Name: dissection of the drosophila pupal retina for immunohistochemistry, western analysis, and rna isolation
Uploaded: 2019-03-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation at JoVE.com

Agradecemos a Zack tambor e nossos revisores para comentários úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela R15GM114729.

1. tecido preparação
<ol><li>Configurar Drosophila cruza (conforme descrito anteriormente20) ou cultura específicas cepas de drosófila para obter pupas do genótipo desejado. Para garantir que um grande número de pupas emerge coincidentemente, estabelecer essas culturas voar em duplicado na mídia de alimentos ricos em nutrientes ou padrão alimentar mídia generosamente suplementadas com levedura-colar.</li>
	<li>Manter as culturas de Drosophila , a 25 ° C. Para...

<ol>
	<li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+order+in+the+Drosophila+pupal+retina.">The emergence of order in the Drosophila pupal retina.</a> Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).</li><li>Wolff, T., Ready, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The development of Drosophila melanogaster. , 1277-1325 (1993).</li><li>Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye.">Pattern formation in the Drosophila eye.</a> Current opinion in genetics &amp; development. 17 (4), 309-313 (2007).</li><li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+an+ommatidium+one+cell+at+a+time.">Building an ommatidium one cell at a time.</a> Developmental Dynamics. 241 (1), 136-149 (2012).</li><li>Hayashi, T., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+mechanics+mediate+pattern+formation+in+the+developing+retina.">Surface mechanics mediate pattern formation in the developing retina.</a> Nature. 431, 647 (2004).</li><li>Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+Adhesion+Mediated+by+Hibris+and+Roughest+Regulates+Morphogenesis+and+Patterning+in+the+Drosophila+Eye.">Preferential Adhesion Mediated by Hibris and Roughest Regulates Morphogenesis and Patterning in the Drosophila Eye.</a> Developmental Cell. 8 (6), 925-935 (2016).</li><li>Cordero, J. B., Larson, D. E., Craig, C. R., Hays, R., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Decapentaplegic+signaling+regulates+patterning+and+adhesion+in+the+Drosophila+pupal+retina.">Dynamic Decapentaplegic signaling regulates patterning and adhesion in the Drosophila pupal retina.</a> Development (Cambridge, England). 134 (10), 1861-1871 (2007).</li><li>Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+behavior+in+the+developing+Drosophila+pupal+retina.">Cellular behavior in the developing Drosophila pupal retina.</a> Mechanisms of development. 125 (3-4), 223-232 (2008).</li><li>Mart&#237;n-Bermudo, M. D., Bardet, P. L., Bella&#239;che, Y., Malartre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vav+oncogene+antagonises+EGFR+signalling+and+regulates+adherens+junction+dynamics+during+Drosophila+eye+development.">The vav oncogene antagonises EGFR signalling and regulates adherens junction dynamics during Drosophila eye development.</a> Development. 142 (8), 1492-1501 (2015).</li><li>Chan, E. H., Chavadimane Shivakumar, P., Cl&#233;ment, R., Laugier, E., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+cortical+tension+mediated+by+N-cadherin+controls+cell+geometric+order+in+the+Drosophila+eye.">Patterned cortical tension mediated by N-cadherin controls cell geometric order in the Drosophila eye.</a> eLife. 6, e22796 (2017).</li><li>Lin, H. V., Rogulja, A., Cadigan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wingless+eliminates+ommatidia+from+the+edge+of+the+developing+eye+through+activation+of+apoptosis.">Wingless eliminates ommatidia from the edge of the developing eye through activation of apoptosis.</a> Development. 131 (10), 2409-2418 (2004).</li><li>Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+wingless+in+an+early+pupal+cell+death+event+that+contributes+to+patterning+the+Drosophila+eye.">A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye.</a> Mechanisms of development. 121 (12), 1523-1530 (2004).</li><li>Mendes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+c&#8208;d+regulates+developmental+apoptosis+in+the+Drosophila+retina.">Cytochrome c&#8208;d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina.</a> EMBO reports. 7 (9), 933-939 (2006).</li><li>Monserrate, J., Brachmann, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+death+zone:+a+spatially+restricted+region+for+programmed+cell+death+that+sculpts+the+fly+eye.">Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 14 (2), 209-217 (2007).</li><li>Bushnell, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JNK+is+antagonized+to+ensure+the+correct+number+of+interommatidial+cells+pattern+the+Drosophila+retina.">JNK is antagonized to ensure the correct number of interommatidial cells pattern the Drosophila retina.</a> Developmental Biology. 433 (1), 94-107 (2018).</li><li>Wolff, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+techniques+for+pupal+and+larval+Drosophila+eyes.">Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li><li>Hsiao, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+Immunohistochemistry+of+Larval,+Pupal+and+Adult+Drosophila+Retinas.">Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4347 (2012).</li><li>Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+Mounting+of+Drosophila+Pupal+Eye+Discs.">Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (93), e52315 (2014).</li><li>Johnson, R. I., Cagan, R. 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M., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Drosophila+glass+protein+and+evidence+for+negative+regulation+of+its+activity+in+non-neuronal+cells+by+another+DNA-binding+protein.">Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein.</a> Development. 119 (3), 855-865 (1993).</li><li>Duffy, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+drosophila:+A+fly+geneticist's+swiss+army+knife.">GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife.</a> genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li><li>Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+broad+expression+profile+of+the+GMR-GAL4+driver+in+Drosophila+melanogaster.">A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster.</a> Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).</li><li>Song, Z., McCall, K., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCP-1,+a+Drosophila+Cell+Death+Protease+Essential+for+Development.">DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development.</a> Science. 275 (5299), 536-540 (1997).</li><li>Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+homologs+of+baculovirus+inhibitor+of+apoptosis+proteins+function+to+block+cell+death.">Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death.</a> Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).</li></ol>

