Name: dissection of the drosophila pupal retina for immunohistochemistry, western analysis, and rna isolation
Uploaded: 2019-03-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation at JoVE.com

Vi takker Zack trommelen og våre korrekturlesere nyttig på manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av R15GM114729.

1. vev forberedelse
<ol><li>Definer Drosophila krysser (som beskrevet tidligere20) eller kultur spesifikke Drosophila stammer for å få pupae av ønsket genotype. Å sikre at et stort antall pupae dukke sammentreffet, etablere disse fly kulturer i duplikat på næringsrik mat media eller standard mat medier sjenerøst supplert med gjær-lim.</li>
	<li>Opprettholde Drosophila kulturer på 25 ° C. Kors utnytte UAS-GAL4 systemet, er GMR-GAL4 en ideell driver ut...

<ol>
	<li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+order+in+the+Drosophila+pupal+retina.">The emergence of order in the Drosophila pupal retina.</a> Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).</li><li>Wolff, T., Ready, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The development of Drosophila melanogaster. , 1277-1325 (1993).</li><li>Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye.">Pattern formation in the Drosophila eye.</a> Current opinion in genetics &amp; development. 17 (4), 309-313 (2007).</li><li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+an+ommatidium+one+cell+at+a+time.">Building an ommatidium one cell at a time.</a> Developmental Dynamics. 241 (1), 136-149 (2012).</li><li>Hayashi, T., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+mechanics+mediate+pattern+formation+in+the+developing+retina.">Surface mechanics mediate pattern formation in the developing retina.</a> Nature. 431, 647 (2004).</li><li>Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+Adhesion+Mediated+by+Hibris+and+Roughest+Regulates+Morphogenesis+and+Patterning+in+the+Drosophila+Eye.">Preferential Adhesion Mediated by Hibris and Roughest Regulates Morphogenesis and Patterning in the Drosophila Eye.</a> Developmental Cell. 8 (6), 925-935 (2016).</li><li>Cordero, J. B., Larson, D. E., Craig, C. R., Hays, R., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Decapentaplegic+signaling+regulates+patterning+and+adhesion+in+the+Drosophila+pupal+retina.">Dynamic Decapentaplegic signaling regulates patterning and adhesion in the Drosophila pupal retina.</a> Development (Cambridge, England). 134 (10), 1861-1871 (2007).</li><li>Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+behavior+in+the+developing+Drosophila+pupal+retina.">Cellular behavior in the developing Drosophila pupal retina.</a> Mechanisms of development. 125 (3-4), 223-232 (2008).</li><li>Mart&#237;n-Bermudo, M. D., Bardet, P. L., Bella&#239;che, Y., Malartre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vav+oncogene+antagonises+EGFR+signalling+and+regulates+adherens+junction+dynamics+during+Drosophila+eye+development.">The vav oncogene antagonises EGFR signalling and regulates adherens junction dynamics during Drosophila eye development.</a> Development. 142 (8), 1492-1501 (2015).</li><li>Chan, E. H., Chavadimane Shivakumar, P., Cl&#233;ment, R., Laugier, E., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+cortical+tension+mediated+by+N-cadherin+controls+cell+geometric+order+in+the+Drosophila+eye.">Patterned cortical tension mediated by N-cadherin controls cell geometric order in the Drosophila eye.</a> eLife. 6, e22796 (2017).</li><li>Lin, H. V., Rogulja, A., Cadigan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wingless+eliminates+ommatidia+from+the+edge+of+the+developing+eye+through+activation+of+apoptosis.">Wingless eliminates ommatidia from the edge of the developing eye through activation of apoptosis.</a> Development. 131 (10), 2409-2418 (2004).</li><li>Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+wingless+in+an+early+pupal+cell+death+event+that+contributes+to+patterning+the+Drosophila+eye.">A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye.</a> Mechanisms of development. 121 (12), 1523-1530 (2004).</li><li>Mendes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+c&#8208;d+regulates+developmental+apoptosis+in+the+Drosophila+retina.">Cytochrome c&#8208;d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina.</a> EMBO reports. 7 (9), 933-939 (2006).</li><li>Monserrate, J., Brachmann, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+death+zone:+a+spatially+restricted+region+for+programmed+cell+death+that+sculpts+the+fly+eye.">Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 14 (2), 209-217 (2007).</li><li>Bushnell, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JNK+is+antagonized+to+ensure+the+correct+number+of+interommatidial+cells+pattern+the+Drosophila+retina.">JNK is antagonized to ensure the correct number of interommatidial cells pattern the Drosophila retina.</a> Developmental Biology. 433 (1), 94-107 (2018).</li><li>Wolff, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+techniques+for+pupal+and+larval+Drosophila+eyes.">Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li><li>Hsiao, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+Immunohistochemistry+of+Larval,+Pupal+and+Adult+Drosophila+Retinas.">Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4347 (2012).</li><li>Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+Mounting+of+Drosophila+Pupal+Eye+Discs.">Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (93), e52315 (2014).</li><li>Johnson, R. I., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quantitative+Method+to+Analyze+Drosophila+Pupal+Eye+Patterning.">A Quantitative Method to Analyze Drosophila Pupal Eye Patterning.</a> PLoS ONE. 4 (9), e7008 (2009).</li><li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Ellis, M. C., O'Neill, E. M., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Drosophila+glass+protein+and+evidence+for+negative+regulation+of+its+activity+in+non-neuronal+cells+by+another+DNA-binding+protein.">Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein.</a> Development. 119 (3), 855-865 (1993).</li><li>Duffy, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+drosophila:+A+fly+geneticist's+swiss+army+knife.">GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife.</a> genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li><li>Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+broad+expression+profile+of+the+GMR-GAL4+driver+in+Drosophila+melanogaster.">A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster.</a> Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).</li><li>Song, Z., McCall, K., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCP-1,+a+Drosophila+Cell+Death+Protease+Essential+for+Development.">DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development.</a> Science. 275 (5299), 536-540 (1997).</li><li>Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+homologs+of+baculovirus+inhibitor+of+apoptosis+proteins+function+to+block+cell+death.">Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death.</a> Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).</li></ol>

