Name: dissection of the drosophila pupal retina for immunohistochemistry, western analysis, and rna isolation
Uploaded: 2019-03-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation at JoVE.com

우리는 원고에 잭 드럼과 도움이 의견에 대 한 우리의 검토 감사합니다. 이 작품은 R15GM114729에 의해 지원 되었다.

1. 조직 준비
<ol><li>초파리 를 설정 (앞에서 설명한20) 십자가 또는 원하는 유전자 형의 번데기를 특정 초파리 긴장 문화. 되도록 많은 pupae coincidently 등장, 그 영양소 풍부한 음식 미디어 또는 표준 식품 미디어 아낌없이 효 모-붙여넣기 보충에 중복이 비행 문화를 확립.</li>
	<li>25 ° c.에 초파리 문화 유지 십자가 UAS GAL4 시스템을 활용 하 여, GMR GAL4 애벌?...

<ol>
	<li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+order+in+the+Drosophila+pupal+retina.">The emergence of order in the Drosophila pupal retina.</a> Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).</li><li>Wolff, T., Ready, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The development of Drosophila melanogaster. , 1277-1325 (1993).</li><li>Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye.">Pattern formation in the Drosophila eye.</a> Current opinion in genetics &amp; development. 17 (4), 309-313 (2007).</li><li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+an+ommatidium+one+cell+at+a+time.">Building an ommatidium one cell at a time.</a> Developmental Dynamics. 241 (1), 136-149 (2012).</li><li>Hayashi, T., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+mechanics+mediate+pattern+formation+in+the+developing+retina.">Surface mechanics mediate pattern formation in the developing retina.</a> Nature. 431, 647 (2004).</li><li>Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+Adhesion+Mediated+by+Hibris+and+Roughest+Regulates+Morphogenesis+and+Patterning+in+the+Drosophila+Eye.">Preferential Adhesion Mediated by Hibris and Roughest Regulates Morphogenesis and Patterning in the Drosophila Eye.</a> Developmental Cell. 8 (6), 925-935 (2016).</li><li>Cordero, J. B., Larson, D. E., Craig, C. R., Hays, R., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Decapentaplegic+signaling+regulates+patterning+and+adhesion+in+the+Drosophila+pupal+retina.">Dynamic Decapentaplegic signaling regulates patterning and adhesion in the Drosophila pupal retina.</a> Development (Cambridge, England). 134 (10), 1861-1871 (2007).</li><li>Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+behavior+in+the+developing+Drosophila+pupal+retina.">Cellular behavior in the developing Drosophila pupal retina.</a> Mechanisms of development. 125 (3-4), 223-232 (2008).</li><li>Mart&#237;n-Bermudo, M. D., Bardet, P. L., Bella&#239;che, Y., Malartre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vav+oncogene+antagonises+EGFR+signalling+and+regulates+adherens+junction+dynamics+during+Drosophila+eye+development.">The vav oncogene antagonises EGFR signalling and regulates adherens junction dynamics during Drosophila eye development.</a> Development. 142 (8), 1492-1501 (2015).</li><li>Chan, E. H., Chavadimane Shivakumar, P., Cl&#233;ment, R., Laugier, E., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+cortical+tension+mediated+by+N-cadherin+controls+cell+geometric+order+in+the+Drosophila+eye.">Patterned cortical tension mediated by N-cadherin controls cell geometric order in the Drosophila eye.</a> eLife. 6, e22796 (2017).</li><li>Lin, H. V., Rogulja, A., Cadigan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wingless+eliminates+ommatidia+from+the+edge+of+the+developing+eye+through+activation+of+apoptosis.">Wingless eliminates ommatidia from the edge of the developing eye through activation of apoptosis.</a> Development. 131 (10), 2409-2418 (2004).</li><li>Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+wingless+in+an+early+pupal+cell+death+event+that+contributes+to+patterning+the+Drosophila+eye.">A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye.</a> Mechanisms of development. 121 (12), 1523-1530 (2004).</li><li>Mendes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+c&#8208;d+regulates+developmental+apoptosis+in+the+Drosophila+retina.">Cytochrome c&#8208;d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina.</a> EMBO reports. 7 (9), 933-939 (2006).</li><li>Monserrate, J., Brachmann, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+death+zone:+a+spatially+restricted+region+for+programmed+cell+death+that+sculpts+the+fly+eye.">Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 14 (2), 209-217 (2007).</li><li>Bushnell, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JNK+is+antagonized+to+ensure+the+correct+number+of+interommatidial+cells+pattern+the+Drosophila+retina.">JNK is antagonized to ensure the correct number of interommatidial cells pattern the Drosophila retina.</a> Developmental Biology. 433 (1), 94-107 (2018).</li><li>Wolff, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+techniques+for+pupal+and+larval+Drosophila+eyes.">Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li><li>Hsiao, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+Immunohistochemistry+of+Larval,+Pupal+and+Adult+Drosophila+Retinas.">Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4347 (2012).</li><li>Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+Mounting+of+Drosophila+Pupal+Eye+Discs.">Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (93), e52315 (2014).</li><li>Johnson, R. I., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quantitative+Method+to+Analyze+Drosophila+Pupal+Eye+Patterning.">A Quantitative Method to Analyze Drosophila Pupal Eye Patterning.</a> PLoS ONE. 4 (9), e7008 (2009).</li><li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Ellis, M. C., O'Neill, E. M., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Drosophila+glass+protein+and+evidence+for+negative+regulation+of+its+activity+in+non-neuronal+cells+by+another+DNA-binding+protein.">Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein.</a> Development. 119 (3), 855-865 (1993).</li><li>Duffy, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+drosophila:+A+fly+geneticist's+swiss+army+knife.">GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife.</a> genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li><li>Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+broad+expression+profile+of+the+GMR-GAL4+driver+in+Drosophila+melanogaster.">A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster.</a> Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).</li><li>Song, Z., McCall, K., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCP-1,+a+Drosophila+Cell+Death+Protease+Essential+for+Development.">DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development.</a> Science. 275 (5299), 536-540 (1997).</li><li>Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+homologs+of+baculovirus+inhibitor+of+apoptosis+proteins+function+to+block+cell+death.">Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death.</a> Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).</li></ol>

