устных родов, таких как вакцина и антитела.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Создание двумерных рисунком Подложки для конфайнмента белков и клеточных

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Сотовая Добыча липидов для целевой Стабильный изотопного разбавления жидкостной хроматографии-масс-спектрометрического анализа

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Создание Переходные поры клеточной мембраны с помощью стандартных струйных принтеров

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Кожа Татуировка как новый подход для доставки ДНК-вакцин

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Характеристика сложных систем по постановке эксперимента подхода: Переходный Белок Expression табачными в качестве примера

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Выражение, изоляция, и очистка растворимых и нерастворимых Биотинилированные белков для нервной ткани Регенерация

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Контролируемая Микрожидкостных Окружающая среда для динамического исследования эритроцитов агрегации

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

Изготовление функционализированного магнитной Бактериальный Nanocellulose с оксида железа наночастицами

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Микрожидкостных Flow Камеры Использование водостойких крови к модели гемостаза и тромбоцитарный Переливание<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Развитие многоклеточного трехмерной модели Органотипической слизистой оболочки пищеварительного тракта человека Выращенный в условиях микрогравитации

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...