O método de dissecação de olho pupal drosófila descrito aqui permite o isolamento de 6 a 10 complexos de olho-cérebro dentro de 10 a 15 min. No entanto, paciência e prática são essenciais para dominar a técnica de dissecação e melhorar a qualidade e a velocidade de dissecações. Desta vez de dissecação curto garante que cada olho é aproximadamente mesmo fase de desenvolvimento, reduzindo a variabilidade na expressão do fenótipo ou gene de retina em um conjunto de dados. Enquanto protocolos alter...

A retina de Drosophila é composta de aproximadamente 750 omatídeos, rodeados por células de pigmento, dispostas em um favo de mel lattice1,2,3,4. Cada omatídeo contém oito neurônios fotoreceptor, quatro células cone secretoras de lente e duas células primárias de pigmento. Ao redor cada omatídeo são células produtoras de pigmento do retículo e grupos de cerdas sensoriais. Devido à sua natureza pós mitótica e estereotipado arranjo hexagonal, Drosophila pupal retina fornece um sistema de excelente modelo para o estudo de processos morfogenéticas incluindo célula adesão5,6, 7,8,9,10 e apoptose11,12,13,14,15.
Vários protocolos publicados utilizam pressão de ar para extrair complexos de olho-cérebro de Drosophila pupas16,17,18. O protocolo descrito aqui, em vez disso utiliza ferramentas microdissection para cuidadosamente e isolar precisamente complexos de olho-cérebro, com o objetivo de se obter o tecido da retina intacto. Isso é fundamental se as retinas são para ser utilizada para morfológica, proteína, ou expressão gênica analisa desde danos à retina podem resultar em estresse celular ou morte, que poderia modificar a expressão celular do fenótipo ou gene. Além disso, depois do treino, complexos de 6 a 10 olho-cérebro podem ser isolados em 10 a 15 min, facilitando o objetivo de minimizar a variabilidade na idade e grau de desenvolvimento do tecido do olho dissecado.
A fixação, imunocoloração e montagem em todo o protocolo descrito abaixo é adequado para a preparação dos olhos de drosófila para microscopia fluorescente. As retinas podem ser incubadas com anticorpos alvejando proteínas de interesse. Por exemplo, anticorpos para componentes de junção aderente podem ser utilizados para visualizar as circunferências apicais das células para que características, incluindo o tipo de célula, forma e arranjo podem ser avaliados19. Antes da fixação, olhos em vez disso podem ser clivados do cérebro com a finalidade de extração de proteínas para análise ocidental, ou RNA para uso em qRT-PCR ou a sequenciação do ARN.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Adobe Photoshop</td>
			<td style="width:131px;">Adobe</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Image processing software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Bamboo splints, 6&#34;&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Ted Pella Inc</td>
			<td style="width:95px;">116</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Beta mercaptoethanol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">M3148</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Beta-glycerol phosphate</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">50020</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="90">
			<td height="90" style="height:91px;width:145px;">Black dissecting dish</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Blade holder</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">10053</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">A7906</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:131px;">Roche</td>
			<td style="width:95px;">4693132001</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Confocal microscope (Zeiss LSM 501)</td>
			<td style="width:131px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Diethyl Pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">40718</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Double-sided tape</td>
			<td style="width:131px;">3M</td>
			<td style="width:95px;">665</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:145px;">Drosophila food media, nutrient-rich&#160;</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">Drosophila food media, standard</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe.&#160; (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">E6758</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Fixative solution</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">4% formadehyde in PBS, pH 7.4.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope)</td>
			<td style="width:131px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">91150-20</td>
			<td style="width:285px;">Forceps should be sharpened frequently.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:131px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:95px;">28908</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Glass 9-well dishes&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:95px;">7220-85</td>
			<td style="width:285px;">Also known as 9-well dishes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Glass coverslips (22 x 22 mm)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:95px;">12-542-B</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:95px;">12-550-413</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Glass petri dish</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:95px;">3160-100BO</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Glycerol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">G5516</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Image Studio software version 5.2.5</td>
			<td style="width:131px;">LI-COR Biosciences</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Image processing software for quantitation of Western blots.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Laemmli sample buffer</td>
			<td style="width:131px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:95px;">161-0737</td>