여기에 설명 된 초파리 번데기 눈 해 부 방법 10 ~ 15 분 이내 6-10 눈 두뇌 단지의 격리에 대 한 수 있습니다. 그러나, 인 내와 연습 절 개 기술을 지배 품질 및 해의 속도 향상 시키기 위해 필수적입니다. 이 짧은 해 부 시간 각 눈 약 동일한 개발 단계, 표현 형 또는 유전자 표현의 데이터 집합에서 망막에 있는 가변성을 감소를 통해. 우리의 프로토콜은 조직적으로 찢 어 또는 깎기, 눈에 손상을...

초파리 망막 색소 세포 벌집 격자1,2,,34배열에 의해 포위 하는 약 750 ommatidia 구성 됩니다. 각 ommatidium 8 포토 리셉터 신경, 4 렌즈 은닉 원추 세포, 그리고 두 가지 기본 안료 세포에 포함 되어 있습니다. 각 ommatidium를 주변 안료 생산 격자 세포와 감각 강 모 그룹 있습니다. 포스트 mitotic 자연 및 틀에 박힌 6 각형 배열, 초파리 번데기 망막 세포 접착5,6,를 포함 하 여 전체적 프로세스의 연구에 대 한 우수한 모델 시스템을 제공 7,8,9,10 및 apoptosis11,12,13,,1415.
여러 게시 프로토콜 초파리 번데기16,,1718에서 눈 뇌 단지 추출 공기 압력을 이용 한다. 프로토콜 설명 여기 대신 활용 하 서 도구를 신중 하 고 정확 하 게 격리 눈-뇌 손상된 망막 조직을 얻기의 목적으로 단지. 이것은 망막에 대 한 활용 하는 경우 중요 한 형태학, 단백질, 또는 유전자 발현 분석 때문에 망막 손상 세포 스트레스 또는 죽음, 세포 표현 형 또는 진 식을 수정할 수 발생할 수 있습니다. 또한, 연습 후, 6 ~ 10 눈 두뇌 단지 10 ~ 15 분, 나이 및 해 부 눈 조직의 발달 단계에서 가변성을 최소화의 목표를 용이 하 게 고립 될 수 있다.
고정, immunostaining, 및 아래에 설명 된 전체 마운트 프로토콜은 형광 현미경 검사 법에 대 한 초파리 눈의 준비에 적합 하다. 망막은 관심사의 단백질을 대상으로 하는 항 체와 알을 품을 수 있다. 예를 들어 외화 접합 부품에 항 체 특성 셀을 포함 하 여, 모양 및 배치 평가19될 수 있도록 셀의 꼭대기 크기를 시각화 하기 위해 활용할 수 있습니다. 고정, 이전 서쪽 분석, 단백질 또는 RNA qRT-PCR에 사용 하기 위해 또는 RNA 시퀀싱을 추출 하기 위해 뇌에서 눈 죽 습 수 대신 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Adobe Photoshop</td>
			<td style="width:131px;">Adobe</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Image processing software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Bamboo splints, 6&#34;&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Ted Pella Inc</td>
			<td style="width:95px;">116</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Beta mercaptoethanol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">M3148</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Beta-glycerol phosphate</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">50020</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="90">
			<td height="90" style="height:91px;width:145px;">Black dissecting dish</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Blade holder</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">10053</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">A7906</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:131px;">Roche</td>
			<td style="width:95px;">4693132001</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Confocal microscope (Zeiss LSM 501)</td>
			<td style="width:131px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Diethyl Pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">40718</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Double-sided tape</td>
			<td style="width:131px;">3M</td>
			<td style="width:95px;">665</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:145px;">Drosophila food media, nutrient-rich&#160;</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">Drosophila food media, standard</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe.&#160; (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">E6758</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Fixative solution</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">4% formadehyde in PBS, pH 7.4.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope)</td>
			<td style="width:131px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">91150-20</td>
			<td style="width:285px;">Forceps should be sharpened frequently.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:131px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:95px;">28908</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Glass 9-well dishes&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:95px;">7220-85</td>
			<td style="width:285px;">Also known as 9-well dishes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Glass coverslips (22 x 22 mm)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:95px;">12-542-B</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:95px;">12-550-413</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Glass petri dish</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:95px;">3160-100BO</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Glycerol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">G5516</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Image Studio software version 5.2.5</td>
			<td style="width:131px;">LI-COR Biosciences</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Image processing software for quantitation of Western blots.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Laemmli sample buffer</td>
			<td style="width:131px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:95px;">161-0737</td>
			<td style="width:285px;">2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Lane marker reducing sample buffer&#160;</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:95px;">39000</td>
			<td style="width:285px;">5X concentrated protein sample buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Microcentrigure tubes&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Axygen</td>
			<td style="width:95px;">MCT-175-C</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Microdissection scissors&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">15000-03</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Microwell trays (72 x 10 &#181;L wells)</td>