Den Drosophila pupal øye disseksjon beskrevet her tillater for isolering av 6-10 øye-hjerne komplekser innen 10 til 15 min. Men er tålmodighet og praksis avgjørende for å mestre teknikken disseksjon og forbedre kvaliteten og hastigheten på disseksjoner. Denne korte disseksjon tiden sikrer at hvert øye er omtrent den samme utviklingsstadiet, reduserer variasjon i fenotype eller genet uttrykk for Netthinne i et datasett. Mens alternativ protokoller kan kreve mindre øvelse å mestre, er våre protokollen ut...

Drosophila netthinnen består av ca 750 ommatidia omgitt av pigment cellene ordnet i honeycomb gitter1,2,3,4. Hver ommatidium inneholder åtte photoreceptor nerveceller, fire linse-sekresjon koniske celler og to primære pigment cellene. Hver ommatidium er pigment-produserende gitter celler og sensoriske bust grupper. På grunn av sin post mitotisk natur og stereotype Sekskantet arrangement gir Drosophila pupal netthinnen en utmerket modellsystem for studier av Morfogenetiske prosesser inkludert celle vedheft5,6, 7,8,9,10 og apoptose11,12,13,14,15.
Flere publiserte protokoller benytte lufttrykket å trekke øyet-hjerne komplekser Drosophila pupae16,17,18. Protokollen beskrevet i stedet benytter her microdissection verktøy å forsiktig og isolere nøyaktig øye-hjerne komplekser med mål om å få uskadet retinal vev. Dette er avgjørende hvis Netthinne skal utnyttes for morfologiske, protein eller genuttrykk analyserer siden skade Netthinne kan resultere i mobilnettet stress eller død, som kan endre mobilnettet fenotype eller genet uttrykket. I tillegg etter trening, kan 6 til 10 øye-hjerne komplekser bli isolert i 10 til 15 min, tilrettelegge mål å minimere variasjon i alder og utviklingen scene av dissekert øye vev.
Den fiksering, immunostai- og hele-mount protokollen beskrevet nedenfor er egnet for utarbeidelse av Drosophila øyne for fluorescerende mikroskopi. Netthinne kan være inkubert med antistoffer målretting proteiner av interesse. Antistoffer mot adherens junction komponenter kan for eksempel brukes til å visualisere de apikale omkretsene av cellene slik at egenskaper, inkludert celle type, form og arrangement blir vurdert19. Før fiksering, kan øynene i stedet bli kløyvde fra hjernen for å trekke ut protein for vestlige analyse eller RNA for bruk i qRT PCR eller RNA-sekvensering.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Adobe Photoshop</td>
			<td style="width:131px;">Adobe</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Image processing software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Bamboo splints, 6&#34;&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Ted Pella Inc</td>
			<td style="width:95px;">116</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Beta mercaptoethanol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">M3148</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Beta-glycerol phosphate</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">50020</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="90">
			<td height="90" style="height:91px;width:145px;">Black dissecting dish</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Blade holder</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">10053</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">A7906</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:131px;">Roche</td>
			<td style="width:95px;">4693132001</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Confocal microscope (Zeiss LSM 501)</td>
			<td style="width:131px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Diethyl Pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">40718</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Double-sided tape</td>
			<td style="width:131px;">3M</td>
			<td style="width:95px;">665</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:145px;">Drosophila food media, nutrient-rich&#160;</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">Drosophila food media, standard</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe.&#160; (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">E6758</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Fixative solution</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">4% formadehyde in PBS, pH 7.4.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope)</td>
			<td style="width:131px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">91150-20</td>
			<td style="width:285px;">Forceps should be sharpened frequently.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:131px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:95px;">28908</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Glass 9-well dishes&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:95px;">7220-85</td>
			<td style="width:285px;">Also known as 9-well dishes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Glass coverslips (22 x 22 mm)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:95px;">12-542-B</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:95px;">12-550-413</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Glass petri dish</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:95px;">3160-100BO</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Glycerol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">G5516</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Image Studio software version 5.2.5</td>
			<td style="width:131px;">LI-COR Biosciences</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Image processing software for quantitation of Western blots.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Laemmli sample buffer</td>
			<td style="width:131px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:95px;">161-0737</td>
