Name: transient expression in red beet of a biopharmaceutical candidate vaccine for type-1 diabetes
Uploaded: 2019-03-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes at JoVE.com

Detta arbete stöds av det gemensamma projektet ”användning av växter för framställning av en autoimmun diabetes ätbara vaccin (eDIVA)” (projekt-ID: 891854) finansieras av universitetet i Verona inom ramen för anropet 2014.

1. röda betor och spenat odling
<ol><li>Växa Rödbetssallad (B. vulgaris cv Moulin Rouge) och spenat (S. oleracea cv Industria) växter i en kammare som tillväxt, med 150 µE ljusintensitet, 65% relativ luftfuktighet, 12 h ljus/mörk cykel i 23/21 ° C, respektive.</li>
	<li>Efter frögroning, gödsla växterna två gånger i veckan med en 1 g/L lösning av ett kommersiellt tillgängliga gödselmedel (Tabell för material). Använd fem veckor gamla spenat och sex veckor gamla Rödb...

<ol>
	<li>Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edible+plants+for+oral+delivery+of+biopharmaceuticals.">Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).</li><li>Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+recombinant+protein+production+in+different+biofactories:+The+green+perspective.">Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective.</a> BioMed Research International. , (2014).</li><li>Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+recovery+of+recombinant+proteins+from+plants.">Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants.</a> Biotechnology Progress. 20 (4), 1001-1014 (2004).</li><li>Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-made+pharmaceuticals+for+the+prevention+and+treatment+of+autoimmune+diseases:+Where+are+we?.">Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we?.</a> Expert Review of Vaccines. 9 (8), 957 (2010).</li><li>Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transfection+of+viral+replicons+for+efficient+transient+expression+in+plants.">Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants.</a> Nature Biotechnology. 23, (2005).</li><li>Ludvigsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+treatment+of+type+1+diabetes+in+childhood.">Update on treatment of type 1 diabetes in childhood.</a> Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).</li><li>Merlin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+GAD65+production+in+plants+using+the+MagnICON+transient+expression+system:+Optimization+of+upstream+production+and+downstream+processing.">Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing.</a> Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).</li><li>Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Analysis+of+Recombinant+Protein+Expression+in+Different+Biofactories:+Bacteria,+Insect+Cells+and+Plant+Systems.">A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).</li><li>Dal Santo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+terroir+concept+interpreted+through+grape+berry+metabolomics+and+transcriptomics.">The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics.</a> Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfiltration+as+an+effective+and+scalable+strategy+of+gene+delivery+for+production+of+pharmaceutical+proteins.">Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins.</a> Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).</li><li>Bertini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+type-1+diabetes+vaccine+candidate+using+edible+plants+expressing+a+major+autoantigen.">Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen.</a> Frontiers in Plant Science. 9, (2018).</li><li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+planta+expression+of+the+human+islet+autoantigen+glutamic+acid+decarboxylase+(GAD65).">Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65).</a> Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).</li><li>Sep&#250;lveda-Jim&#233;nez, G., Rueda-Ben&#237;tez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+red+beet+(Beta+vulgaris)+UDP-glucosyltransferase+gene+induced+by+wounding,+bacterial+infiltration+and+oxidative+stress.">A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress.</a> Journal of Experimental Botany. 56, (2005).</li><li>Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+for+enhancing+oral+bioavailability+of+peptides+and+proteins.">Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins.</a> International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).</li><li>. Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction Available from: <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction">https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction</a> (2015)</li><li>Kamei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexation+hydrogels+for+intestinal+delivery+of+interferon+beta+and+calcitonin.">Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin.</a> Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).</li><li>Tuesca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexation+hydrogels+for+oral+insulin+delivery:+effects+of+polymer+dosing+on+in+vivo+efficacy.">Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).</li><li>Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+yield+of+recombinant+pharmaceutical+proteins+in+plants.">Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants.</a> Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).</li><li>Dhama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-based+oral+vaccines+for+human+and+animal+pathogens+&#8211;+a+new+era+of+prophylaxis:+current+and+future+perspectives.">Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens &#8211; a new era of prophylaxis: current and future perspectives.</a> Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447, 75-93 (2013).</li><li>Hefferon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconceptualizing+cancer+immunotherapy+based+on+plant+production+systems.">Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems.</a> Future science. O3, (2017).</li></ol>

I denna studie visade vi en preliminär analys för utformningen av en kandidat oralt vaccin för autoimmun diabetes. Målproteinet för detta experiment var en muterad form av den mänskliga 65 kDa glutamat dekarboxylas, vilka produktion och funktionalitet som enkelt kan upptäckas och mätbara12. Dess uttryck i olika ätliga växt vävnader var medierad av vektorer5, som förmedlar en hög nivå av rekombinant proteinproduktion i en mycket kort tidsram. Valet av den bäst...