			<td style="width:131px;">Nunc</td>
			<td style="width:95px;">438733</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Mounting media</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">N-propylgallate</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">P3130</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:145px;">Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">P5368</td>
			<td style="width:285px;">Prepare according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">PBT</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Pin holder</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">26016-12</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Primary antibody: goat anti-GAPDH</td>
			<td style="width:131px;">Imgenex</td>
			<td style="width:95px;">IMG-3073</td>
			<td style="width:285px;">For Western blotting. Used at 1:3000</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1</td>
			<td style="width:131px;">Cell signaling</td>
			<td style="width:95px;">9578S</td>
			<td style="width:285px;">For immunofluorescence. Used at 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Primary antibody: rat anti-DEcad</td>
			<td style="width:131px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:95px;">DCAD2</td>
			<td style="width:285px;">For immunofluorescence. Used at 1:20</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Primary antibody: rat anti-DEcad</td>
			<td style="width:131px;">DOI: 10.1006/dbio.1994.1287</td>
			<td style="width:95px;">DCAD1</td>
			<td style="width:285px;">&#160;Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Promega</td>
			<td style="width:95px;">Z6110</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">Rnase decontamination reagent (RNase Away)</td>
			<td style="width:131px;">Molecular BioProducts</td>
			<td style="width:95px;">7002</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">10050</td>
			<td style="width:285px;">Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">Secondary antibody: 488-conjugated&#160; donkey anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:131px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:95px;">712-545-153</td>
			<td style="width:285px;">For immunofluorescence. Used at 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:131px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:95px;">111-165-144</td>
			<td style="width:285px;">For immunofluorescence. Used at 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:131px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:95px;">7077</td>
			<td style="width:285px;">For Western blotting. Used at 1:3000</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:131px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:95px;">305-035-003</td>
			<td style="width:285px;">For Western blotting. Used at 1:3000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">S3014</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Sodium Fluoride</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">215309</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Sodium vanadate</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">50860</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Spectrophotometer (NanoDrop)</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:95px;">2000c&#160;</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Stereo dissecting microscope (M60 or M80)</td>
			<td style="width:131px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Sylgard (black)</td>
			<td style="width:131px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:95px;">SYLG170</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Sylgard (transparent)</td>
			<td style="width:131px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:95px;">SYLG184</td>
			<td style="width:285px;">Color black with finely ground charcol powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Tissue: Kimwipes</td>
			<td style="width:131px;">KIMTECH</td>
			<td style="width:95px;">34120</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">TritonX</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">T8787</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Trizma hydrochloride pH7.5</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">T5941</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Tungsten needle, fine</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">10130-10</td>
			<td style="width:285px;">Insert into pin holder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Tungsten needle, sturdy</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">10130-20</td>
			<td style="width:285px;">Insert into pin holder</td>
		</tr>
		<tr height="130">
			<td height="130" style="height:130px;width:145px;">WTLB (western tissue lysis buffer)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution.</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:145px;">Yeast paste</td>
			<td style="width:131px;">(local supermarket)</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Approximately 2 tablespoons Fleischmann&#39;s ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of the drosophila pupal retina for immunohistochemistry, western analysis, and rna isolation