			<td style="width:285px;">2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Lane marker reducing sample buffer&#160;</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:95px;">39000</td>
			<td style="width:285px;">5X concentrated protein sample buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Microcentrigure tubes&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Axygen</td>
			<td style="width:95px;">MCT-175-C</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Microdissection scissors&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">15000-03</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Microwell trays (72 x 10 &#181;L wells)</td>
			<td style="width:131px;">Nunc</td>
			<td style="width:95px;">438733</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Mounting media</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">N-propylgallate</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">P3130</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:145px;">Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">P5368</td>
			<td style="width:285px;">Prepare according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">PBT</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Pin holder</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">26016-12</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Primary antibody: goat anti-GAPDH</td>
			<td style="width:131px;">Imgenex</td>
			<td style="width:95px;">IMG-3073</td>
			<td style="width:285px;">For Western blotting. Used at 1:3000</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1</td>
			<td style="width:131px;">Cell signaling</td>
			<td style="width:95px;">9578S</td>
			<td style="width:285px;">For immunofluorescence. Used at 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Primary antibody: rat anti-DEcad</td>
			<td style="width:131px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:95px;">DCAD2</td>
			<td style="width:285px;">For immunofluorescence. Used at 1:20</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Primary antibody: rat anti-DEcad</td>
			<td style="width:131px;">DOI: 10.1006/dbio.1994.1287</td>
			<td style="width:95px;">DCAD1</td>
			<td style="width:285px;">&#160;Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Promega</td>
			<td style="width:95px;">Z6110</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">Rnase decontamination reagent (RNase Away)</td>
			<td style="width:131px;">Molecular BioProducts</td>
			<td style="width:95px;">7002</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">10050</td>
			<td style="width:285px;">Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">Secondary antibody: 488-conjugated&#160; donkey anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:131px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:95px;">712-545-153</td>
			<td style="width:285px;">For immunofluorescence. Used at 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:131px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:95px;">111-165-144</td>
			<td style="width:285px;">For immunofluorescence. Used at 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:131px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:95px;">7077</td>
			<td style="width:285px;">For Western blotting. Used at 1:3000</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:131px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:95px;">305-035-003</td>
			<td style="width:285px;">For Western blotting. Used at 1:3000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">S3014</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Sodium Fluoride</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">215309</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Sodium vanadate</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">50860</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Spectrophotometer (NanoDrop)</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:95px;">2000c&#160;</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Stereo dissecting microscope (M60 or M80)</td>
			<td style="width:131px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Sylgard (black)</td>
			<td style="width:131px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:95px;">SYLG170</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Sylgard (transparent)</td>
			<td style="width:131px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:95px;">SYLG184</td>
			<td style="width:285px;">Color black with finely ground charcol powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Tissue: Kimwipes</td>
			<td style="width:131px;">KIMTECH</td>
			<td style="width:95px;">34120</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">TritonX</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">T8787</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Trizma hydrochloride pH7.5</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">T5941</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Tungsten needle, fine</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">10130-10</td>
			<td style="width:285px;">Insert into pin holder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Tungsten needle, sturdy</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">10130-20</td>
			<td style="width:285px;">Insert into pin holder</td>
		</tr>
		<tr height="130">
			<td height="130" style="height:130px;width:145px;">WTLB (western tissue lysis buffer)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution.</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:145px;">Yeast paste</td>
			<td style="width:131px;">(local supermarket)</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Approximately 2 tablespoons Fleischmann&#39;s ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of the drosophila pupal retina for immunohistochemistry, western analysis, and rna isolation