Sedan anläggningen molekylärbiologiska revolutionen 1980-talet, kan växt-baserade system för produktion av biologiska läkemedel betraktas som ett alternativ till traditionella system baserat på mikrobiell och däggdjurs celler1. Växter visas flera fördelar jämfört med traditionella plattformar, med skalbarhet, kostnadseffektivitet och säkerheten är den mest relevanta2. Rekombinant produkten kan renas från transformerade växtvävnad och sedan administreras, antingen parenteralt eller peroralt och dessutom omvandlade ätliga växt kan användas direkt för muntliga leverans. Oralt främjar samtidigt slemhinnor och systemisk immunitet, och det eliminerar behovet av nålar och specialiserad medicinsk personal. Dessutom eliminerar muntliga leverans komplexa nedströms bearbetning, som normalt står för 80% av den totala tillverkningskostnaden för en rekombinant protein3. Alla dessa fördelar kan översättas till besparingar i produktion, leveranser och arbetskraft minskade kostnader för varje dos, vilket gör drogen överkomliga för de flesta av världens befolkning.
Flera strategier, både för stabil omvandling och övergående uttryck, utvecklades för produktion av rekombinanta proteiner i växter. Bland dem ger en hög avkastning dekonstrueras växt virus-baserade uttryck system (t.ex. magnICON) överlägsen prestanda leder hög avkastning av rekombinanta proteiner över relativt korta tidsskalor4. Många exempel på övergående uttryck med hjälp av växten virus-baserade uttryck systemet i Nicotiana benthamiana växter är rapporterade, att vara guldmyntfot produktion värden. Denna modell växt betraktas dock inte som en ätliga arter på grund av alkaloider och andra toxiska metaboliter som ackumuleras i dess blad.
I detta arbete, beskriver vi jämförelsen mellan två ätliga växt system, rödbeta (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) och spenat (Spinacea oleracea cv Industria), av uttryck för två kandidat former av den 65 kDa isoformen av glutaminsyra dekarboxylas (GAD65), utförs av växten virus-baserat vektorer5. GAD65 är en större autoantigen som är associerade till typ 1-Diabetes (T1D) och det är för närvarande under utredning i kliniska prövningar att förhindra eller fördröja T1D genom att inducera tolerans6. Produktionen av GAD65 i växter har studerats i modell växtarter som Nicotiana tabacum och N. benthamiana4,5,6,7. Här, beskriver vi användningen av ätliga växter för framställning av molekylen i vävnader som kan vara tänkt för en muntlig direktleverans. Från en teknisk synpunkt, vi studerat och valt systemet för växt agroinfiltration och ätliga växt plattformen för GAD65 produktion genom att utvärdera olika parametrar: uttrycket rekombinant protein nivåer, kvarstående mikrobiell laddningen i anläggningen vävnad som betytt för muntliga leverans, motståndet av GAD65 att gastric matsmältningen och bioekvivalens mellan transformerade växterna med vild typ.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2-&#956;m Minisart RC4 membrane filters</td>
			<td>Sartorius-Stedim</td>
			<td>17764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8211;mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td>pH 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27221</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td>Toxic &#8211; 0.1 M stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Bacteriological Grade</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0949</td>
			<td>15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-eGFP antibody</td>
			<td>ABCam</td>
			<td>ab290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAD 65/67 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-LHCB2 antibody</td>
			<td>Agrisera</td>
			<td>AS01 003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 &#956;m) Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Guard Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 &#956;m) Guard&#160; Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CalMag Grower</td>
			<td>Peter Excel</td>
			<td>15-5-15</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>C0109</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708370</td>
			<td>ChemiDoc Touch Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5927</td>
			<td>Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence reader</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>&#160;1420-011</td>
			<td>VICTOR Multilabel Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td>15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1758</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 &#956;m) Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC Guard Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 &#956;m) Guard&#160; Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6154</td>
			<td>Do not freeze/thaw too many times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Autosampler</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>System Gold 508 Autosampler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>System Gold 128 Solvent Module HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>24137</td>
			<td>Flamable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K4000</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td>2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol solution</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td>Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizator</td>
			<td>5Pascal</td>
			<td>LIO5P0000DGT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectometer</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>&#160; -</td>
			<td>Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk-blocking solution</td>
			<td>Ristora</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td>3 % in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282</td>
			<td>&#160;Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulase membrane</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td>10600002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase substrate ECL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2235</td>
			<td>Light sensitive material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Vacuum Press</td>
			<td>VWR</td>
			<td>111400000098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643</td>
			<td>Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643</td>
			<td>Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>R0146</td>
			<td>Toxic &#8211; 25 mg/mL stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium dodecyl sulphate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metabisulphite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7681-57-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator system</td>
			<td>Soltec</td>
			<td>090.003.0003</td>
			<td>Sonica&#174; 2200 MH; frequency 40 khz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>&#160;&#160; -</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent fixed 300-&#181;L insert glass tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11573680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2&#8211;mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>TRP03</td>
			<td>10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Heto</td>
			<td>3878 F1-3</td>
			<td>Speed-vac System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>39253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y1333</td>
			<td>5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient expression in red beet of a biopharmaceutical candidate vaccine for type-1 diabetes