초파리 번데기 망막 개발 하는 동안 전체적 프로세스의 연구에 대 한 우수한 모델 시스템을 제공합니다. 이 종이에 선물이 섬세 한 초파리 번데기 망막의 해 부에 대 한 신뢰할 수 있는 프로토콜. 외과 접근 pupae를 열고 정확 하 게 추출 눈 두뇌 단지를 쉽게 사용할 수 서 도구를 활용 합니다. 이러한 수 고정, 들어서는 immunohistochemistry, 망막에 다음 현미경 슬라이드에 장착 되며 목표 세포 또는 subcellular 구조를 감지 하는 경우를 몇 군데. 또는, 떼어낸된 망막 뇌 조직에서 분리, 적절 한 버퍼에 lysed 고 단백질 젤 전기 이동 법 또는 mRNA 추출 (각각 단백질 또는 유전자 식 평가)에 대 한 활용. 상당한 연습과 인내심, 기정 프로토콜을 마스터 해야 할 수 있습니다 하지만 일단 마스터, 프로토콜 수 주로 손상된 망막의 상대적으로 빠른 절연 있습니다.

번데기 눈은 그 드라이브 morphogenesis 발달 과정을 조사 하는 우수한 모델 역할을 쉽게 액세스할 수 있는 조직 이다. 여기, 우리 망막 해 부는 면역 형광 꼭대기 외화 접합 (그림 3A, C) 또는 apoptosis (그림 3)25동안 활성화 되는 Dcp-1 caspase (그림 3D)를 감지 하는데. 이러한 방식을 명확 하 게 모집 등 (18 h APF)?...

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Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

이 문서는 초파리 번데기 망막 조직의 immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 추출에 대 한 처리에 대 한 프로토콜 함께 해 부에 대 한 수술 메서드를 제공 합니다.

Immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 격리에 대 한 초파리 번데기 망막의 해 부

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

이 프로토콜은 여러 다운스트림 응용 프로그램에 대한 Drosophila pupal 눈 조직의 격리를위한 효율적인 방법이기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 조직을 손상시키지 않고 많은 수의 pupal 눈의 빠른 해부를 허용한다는 것입니다. 드로소필라 푸팔 망막의 해부는 초보자에게 도전이 될 것입니다.이 기술을 연습하는 것이 해분의 속도와 결과의 품질을 향상시키는 가장 좋은 방법입니다. 드로소필라 푸파를 검은 해부 접시에 넣은 후, 양면 테이프를 해부 접시에 놓고, 강아지에서 멀리 떨어진 곳에 양면 테이프를 놓고, 강아지 등쪽을 테이프위에 조심스럽게 올려놓습니다. 접시를 스테레오 현미경 아래에 놓고 집게를 사용하여 각 강아지의 오퍼쿨룸을 제거합니다.미세 절 부 가위를 사용하여 각 pupal 케이스를 슬라이스하여 머리, 흉부 및 전방 복부 세그먼트를 드러내고 푸팔 케이스의 가장자리를 양면 테이프로 고정할 수 있도록 합니다. 날카로운 집게로 각 강아지의 복부를 관통하고, 푸팔 케이스에서 강아지를 제거합니다. 강아지를 해부 접시에 놓고 테이프에서 멀리 떨어진 곳에 놓고 400 마이크로리터의 얼음 차가운 PBS로 강아지를 덮습니다.집게를 사용하여 복부에 의해 각 것을 파악하고 미세 절 가위를 사용하여 흉부를 통해 하나의 깨끗한 단면 절개를 만들어 새끼를 반으로 자른다. 두 쌍의 미세 한 개의 미세 한 집게를 사용 하 여 각 흉부 상피의 절단 된 가장자리를 잡고 점차적으로 흉부와 머리 캡슐을 열고 눈물, 눈 - 뇌 복합체와 주변 지방 조직을 노출. 그런 다음 조직을 파악하지 않고 집게를 사용하여 각 반투명, 오프 화이트, 아령 모양의 눈 - 뇌 복합체를 머리 캡슐의 잔해에서 멀리 안내하십시오.6~10개의 강아지를 해부한 후 깨끗한 면도날로 마이크로피펫 팁을 직경 약 1mm로 자르고 PBS와 지방이 혼합된 팁을 윤활합니다. 윤활피 팁을 사용하여 눈-뇌 복합체를 얼음에 400 마이크로리터가 들어있는 9웰 유리 접시의 한 우물로 옮은 다음, 20마이크로리터의 PBS 마이크로리터로 조직을 얼음에 35분 간 배양하기 위해 최소 250마이크로리터로 옮길 수 있습니다. 고정의 끝에서, 얼음에 5 ~ 10 분 동안 신선한 PBS의 400 마이크로 리터를 포함하는 세 번째 우물로 조직을 전송하는 동일한 파이펫 팁을 사용합니다.비특이적 항체 결합을 차단하기 위해 눈-뇌 복합체를 PBS 400 마이크로리터와 트리톤 X로 옮겨 얼음에 10-60분 간 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 일차 항체 용액의 10 마이크로리터를 72웰 마이크로웰 플레이트의 필요한 수의 우물로 인용하고, PBS 플러스 트리톤 X로 윤활된 0.5밀리미터 팁이 있는 P10 공기 변위 마이크로파이프를 사용하여 5개 이상의 눈-뇌 복합체를 전송하지 않고 각 PBS의 미세한 약체에 더 이상 미세하게 전달하지 않습니다. 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 잠복한 후, PBS 400 마이크로리터와 트리톤 X를 9웰 유리 접시에 넣고 세척당 5~10분 동안 샘플을 두 번 씻습니다.세 번째 세척 후, PBS 플러스 트리톤 X의 400 마이크로 리터에 3 5 ~ 10 분 세척에 따라, 실온에서 2 시간 동안 적절한 이차 항체 용액의 100 마이크로 리터로 조직을 전송하고 PBS에서 1 개의 세척을 합니다. 그런 다음, 1~2시간 동안 마운팅 배지의 200마이크로리터에서 샘플을 상형화한다. 인큐베이션의 끝에서, 현미경 슬라이드에 샘플을 전송하고, 해부 현미경아래 슬라이드에 눈 뇌 복합체를 고정하는 튼튼한 텅스텐 바늘을 사용합니다.그런 다음, 미세 텅스텐 바늘을 사용하여 각 눈을 관련 광학 엽에서 멀리 슬라이스하고 눈의 기저 표면이 슬라이드에 인접하도록 현미경 슬라이드의 표면으로 각 눈을 기동합니다. 그런 다음 샘플 위에 깨끗한 커버 슬립을 적용하고 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉하십시오. 