Name: dissection of the drosophila pupal retina for immunohistochemistry, western analysis, and rna isolation
Uploaded: 2019-03-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation at JoVE.com

Agradecemos a Zack tambor y nuestros revisores para comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por R15GM114729.

1. preparación de tejido
<ol><li>Configurar Drosophila cruza (como se describe anteriormente20) o cepas específicas de Drosophila para obtener pupas del genotipo deseado de la cultura. Para asegurar que un gran número de pupas emerge coincidentemente, establecer estas culturas mosca por duplicado en medios de alimentos ricos en nutrientes o alimentos medios suplidos generosamente con pasta de levadura.</li>
	<li>Mantener cultivos de Drosophila a 25 ° C. Para cruces...

<ol>
	<li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+order+in+the+Drosophila+pupal+retina.">The emergence of order in the Drosophila pupal retina.</a> Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).</li><li>Wolff, T., Ready, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The development of Drosophila melanogaster. , 1277-1325 (1993).</li><li>Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye.">Pattern formation in the Drosophila eye.</a> Current opinion in genetics &amp; development. 17 (4), 309-313 (2007).</li><li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+an+ommatidium+one+cell+at+a+time.">Building an ommatidium one cell at a time.</a> Developmental Dynamics. 241 (1), 136-149 (2012).</li><li>Hayashi, T., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+mechanics+mediate+pattern+formation+in+the+developing+retina.">Surface mechanics mediate pattern formation in the developing retina.</a> Nature. 431, 647 (2004).</li><li>Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+Adhesion+Mediated+by+Hibris+and+Roughest+Regulates+Morphogenesis+and+Patterning+in+the+Drosophila+Eye.">Preferential Adhesion Mediated by Hibris and Roughest Regulates Morphogenesis and Patterning in the Drosophila Eye.</a> Developmental Cell. 8 (6), 925-935 (2016).</li><li>Cordero, J. B., Larson, D. E., Craig, C. R., Hays, R., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Decapentaplegic+signaling+regulates+patterning+and+adhesion+in+the+Drosophila+pupal+retina.">Dynamic Decapentaplegic signaling regulates patterning and adhesion in the Drosophila pupal retina.</a> Development (Cambridge, England). 134 (10), 1861-1871 (2007).</li><li>Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+behavior+in+the+developing+Drosophila+pupal+retina.">Cellular behavior in the developing Drosophila pupal retina.</a> Mechanisms of development. 125 (3-4), 223-232 (2008).</li><li>Mart&#237;n-Bermudo, M. D., Bardet, P. L., Bella&#239;che, Y., Malartre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vav+oncogene+antagonises+EGFR+signalling+and+regulates+adherens+junction+dynamics+during+Drosophila+eye+development.">The vav oncogene antagonises EGFR signalling and regulates adherens junction dynamics during Drosophila eye development.</a> Development. 142 (8), 1492-1501 (2015).</li><li>Chan, E. H., Chavadimane Shivakumar, P., Cl&#233;ment, R., Laugier, E., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+cortical+tension+mediated+by+N-cadherin+controls+cell+geometric+order+in+the+Drosophila+eye.">Patterned cortical tension mediated by N-cadherin controls cell geometric order in the Drosophila eye.</a> eLife. 6, e22796 (2017).</li><li>Lin, H. V., Rogulja, A., Cadigan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wingless+eliminates+ommatidia+from+the+edge+of+the+developing+eye+through+activation+of+apoptosis.">Wingless eliminates ommatidia from the edge of the developing eye through activation of apoptosis.</a> Development. 131 (10), 2409-2418 (2004).</li><li>Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+wingless+in+an+early+pupal+cell+death+event+that+contributes+to+patterning+the+Drosophila+eye.">A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye.</a> Mechanisms of development. 121 (12), 1523-1530 (2004).</li><li>Mendes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+c&#8208;d+regulates+developmental+apoptosis+in+the+Drosophila+retina.">Cytochrome c&#8208;d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina.</a> EMBO reports. 7 (9), 933-939 (2006).</li><li>Monserrate, J., Brachmann, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+death+zone:+a+spatially+restricted+region+for+programmed+cell+death+that+sculpts+the+fly+eye.">Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 14 (2), 209-217 (2007).</li><li>Bushnell, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JNK+is+antagonized+to+ensure+the+correct+number+of+interommatidial+cells+pattern+the+Drosophila+retina.">JNK is antagonized to ensure the correct number of interommatidial cells pattern the Drosophila retina.</a> Developmental Biology. 433 (1), 94-107 (2018).</li><li>Wolff, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+techniques+for+pupal+and+larval+Drosophila+eyes.">Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li><li>Hsiao, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+Immunohistochemistry+of+Larval,+Pupal+and+Adult+Drosophila+Retinas.">Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4347 (2012).</li><li>Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+Mounting+of+Drosophila+Pupal+Eye+Discs.">Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (93), e52315 (2014).</li><li>Johnson, R. I., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quantitative+Method+to+Analyze+Drosophila+Pupal+Eye+Patterning.">A Quantitative Method to Analyze Drosophila Pupal Eye Patterning.</a> PLoS ONE. 4 (9), e7008 (2009).</li><li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Ellis, M. C., O'Neill, E. M., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Drosophila+glass+protein+and+evidence+for+negative+regulation+of+its+activity+in+non-neuronal+cells+by+another+DNA-binding+protein.">Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein.</a> Development. 119 (3), 855-865 (1993).</li><li>Duffy, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+drosophila:+A+fly+geneticist's+swiss+army+knife.">GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife.</a> genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li><li>Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+broad+expression+profile+of+the+GMR-GAL4+driver+in+Drosophila+melanogaster.">A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster.</a> Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).</li><li>Song, Z., McCall, K., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCP-1,+a+Drosophila+Cell+Death+Protease+Essential+for+Development.">DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development.</a> Science. 275 (5299), 536-540 (1997).</li><li>Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+homologs+of+baculovirus+inhibitor+of+apoptosis+proteins+function+to+block+cell+death.">Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death.</a> Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).</li></ol>