A retina pupal Drosophila fornece um sistema de excelente modelo para o estudo de processos morfogenéticas durante o desenvolvimento. Neste trabalho, apresentamos um protocolo confiável para a dissecação da retina pupal Drosophila delicada. Nossa abordagem cirúrgica utiliza ferramentas prontamente disponíveis microdissection para abrir pupas e extrair precisamente complexos de olho-cérebro. Estas podem ser fixas, submetidas a imuno-histoquímica e retinas então montadas em corrediças do microscópio e fotografadas se o objetivo é detectar estruturas celulares ou subcelulares. Alternativamente, as retinas não fixadas podem ser isoladas do tecido cerebral, lysed em buffers apropriadas e utilizadas para proteína gel de electroforese ou mRNA extração (avaliar a expressão de proteínas ou gene, respectivamente). Paciência e prática significativa podem ser necessária para dominar o microdissection protocolo descrito, mas uma vez dominado, o protocolo permite isolamento relativamente rápido da retina principalmente sem danos.

O olho pupal é um tecido facilmente acessível que serve como um excelente modelo para investigar os processos de desenvolvimento que morfogênese da unidade. Aqui, podemos ter dissecado as retinas e usado a imunofluorescência para detectar as junções adherens apical (Figura 3A, C) ou a caspase Dcp-1 (Figura 3D) que é ativada durante a apoptose (Figura 3)25. Essas abordagens permitem obs...

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Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Este trabalho apresenta um método cirúrgico para dissecando Drosophila pupal retina juntamente com protocolos para o processamento de tecido para extração de RNA, análise ocidental e imuno-histoquímica.