Anläggningen molekylär jordbruk är användningen av växter att producera molekyler av intresse. I detta perspektiv kan växter användas både som bioreaktorer för produktion och efterföljande rening av slutprodukten och för direkta muntliga leverans av heterologa proteiner när du använder ätbara växtarter. I detta arbete presenterar vi utvecklingen av en kandidat oralt vaccin mot typ 1-Diabetes (T1D) i ätbar växt-system som använder dekonstrueras växt virus-baserat rekombinant DNA-teknik, levereras med vakuum infiltration. Våra resultat visar att en Rödbetssallad är en lämplig värd av övergående uttryck för en mänsklig härledda autoantigen associerade till T1D, betraktas som en lovande kandidat som T1D vaccin. Bladen som producerar autoantigen karakteriserades grundligt för deras motstånd mot gastric matsmältningen, förekomsten av kvarvarande bakteriell kostnad och deras sekundära metabola profilen, ger en översikt av processen produktionen för den potentiella användningen av växter för direkta muntliga leverans av ett heterologt protein. Vår analys visade nästan fullständig nedbrytning av den frystorkade kandidat oralt vaccin efter en simulerad gastric matsmältningen, vilket tyder på att det krävs en inkapsling strategi för tillverkning av det vegetabiliska GAD-vaccinet.

I detta arbete presenteras arbetsflödet för utvecklingen av ett oralt vaccin i ätbar växt vävnader. Fokus i detta arbete är ett uttryck för ett målprotein i en ätlig värd växtarter och karakterisering av de potentiella oralt vaccinet.
Det första steget innebar utvärdering av lämpligheten av växten virus-baserade uttryck tekniken att producera rekombinanta proteiner i ätbar växt-system. För detta syfte använder...

Watch this Scientific Journal Video about Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes at JoVE.com

Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes

Övergående uttryck i rödbeta biofarmaceutiska kandidat vaccin för typ 1-Diabetes

Här presenterar vi ett protokoll för att producera en oral vaccinkandidat mot Typ1-diabetes i en växt.

Plant molecular farming is the use of plants to produce molecules of interest. In this perspective, plants may be used both as bioreactors for the ...