El método de disección de ojo pupal de Drosophila aquí descrito permite el aislamiento de complejos de músculo-ojo-cerebro de 6 a 10 en 10 a 15 min. Sin embargo, paciencia y práctica son esenciales para dominar la técnica de disección y mejorar la calidad y velocidad de disecciones. Este tiempo breve disección asegura que cada ojo es aproximadamente la misma etapa de desarrollo, reducir la variabilidad en la expresión del fenotipo o gen de retinas en un conjunto de datos. Mientras protocolos alternativo...

La retina de Drosophila se compone de aproximadamente 750 ommatidia rodeada de pigmento las células dispuestas en panal enrejado1,2,3,4. Cada ommatidium contiene ocho neuronas fotorreceptoras, cuatro células secretoras de la lente de cono y dos células de pigmento primarias. Que rodean cada ommatidium son células productoras de pigmento de enrejado y los grupos de cerdas sensoriales. Debido a su naturaleza poste-mitotic y arreglo hexagonal estereotipada, la retina pupal de Drosophila proporciona un sistema modelo excelente para el estudio de los procesos morfogenéticos incluyendo células adherencia5,6, 7,8,9,10 y apoptosis11,12,13,14,15.
Varios protocolos publicados utilizan presión de aire a extraer complejos músculo-ojo-cerebro de Drosophila pupa16,17,18. El protocolo descrito aquí en su lugar utiliza instrumentos de microdisección para cuidadosamente y precisamente aislar complejos músculo-ojo-cerebro con el objetivo de obtener tejido retiniano intacto. Esto es crucial si retinas son para ser utilizados para morfológicos, proteína o expresión génica análisis ya que puede dañar a retinas estrés celular o incluso la muerte, que podría modificar la expresión del fenotipo o gene del celular. Además, después de la práctica, pueden aislarse complejos músculo-ojo-cerebro de 6 a 10 en 10 a 15 minutos, facilitando el objetivo de minimizar la variabilidad en la edad y etapa de desarrollo de tejido ocular disecada.
La fijación, inmunotinción y montaje de todo Protocolo se describe a continuación es conveniente para la preparación de ojos de Drosophila para microscopía fluorescente. Retinas pueden ser incubadas con anticuerpos contra proteínas de interés. Por ejemplo, anticuerpos contra componentes de ensambladura de los adherens puede ser utilizado para visualizar las circunferencias apicales de las células para poder características como tipo de la célula, forma y arreglo de los19. Antes de la fijación, ojos en su lugar pueden ser hendidos del cerebro con el fin de extracción de proteínas para análisis occidental o ARN para su uso en qRT-PCR o secuenciación del RNA.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Adobe Photoshop</td>
			<td style="width:131px;">Adobe</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Image processing software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Bamboo splints, 6&#34;&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Ted Pella Inc</td>
			<td style="width:95px;">116</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Beta mercaptoethanol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">M3148</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Beta-glycerol phosphate</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">50020</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="90">
			<td height="90" style="height:91px;width:145px;">Black dissecting dish</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Blade holder</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">10053</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">A7906</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:131px;">Roche</td>
			<td style="width:95px;">4693132001</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Confocal microscope (Zeiss LSM 501)</td>
			<td style="width:131px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Diethyl Pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">40718</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Double-sided tape</td>
			<td style="width:131px;">3M</td>
			<td style="width:95px;">665</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:145px;">Drosophila food media, nutrient-rich&#160;</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">Drosophila food media, standard</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe.&#160; (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">E6758</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Fixative solution</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">4% formadehyde in PBS, pH 7.4.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope)</td>
			<td style="width:131px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">91150-20</td>
			<td style="width:285px;">Forceps should be sharpened frequently.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:131px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:95px;">28908</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Glass 9-well dishes&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:95px;">7220-85</td>
			<td style="width:285px;">Also known as 9-well dishes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Glass coverslips (22 x 22 mm)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:95px;">12-542-B</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:95px;">12-550-413</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Glass petri dish</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:95px;">3160-100BO</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Glycerol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">G5516</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Image Studio software version 5.2.5</td>
			<td style="width:131px;">LI-COR Biosciences</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Image processing software for quantitation of Western blots.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Laemmli sample buffer</td>