Dissecação da Retina Pupal drosófila para imuno-histoquímica, análise ocidental e isolamento de RNA

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Este protocolo é significativo porque este é um método eficiente para o isolamento do tecido ocular pupal Drosophila para múltiplas aplicações a jusante. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a dissecação rápida de um grande número de olhos pupais sem danificar o tecido. A dissecação da retina pupal Drosophila será um desafio para os novatos.Praticar a técnica é a melhor maneira de melhorar a velocidade das dissecções e a qualidade dos resultados. Depois de colocar o pupae Drosophila em um prato de dissecação preto, coloque um pedaço fresco de fita dupla face no prato de dissecação, longe da pupae, e use um par de fórceps para colocar cuidadosamente o lado dorsal pupae sobre a fita. Coloque o prato sob um microscópio estéreo e use fórceps para remover o operculum de cada pupa.Use uma tesoura de microdisseção para cortar cada caixa pupal, permitindo que ela seja aberta para revelar a cabeça, o tórax e o segmento abdominal anterior, e fixar as bordas da caixa pupal à fita de dupla face. Fure o abdômen de cada pupa com fórceps afiados, e remova a pupa de sua caixa pupal. Coloque a pupa no prato de dissecção, longe da fita, e cubra a pupa com 400 microliters de PBS gelado.Use fórceps para agarrar cada um pelo abdômen, e use a tesoura de microdisseção para fazer uma incisão transversal limpa através do tórax, cortando a pupa ao meio. Usando dois pares de fórceps finos, segure as bordas cortadas de cada epitélio tórax e gradualmente rasgue o tórax e a cápsula da cabeça, expondo o complexo olho-cérebro e o tecido adiposo circundante. Então, sem agarrar o tecido, use fórceps para guiar cada complexo translúcido, off-white, em forma de haltere, em forma de haltere, longe dos restos da cápsula da cabeça.Depois de dissecar de 6 a 10 pupas, corte uma ponta de micropipette com uma lâmina de barbear limpa a um diâmetro de cerca de um milímetro, e lubrifique a ponta com uma mistura de PBS e gordura. Use a ponta de pipeta lubrificada para transferir os complexos olho-cérebro para um poço de um prato de vidro de nove poços contendo 400 microliters de PBS no gelo, e, em seguida, transferir o tecido em 20 microliters de PBS em pelo menos 250 microliters de fixação para uma incubação de 35 minutos no gelo. No final da fixação, use a mesma ponta de pipeta para transferir o tecido para um terceiro poço contendo 400 microliters de PBS frescos por cinco a 10 minutos no gelo.Para bloquear qualquer ligação de anticorpos não específico, transfira os complexos olho-cérebro em 400 microliters de PBS mais Triton X para uma incubação de 10 a 60 minutos no gelo. Ao final da incubação, aliquot 10 microliters da solução de anticorpos primários no número necessário de poços de uma placa de microwell de 72 poços, e usar uma micropipette de deslocamento de ar P10 com uma ponta modificada de 0,5 milímetros lubrificada com PBS mais Triton X para transferir não mais do que cinco complexos cerebrais oculares e não mais do que três microliters de PBS em cada poço de solução de anticorpos. Depois de uma incubação durante a noite a quatro graus Celsius, lave as amostras duas vezes em 400 microliters de PBS mais Triton X em um poço de um prato de vidro de nove poços por cinco a 10 minutos por lavagem.Após a terceira lavagem, transfira o tecido para 100 microliters de uma solução de anticorpos secundários apropriada por duas horas à temperatura ambiente, protegido da luz, seguindo por três lavagens de cinco a 10 minutos em 400 microliters de PBS mais Triton X e uma lavagem em PBS. Em seguida, equilibre as amostras em 200 microliters de meio de montagem por uma a duas horas. No final da incubação, transfira as amostras para um slide de microscópio, e use uma agulha de tungstênio resistente para fixar um complexo olho-cérebro ao slide sob um microscópio dissecando.Em seguida, use uma agulha de tungstênio fina para cortar cada olho de seu lobo óptico associado e para manobrar cada olho para a superfície do microscópio deslizar para que a superfície basal do olho seja adjacente ao slide. Em seguida, aplique uma mancha de cobertura limpa sobre as amostras e sele a mancha com esmalte. Para preparar o tecido ocular pupal para a análise da mancha ocidental, primeiro disseco de 10 a 16 pupas como demonstrado anteriormente em dois lotes, de 