Bland de olika strategierna för produktion av rekombinant protein i växter ger det dekonstruerade växtbaserade VERS-uttrycket överlägsen prestanda, vilket leder till hög avkastning över en relativ kort tidsram. Replikation av denna teknik för framställning av ett oralt vaccin har en stor potential att bli ett alternativ till konventionella vacciner inom en snar framtid. Lyophilized rödbeta lämnar transiently omvandlas ackumulerar en mängd foto antigener lämpliga för oral tolerans induktion i typ ett diabetes förebyggande.Detta experimentella protokoll skulle kunna utvidgas till många olika ätbara arter efter en utvärdering från fall till fall av rekombinant protein ackumulering. Demonstrera förfarandet kommer att Edoardo Bertini, Mattia Santoni, Anna Cuccurullo, och Roberta Zampieri. För att påbörja detta förfarande, odla rödbetor och spenat växter i en tillväxtkammare som beskrivs i textprotokollet.Efter frö grobarhet, befrukta växterna två gånger i veckan med en lösning av kommersiellt tillgängliga gödningsmedel vid en koncentration av ett gram per liter. För agroinfiltration, använd fem veckor gammal spenat och sex veckor gamla röda betor växter. Efter konstruera växten uttryck vektorer, inokulera de tre A.tumefaciens transformants i 50 milliliter av LB medium som innehåller rifampicin vid en koncentration av 50 mikrogram per milliliter och vektor-specifika antibiotika som beskrivs i textprotokollet.Odla genom att skaka över natten vid 28 grader Celsius. Nästa dag, pellet bakteriekulturerna genom centrifugering vid 4500 gånger G i 20 minuter. Resuspend pelleten i 100 milliliter infiltrationsbuffert innehållande 10 millimolar MES och 10 millimolar magnesiumsulfat.Inkubera suspensionerna i rumstemperatur i tre timmar. Blanda en lika stor volym av en bakterieupphängning som innehåller en av de moduler som visas här, med fem prime-modulen och integrase-modulen. Ta ut fem milliliter av suspensionsblandningen med en spruta utan nål.Tryck sprutspetsen mot växtbladets undersida samtidigt som du applicerar försiktigt mottryck på andra sidan av bladet. Infiltrera de första tre helt expanderade bladen, med början från apex, för varje planta. Märk de agroinfiltrerade bladen med papperstaggen på lövstammen.Sedan tillbaka växterna till tillväxtkammaren under standardförhållanden. På dag fyra till 14 post-infektion, samla de agroinfiltraterade bladen och frysa dem i flytande kväve. Förvara denna växtvävnad vid minus 80 grader Celsius.Först separat växa de tre A.tumefaciens transformants i 50 milliliter LB medium som innehåller rifampicin vid en koncentration av 50 mikroliter per milliliter, och lämpliga vektorspecifika antibiotika genom att skaka över natten vid 28 grader Celsius. Nästa dag, pellet bakteriekulturerna genom centrifugering vid 4500 gånger G i 20 minuter. Resuspend pelleten i 1 liter infiltration buffert till en OD600 av 0,35, och inkubera suspensionerna i rumstemperatur i tre timmar.Tillsätt sedan 0,01%av diskmedlet till varje suspension. Blanda en lika stor volym av en bakterieupphängning som innehåller en av de moduler som visas här med fem prime-modulen och integrasmodulen. Sätt in en sex veckor gammal rödbeta anläggning i hållaren.Invertera hållaren och placera den ovanpå en bägare som innehåller två liter av ett infiltrationsbad för att dränka bladen i infiltrationsupphängningen. Efter detta överför infiltrationsbadet med den nedsänkta växten till infiltrationskammaren och stänger den. Sätt på vakuumpumpen och öppna vakuumintagsventilen på infiltrationskammaren.När trycket i kammaren har sjunkit till 90 millibar, bibehåll vakuumet i tre minuter. Släpp sedan vakuumet i 45 sekunder. När kammaren har återvänt till atmosfäriskt tryck, öppna kammaren och ta bort den infiltrerade växten från bakteriebadet.Returnera plantan till tillväxtkammaren. På dagen för maximalt uttryck, skörda de infiltrerade bladen och frysa dem i flytande kväve som tidigare beskrivits. Först skörda vakuum agroinfiltrated delta 87 GAD65mut uttrycker röda betor blad vid uttryckstoppen, och frysa dem i flytande kväve.Lyofilisera de frysta bladen vid minus 50 grader Celsius och vid 0,04 millibar i 72 timmar. Sedan lagra dem på minus 80 grader Celsius. När du är klar att fortsätta, slipa bladen till ett fint pulver och förvara i rumstemperatur i en förseglad behållare med kiselgel för att utesluta fukten.För gastric digestion simulering, väga 100 milligram av fint malda frysa torkade röda betor blad, och återanvända den i sex milliliter PBS. Använd sex molar saltsyra för att justera provet pH till två. Tillsätt fyra milligram per milliliters pepsin från svin magslemhinnan, och 10 millimolar saltsyra, för att få en slutlig pepsin koncentration av ett milligram per milliliter.Skaka provet i 37 grader Celsius i 120 minuter. Därefter använder natriumhydroxid för att justera provet pH till åtta och inaktivera