			<td style="width:131px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:95px;">161-0737</td>
			<td style="width:285px;">2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Lane marker reducing sample buffer&#160;</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:95px;">39000</td>
			<td style="width:285px;">5X concentrated protein sample buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Microcentrigure tubes&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Axygen</td>
			<td style="width:95px;">MCT-175-C</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Microdissection scissors&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">15000-03</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Microwell trays (72 x 10 &#181;L wells)</td>
			<td style="width:131px;">Nunc</td>
			<td style="width:95px;">438733</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Mounting media</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">N-propylgallate</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">P3130</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:145px;">Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">P5368</td>
			<td style="width:285px;">Prepare according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">PBT</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Pin holder</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">26016-12</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Primary antibody: goat anti-GAPDH</td>
			<td style="width:131px;">Imgenex</td>
			<td style="width:95px;">IMG-3073</td>
			<td style="width:285px;">For Western blotting. Used at 1:3000</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1</td>
			<td style="width:131px;">Cell signaling</td>
			<td style="width:95px;">9578S</td>
			<td style="width:285px;">For immunofluorescence. Used at 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Primary antibody: rat anti-DEcad</td>
			<td style="width:131px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:95px;">DCAD2</td>
			<td style="width:285px;">For immunofluorescence. Used at 1:20</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Primary antibody: rat anti-DEcad</td>
			<td style="width:131px;">DOI: 10.1006/dbio.1994.1287</td>
			<td style="width:95px;">DCAD1</td>
			<td style="width:285px;">&#160;Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Promega</td>
			<td style="width:95px;">Z6110</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">Rnase decontamination reagent (RNase Away)</td>
			<td style="width:131px;">Molecular BioProducts</td>
			<td style="width:95px;">7002</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">10050</td>
			<td style="width:285px;">Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">Secondary antibody: 488-conjugated&#160; donkey anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:131px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:95px;">712-545-153</td>
			<td style="width:285px;">For immunofluorescence. Used at 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:131px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:95px;">111-165-144</td>
			<td style="width:285px;">For immunofluorescence. Used at 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:131px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:95px;">7077</td>
			<td style="width:285px;">For Western blotting. Used at 1:3000</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:131px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:95px;">305-035-003</td>
			<td style="width:285px;">For Western blotting. Used at 1:3000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">S3014</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Sodium Fluoride</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">215309</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Sodium vanadate</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">50860</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Spectrophotometer (NanoDrop)</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:95px;">2000c&#160;</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Stereo dissecting microscope (M60 or M80)</td>
			<td style="width:131px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Sylgard (black)</td>
			<td style="width:131px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:95px;">SYLG170</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Sylgard (transparent)</td>
			<td style="width:131px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:95px;">SYLG184</td>
			<td style="width:285px;">Color black with finely ground charcol powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Tissue: Kimwipes</td>
			<td style="width:131px;">KIMTECH</td>
			<td style="width:95px;">34120</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">TritonX</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">T8787</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Trizma hydrochloride pH7.5</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">T5941</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Tungsten needle, fine</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">10130-10</td>
			<td style="width:285px;">Insert into pin holder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Tungsten needle, sturdy</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">10130-20</td>
			<td style="width:285px;">Insert into pin holder</td>
		</tr>
		<tr height="130">
			<td height="130" style="height:130px;width:145px;">WTLB (western tissue lysis buffer)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution.</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:145px;">Yeast paste</td>
			<td style="width:131px;">(local supermarket)</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Approximately 2 tablespoons Fleischmann&#39;s ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of the drosophila pupal retina for immunohistochemistry, western analysis, and rna isolation