10 a 15 minutos de diferença em PBS complementado com inibidores de protease e fosfatase.Depois de enxaguar brevemente os complexos olho-cérebro isolados duas vezes em poços individuais de um prato de vidro de nove poços no gelo em 400 microliters de PBS mais inibidores, transfira todos os complexos olho-cérebro em 400 microliters de PBS gelado mais inibidores decantados em um prato de dissecação preto limpo. Sob um microscópio de dissecação limpa, use uma agulha de tungstênio resistente e uma lâmina de barbear fina para cortar cada olho do lobo óptico, e use uma ponta lubrificada para transferir os complexos olho-cérebro em cinco microlitros de PBS mais inibidores em um tubo de microcentrífusão de 500 microlitros no gelo. Em seguida, adicione cinco microliters de tampão de tecido ocidental e 10 microliters de tampão de amostra de proteína concentrada 2X ao tubo.Para processar os complexos olho-cérebro para extração de RNA, usando luvas, limpar o bancada, microscópio, ferramentas de dissecação e pratos de dissecação preto com 70% de etanol e reagente de descontaminação RNase. Depois de permitir que a área seque, disseque um total de 30 a 40 pupas em lotes de seis a oito. Depois que cada lote de complexos olho-cérebro foram dissecados, transfira os complexos olho-cérebro do prato de nove poços em 400 microliters de PBS fresco, gelado e sem nuclease em um prato de dissecação limpa, e use uma agulha de tungstênio resistente e uma lâmina de barbear fina para cortar limpamente cada olho do lobo óptico.Quando todos os olhos de um lote tiverem sido removidos, transfira-os para um tubo de microcentrifuge estéril, sem RNase, e congele as amostras em nitrogênio líquido antes de prosseguir para o próximo lote. O olho pupal é um tecido de fácil acesso que serve como um excelente modelo para investigar processos de desenvolvimento, incluindo aqueles que conduzem morfogênese. Cerca de 40 horas após a formação do puparium, o arranjo final das células é alcançado.Esta é uma idade ideal para avaliar as consequências de uma mutação genética ou expressão genética modificada. Por exemplo, seguindo a expressão ectópica do Diap1, um inibidor central da apoptose, o consequente aumento no número de células de rede pode ser comparado ao observado em uma retina de controle. A apoptose também pode ser avaliada mais diretamente utilizando anticorpos para ativar um caspase-1 da morte ou usando outras abordagens para detectar células moribundas.Análises de manchas ocidentais de lises oculares podem ser usadas para determinar a presença ou expressão relativa de proteínas de interesse ou para comparar a expressão proteica em diferentes pontos de tempo de desenvolvimento. É importante notar que dissecar mais de 60 olhos por genótipo ou condição experimental é ideal para isolar RNA suficiente de alta qualidade. O mais importante a ser lembrado é que a retina pupal é extremamente frágil, e muito cuidado deve ser tomado durante sua dissecação para garantir sua integridade.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Em larga escala Zebrafish Embryonic Coração de dissecação para a análise transcricional

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Biologia do Desenvolvimento

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Vivo-imaging da<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Isolamento de Neural Stem / células progenitoras da Região Periventricular do rato adulto e Medula Espinhal Humano

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Um método rápido e eficiente para dissecar asas Pupal de Drosophila apropriado para Immunodetections ou ensaios PCR

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Correlativa Super-resolução e microscopia eletrônica para resolver a localização da proteína na Retina de Zebrafish

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissecção e coloração dos ovários Pupal drosófila

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Descongelamento, cultivo e Cryopreserving linhas de células de Drosophila

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imagem e Análise da Dinâmica de Orientação e Crescimento tecidual na Epitélia Drosophila em Desenvolvimento durante os estágios pupal

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Preparação de Drosophila Larval e Pupal Testes para Análise de Divisão Celular em Tecido Vivo e Intacto

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...