			<td style="width:285px;">2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Lane marker reducing sample buffer&#160;</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:95px;">39000</td>
			<td style="width:285px;">5X concentrated protein sample buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Microcentrigure tubes&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Axygen</td>
			<td style="width:95px;">MCT-175-C</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Microdissection scissors&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">15000-03</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Microwell trays (72 x 10 &#181;L wells)</td>
			<td style="width:131px;">Nunc</td>
			<td style="width:95px;">438733</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Mounting media</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">N-propylgallate</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">P3130</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:145px;">Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">P5368</td>
			<td style="width:285px;">Prepare according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">PBT</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Pin holder</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">26016-12</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Primary antibody: goat anti-GAPDH</td>
			<td style="width:131px;">Imgenex</td>
			<td style="width:95px;">IMG-3073</td>
			<td style="width:285px;">For Western blotting. Used at 1:3000</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1</td>
			<td style="width:131px;">Cell signaling</td>
			<td style="width:95px;">9578S</td>
			<td style="width:285px;">For immunofluorescence. Used at 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Primary antibody: rat anti-DEcad</td>
			<td style="width:131px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:95px;">DCAD2</td>
			<td style="width:285px;">For immunofluorescence. Used at 1:20</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Primary antibody: rat anti-DEcad</td>
			<td style="width:131px;">DOI: 10.1006/dbio.1994.1287</td>
			<td style="width:95px;">DCAD1</td>
			<td style="width:285px;">&#160;Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Promega</td>
			<td style="width:95px;">Z6110</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">Rnase decontamination reagent (RNase Away)</td>
			<td style="width:131px;">Molecular BioProducts</td>
			<td style="width:95px;">7002</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">10050</td>
			<td style="width:285px;">Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">Secondary antibody: 488-conjugated&#160; donkey anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:131px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:95px;">712-545-153</td>
			<td style="width:285px;">For immunofluorescence. Used at 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:131px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:95px;">111-165-144</td>
			<td style="width:285px;">For immunofluorescence. Used at 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:131px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:95px;">7077</td>
			<td style="width:285px;">For Western blotting. Used at 1:3000</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:131px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:95px;">305-035-003</td>
			<td style="width:285px;">For Western blotting. Used at 1:3000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">S3014</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Sodium Fluoride</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">215309</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Sodium vanadate</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">50860</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Spectrophotometer (NanoDrop)</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:95px;">2000c&#160;</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Stereo dissecting microscope (M60 or M80)</td>
			<td style="width:131px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Sylgard (black)</td>
			<td style="width:131px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:95px;">SYLG170</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Sylgard (transparent)</td>
			<td style="width:131px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:95px;">SYLG184</td>
			<td style="width:285px;">Color black with finely ground charcol powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Tissue: Kimwipes</td>
			<td style="width:131px;">KIMTECH</td>
			<td style="width:95px;">34120</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">TritonX</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">T8787</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Trizma hydrochloride pH7.5</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">T5941</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Tungsten needle, fine</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">10130-10</td>
			<td style="width:285px;">Insert into pin holder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Tungsten needle, sturdy</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">10130-20</td>
			<td style="width:285px;">Insert into pin holder</td>
		</tr>
		<tr height="130">
			<td height="130" style="height:130px;width:145px;">WTLB (western tissue lysis buffer)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution.</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:145px;">Yeast paste</td>
			<td style="width:131px;">(local supermarket)</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Approximately 2 tablespoons Fleischmann&#39;s ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of the drosophila pupal retina for immunohistochemistry, western analysis, and rna isolation