pepsin. Överför 750 mikroliter alikvoter av varje prov till mikrocentrifugrör, och centrifug alikvoterna vid 20, 000 gånger G och vid fyra grader Celsius i 20 minuter.Samla varje supernatant separat, och resuspend varje pellet i en supernatant volym av lastning buffert. Analysera sedan både supernatanten och den återanvända pelleten genom Western blot-analys. För cellen integritet analys, förbereda två prover på 100 milligram av fint malda frystorkade röda betor blad, och återanvända båda i sex milliliter PBS.Använd sex molar saltsyra för att justera pH-värdet för ett prov till två. Skaka båda proverna i 37 grader Celsius i 120 minuter. Sedan alikvot 750 mikroliter av varje prov till mikrocentrifugrör.Centrifugera vid 20, 000 gånger G och vid 4 grader Celsius i 20 minuter. Samla varje supernatant separat, och resuspend varje pellet i en supernatant volym av lastning buffert. Analysera sedan både supernatanten och den återanvända pelleten genom Western blot-analys.Först, väga 100 milligram av fint malda frystorkade röda betor blad, och återanvända den i åtta milliliter sterila PBS. Vortex i en minut. Platta en milliliter av varje frystorkat blad homogenat i ett av de fem beredda selektiva LB-medierna.Inkubera plattorna vid 28 grader Celsius i tre dagar. Efter detta, räkna agrobacterium kolonierna odlas på varje platta, och beräkna den kvarvarande bakterieladdningen som antalet kolonibildande enheter per milliliter av frystorkade blad homogenate. I detta arbete utvecklas ett oralt vaccin i ätlig växtvävnad.Rödbeta och spenat växter är manuellt agroinfiltrerade med suspensioner av A.tumefaciens redovisade EGFP rekombinanta uttryck vektorer, och fluorescerande proteinuttryck visualiseras av Western blot analys och kvantifieras under UV-ljus. Den röda betor systemet kännetecknas av en högre EGFP uttryck, når cirka 544 mikrogram per gram färska blad vikt vid nio dagar efter infektion, medan spenaten bara nått en maximal nivå av cirka 113,4 mikrogram per gram färska blad vikt på 11 dagar efter infektion. På grund av detta markeras den röda betan som uttrycksvärd för alla efterföljande experiment.Växter är sedan vakuum infiltreras med en A.tumefaciens suspension. Efter TSP-extraktionen från agroinfiltrationsblad analyseras proverna av Western blot, och det rekombinanta proteinet kvantifieras relativt genom en densitometrianalys. Slutligen utvärderas parametrarna för utveckling av ett potentiellt oralt vaccin.Som ses här, målet proteinet ses vara stabil efter lyofilisering processen. Gastric matsmältning simuleras genom att lägga till svin magsäcksenzym pepsin till frystorkat material, antingen till en slutlig koncentration av ett milligram per milliliter, eller ett förhållande på en till 20, till TSP. Båda magbehandlingstillstånd resulterar i nedbrytning av det rekombinanta proteinet.Avsaknaden av en specifik signal i pelletproverna efter pepsins matsmältning tyder på att efter frystorkning, förlorade växtcellerna sin integritet, och detta ledde till målet proteinnedbrytning. Förfarandet bör anpassas noggrant till växtarten i fråga om vakuuminfiltration och till målet rekombinant protein i fråga om tid kursanalys. Det påvisande förfarandet kan också användas för produktion av biofarmaceutiska avsedda för oral leverans, som vaccin och antikroppar.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Att skapa två-dimensionell Mönstrad substrat för Protein och Cell inneslutning

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Cellular Lipid Extraction för riktade Stabil isotoputspädning Vätskekromatografi-masspektrometri Analys

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Skapa Övergående Porer cellmembran med en vanlig bläckstråleskrivare

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Hud tatueringar som ett nytt sätt för DNA-vaccin Leverans

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Karakterisering av komplexa system Använda Försöks Tillvägagångssätt: Transient Protein Expression i tobak som en fallstudie

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Expression, isolering och rening av lösliga och olösliga Biotinylerade Proteiner för Nerve Tissue Regeneration

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Kontrollerad Mikrofluidumanordning Miljö för Dynamic Undersökning av röda blodkroppar Sammanläggning

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

Tillverkning av en funktionaliserad Magnetic bakteriell Nanocellulosa med järnoxid nanopartiklar

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikroflödes Flow Chambers Använda Beredd blod till modell Hemostas och trombocyttransfusion<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Utveckling av en multicellulär Tredimensionell Organotypiska modell av det mänskliga tarmslemhinnan odlade under mikrogravitation

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...