서양 얼룩 분석을 위한 pupal 눈 조직을 준비하기 위하여는, 먼저 이전에 2개의 배치에서 입증된 것과 같이 10 에서 16 pupae를 해부하기 위하여, 프로테아제와 인산염 억제기로 보충된 PBS에서 10- 15 분 떨어져.PBS 플러스 억제제 400 마이크로리터에 얼음에 9웰 유리 접시의 개별 우물에서 두 번 고립 된 눈 뇌 복합체를 잠시 헹구고, 모든 눈 - 뇌 복합체를 얼음 차가운 PBS 플러스 억제제 400 마이크로 리터로 옮기고 깨끗한 검은 해부 접시에 디캔션합니다. 깨끗한 해부 현미경하에서 튼튼한 텅스텐 바늘과 미세면도날 날을 사용하여 눈의 눈을 광학 엽에서 깨끗하게 자르고 윤활 팁을 사용하여 눈-뇌 복합체를 PBS의 5 마이크로리터와 얼음에 있는 500마이크로리터 마이크로센트심리후지 튜브로 옮겨 넣습니다. 그런 다음, 서쪽 조직 리시스 완충제의 5마이크로리터와 2X 농축 단백질 샘플 버퍼의 10 마이크로리터를 튜브에 첨가한다.RNA 추출을 위한 눈-뇌 복합체를 처리하려면 장갑을 착용하고 벤치탑, 현미경, 해부 도구 및 70%에탄올 및 RNase 제염 시약으로 검은 해부 요리를 청소하십시오. 이 지역이 건조할 수 있게 한 후, 총 30~40개의 푸파를 6~8개 로 해부한다. 눈-뇌 복합체의 각 배치가 해부 된 후, 깨끗한 해부 접시에 신선한, 얼음 차가운, 뉴클레아스가없는 PBS의 400 마이크로 리터로 눈 - 뇌 복합체를 전송하고, 튼튼한 텅스텐 바늘과 미세 면도날을 사용하여 깨끗한 눈의 각 눈을 깨끗하게 잘라.배치에 대한 모든 눈이 제거되면, 멸균, RNase가없는 미세 원심 분리기 튜브로 전송하고 다음 배치로 진행하기 전에 액체 질소로 샘플을 플래시 동결. pupal 눈은 형태 발생을 구동 하는 그들을 포함 하 여 개발 과정을 조사 하기 위한 훌륭한 모델 역할을 하는 쉽게 액세스할 수 있는 조직. 푸파리움 형성 후 약 40시간 후, 세포의 최종 배치가 달성된다.이것은 유전 돌연변이 또는 수정된 유전자 발현의 결과를 평가하는 이상적인 나이입니다. 예를 들어, 세포멸의 핵심 억제제인 Diap1의 자궁 외 발현에 이어, 격자 세포의 수의 증가는 대조군 망막에서 관찰되는 것과 비교될 수 있다. 세포멸증은 또한 항체를 활용하여 사망 카스파제-1을 활성화하거나 죽어가는 세포를 검출하기 위한 다른 접근법을 사용하여 보다 직접적으로 평가될 수 있다.눈 용액의 서양 얼룩 분석은 관심있는 단백질의 존재 또는 상대적 발현을 결정하거나 다른 발달 시점에서 단백질 발현을 비교하는 데 사용될 수 있습니다. 유전자형 또는 실험 조건당 60개 이상의 눈을 해부하는 것이 충분한 고품질 RNA를 분리하는 데 최적입니다. 기억해야 할 가장 중요한 것은 푸팔 망막이 매우 깨지기 쉽고, 무결성을 보장하기 위해 해부 중에 세심한 주의를 기울여야 한다는 것입니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

전사 분석을위한 대규모 Zebrafish의 배아 심장의 해부

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

연구

발생학

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 번데기 눈

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

뇌실 주위 백질 성인 쥐의 지역 및 인간의 척수에서 신경 줄기 / 전구 세포의 분리

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

번데기 날개 초파리 Immunodetections 또는 PCR 분석 실험에 적합의 해 부를 신속 하 고 효율적인 방법

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Zebrafish 망막에 단백질 지 방화를 해결 하기 위해 상호 슈퍼 해상도 전자 현미경 검사 법

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

해 부와 초파리 번데기 난소의 얼룩

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

녹고, 경작, 그리고 초파리 셀 라인 Cryopreserving

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

푸팔 단계 동안 개발 초파리 에피텔리아에서 조직 방향 과 성장 역학의 이미징 및 분석

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

살아있는, 그대로 조직에서 세포 분열의 분석을 위한 초파리 애벌레와 Pupal 고환의 준비

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...