Drosophila pupal netthinnen gir en utmerket modellsystem for studiet av Morfogenetiske prosesser under utvikling. I dette papiret presenterer vi en protokoll som er pålitelig for Disseksjon av delikate Drosophila pupal netthinnen. Våre kirurgisk tilnærming benytter lett-tilgjengelig microdissection verktøy å åpen pupae og nøyaktig ekstra øye-hjerne komplekser. Disse kan fast, utsatt for immunohistochemistry og Netthinne så montert på objektglass og fotografert hvis målet er å oppdage mobilnettet eller subcellular strukturer. Alternativt kan unfixed Netthinne isolert fra hjernevev, lysed i riktige buffere og benyttes for protein gel geleelektroforese eller mRNA utvinning (å vurdere protein eller genet uttrykk, henholdsvis). Betydelig praksis og tålmodighet kan være nødvendig å mestre microdissection protokollen beskrevet, men når mestret, protokollen gjør at relativt rask isolering av hovedsakelig uskadet netthinne.

Pupal øyet er en drøy vev som fungerer som en utmerket modell å undersøke utviklingsprosesser som stasjonen morphogenesis. Her har vi dissekert Netthinne og brukte immunofluorescence til å oppdage de apikale adherens veikryssene (figur 3A, C) eller Dcp-1 caspase (figur 3D) som aktiveres under apoptose (Figur 3)25. Disse metodene tillater en tydelig observere celler under viktige Morfogen...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation at JoVE.com

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dette dokumentet presenterer en kirurgisk metode for dissekere Drosophila pupal Netthinne sammen med protokoller for behandling av vev for immunohistochemistry, western analyse og RNA-utvinning.

Disseksjon av Drosophila Pupal netthinnen for Immunohistochemistry, Western analyse og RNA isolasjon

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Denne protokollen er viktig fordi dette er en effektiv metode for isolering av Drosophila pupal øyevev for flere nedstrøms applikasjoner. Den største fordelen med denne teknikken er at den tillater rask disseksjon av et stort antall pupale øyne uten å skade vevet. Disseksjon av Drosophila pupal retina vil være utfordrende for nybegynnere.Å praktisere teknikken er den beste måten å forbedre hastigheten på disseksjonene og kvaliteten på resultatene. Etter å ha plassert Drosophila-puppen på en svart disseksjonsrett, legg et nytt stykke dobbeltsidig tape på disseksjonsfatet, vekk fra puppen, og bruk et par tang til å forsiktig plassere pupae dorsalsiden opp på båndet. Plasser parabolen under et stereomikroskop, og bruk tang for å fjerne operkulum av hver pupa.Bruk mikrodisseksjonsaks til å skjære hver pupal sak, slik at den kan klaffes åpen for å avsløre hodet, thorax og fremre abdominalsegment, og sikre kantene på pupal saken til dobbeltsidig tape. Pierce magen til hver pupa med skarpe tang, og fjern puppen fra pupal tilfelle. Legg puppen på disseksjonsfatet, vekk fra båndet, og dekk puppen med 400 mikroliter iskald PBS.Bruk tang til å gripe hver og en av magen, og bruk mikrodisseksjonsaksen til å lage et rent tverrsnittssnitt gjennom thoraxen, kutte puppene i to. Bruk to par fine tang, ta tak i de kuttede kantene på hvert thoraxepitelet og gradvis rive opp thorax og hodekapsel, utsette øye-hjernekomplekset og det omkringliggende fettvevet. Deretter, uten å gripe vevet, bruk tang til å veilede hver gjennomskinnelig, off-white, dumbbell-formet øye-hjerne kompleks, vekk fra restene av hodet kapsel.Etter dissekering av seks til ti pupper, kutt en mikropipettespiss med et rent barberblad til en diameter på omtrent en millimeter, og smør spissen med en blanding av PBS og fett. Bruk den smurte pipettespissen til å overføre øye-hjernekompleksene til en brønn av en nibrønns glassfat som inneholder 400 mikroliter PBS på is, og overfør deretter vevet i 20 mikroliter PBS til minst 250 mikroliter fikseringsmiddel for en 35-minutters inkubasjon på is. På slutten av fikseringen bruker du den samme pipettespissen til å overføre vevet til en tredje brønn som inneholder 400 mikroliter frisk PBS i fem til 10 minutter på is.For å blokkere eventuelle ikke-spesifikke antistoffbindinger, overfør øye-hjernekompleksene til 400 mikroliter PBS pluss Triton X for en 10-til 60-minutters inkubasjon på is. På slutten av inkubasjonen, aliquot 10 mikroliter av den primære antistoffløsningen i det nødvendige antall brønner av en 72-brønns mikrobrønnplate, og bruk en P10 luftforskyvningmikropipe med en modifisert 0,5 millimeter tupp smurt med PBS pluss Triton X for å overføre ikke mer enn fem øye-hjernekomplekser og ikke mer enn tre mikroliter pbs til hver brønn av antistoffløsning. Etter en overnatting inkubasjon på fire grader Celsius, vask prøvene to ganger i 400 mikroliter PBS pluss Triton X i en brønn av en ni-brønns glassfat i fem til 10 minutter per vask.Etter den tredje vasken, overfør vevet til 100 mikroliter av en passende sekundær antistoffløsning i to timer ved romtemperatur, beskyttet mot lys, etterfulgt av tre fem til 10-minutters vasker i 400 mikroliter pbs pluss Triton X og en vask i PBS. Deretter likevekt prøvene i 200 mikroliter monteringsmedium i en til to timer. På slutten av inkubasjonen overfører du prøvene til et mikroskopsklie, og bruker en solid wolframnål til å feste et øye-hjernekompleks til lysbildet under et dissekeringsmikroskop.Deretter bruker du en fin wolframnål til å skjære hvert øye bort fra den tilhørende optiske fliken og manøvrere hvert øye til overflaten av mikroskopet, slik at øyets basale overflate ligger ved siden av lysbildet. Deretter påfør en ren dekkglass over prøvene, og forsegle dekkslippen med neglelakk. For å forberede pupal øyevev for vestlig flekkanalyse, må du først dissekere 10 til 16 pupper som tidligere demonstrert i to grupper, 10 til 15 minutter fra hverandre i PBS supplert med protease- og fosfatasehemmere.Etter kort skylling av de isolerte øye-hjernekompleksene to ganger i individuelle brønner av en ni-brønns glassrett på is i 400 mikroliter pbs pluss hemmere, overføre alle øye-hjerne komplekser i 400 mikroliter av iskalde PBS pluss hemmere dekantert på en ren svart dissekering parabolen. Under et rent dissekeringsmikroskop, bruk en solid wolframnål og et fint barberblad for å kutte hvert øye fra optisk lobe, og bruk en smurt spiss til å overføre øye-hjernekompleksene til fem mikroliter av PBS pluss hemmere til et 500 mikroliter mikrocentrifugerør på is. Deretter legger du til fem mikroliter av vestlig vev lysis buffer og 10 mikroliter av 2X konsentrert protein prøvebuffer til røret.For å behandle øye-hjerne komplekser for RNA ekstraksjon, iført hansker, rengjør benkeplate, mikroskop, formidling verktøy, og svart spre retter med 70% etanol og RNase dekontaminering reagens. Etter å ha tillatt området å tørke, dissekere totalt 30 til 40 pupper i grupper på seks til åtte. Etter at hver batch av øye-hjernekomplekser har blitt dissekert, overfører øye-hjernekompleksene fra nibrønnsretten til 400 mikroliter med friske, iskalde, nukleasefrie PBS på en ren dissekeringsrett, og bruk en solid wolframnål og et fint barberblad for å kutte hvert øye fra optisk lobe.Når alle øynene for en batch er fjernet, overføre dem til en steril, RNase-fri mikrocentrifuge tube, og flash-fryse prøvene i flytende nitrogen før du går videre til neste batch. Pupal øyet er et lett tilgjengelig vev som fungerer som en utmerket modell for å undersøke utviklingsprosesser, inkludert de som driver morfogenese. Rundt 40 timer etter pupariumdannelse oppnås det endelige arrangementet av celler.Dette er en ideell alder for å vurdere konsekvensene av en genetisk mutasjon eller modifisert genuttrykk. For eksempel, etter ektopisk uttrykk for Diap1, en kjernehemmer av apoptose, kan den påfølgende økningen i antall gitterceller sammenlignes med det som observeres i en kontroll retina. Apoptose kan også vurderes mer direkte ved å bruke antistoffer for å aktivere en døds caspase-1 eller ved å bruke andre tilnærminger for å oppdage døende celler.Vestlige blot analyser av øyelysater kan brukes til å bestemme tilstedeværelsen eller det relative uttrykket av proteiner av interesse eller for å sammenligne proteinuttrykk på ulike utviklingstidspunkter. Det er viktig å merke seg at dissekering mer enn 60 øyne per genotype eller eksperimentell tilstand er optimal for å isolere tilstrekkelig høy kvalitet RNA. Det viktigste å huske er at den pupale netthinnen er ekstremt skjør, og det må tas stor forsiktighet under disseksjonen for å sikre integriteten.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Storskala Sebrafisk Embryonic Hjerte Dissection for Transkripsjonell Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-avbildning av<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Isolering av Neural Stem / stamceller fra periventricular Region of Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

En rask og effektiv metode å dissekere Pupal vingene av Drosophila egnet for Immunodetections eller PCR analyser

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Correlative super-oppløsning og elektronmikroskop løse Protein lokalisering i sebrafisk netthinnen

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disseksjon og Immunofluorescent flekker av sopp kropp og Photoreceptor Neurons i voksen Drosophila melanogaster hjernen

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Disseksjon og flekker av Drosophila Pupal eggstokkene

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Tiner dyrking og Cryopreserving Drosophila linjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Bildebehandling og analyse av vevsorientering og vekstdynamikk i developing Drosophila Epithelia under pupal stadier

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Utarbeidelse av Drosophila Larval og Pupal Testiklene for analyse av celledivisjon i Live, intakt vev

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...