La retina pupal de Drosophila proporciona un sistema modelo excelente para el estudio de procesos morfogenéticos durante el desarrollo. En este trabajo, presentamos un protocolo confiable para la disección de la delicada retina pupal de Drosophila . Nuestro abordaje utiliza herramientas fácilmente disponibles de microdisección para abrir pupas y precisamente extraer complejos músculo-ojo-cerebro. Estos pueden fijarse, objeto de immunohistochemistry y retinas entonces montados en portaobjetos de microscopio y reflejados si el objetivo es detectar estructuras celulares o subcelulares. Alternativamente, retinas interpretaciones pueden ser aislados del tejido cerebral, lisis en buffers de apropiada y utilizadas para que proteína gel electroforesis o mRNA extracción (evaluar la expresión de la proteína o gen, respectivamente). Paciencia y práctica significativa pueden ser necesario para dominar el protocolo de microdisección descrito, pero una vez dominado, el protocolo permite aislamiento relativamente rápida de retinas principalmente intactas.

El ojo de pupa es un tejido de fácil acceso que sirve como un excelente modelo para investigar procesos de desarrollo morfogénesis de la drive. Aquí, nosotros hemos diseccionado retinas y utiliza inmunofluorescencia para detectar las ensambladuras de los adherens apical (Figura 3A, C) o la caspasa Dcp-1 (figura 3D) que se activa durante la apoptosis (figura 3)25. Estos enfoques permiten ob...

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Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Este artículo presenta un método quirúrgico para disección Drosophila pupas retinas junto con protocolos para el procesamiento del tejido para la extracción de RNA, inmunohistoquímica y análisis occidental.

Disección de la Retina Pupal de Drosophila para inmunohistoquímica, Western análisis y aislamiento de ARN

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Este protocolo es significativo porque este es un método eficiente para el aislamiento del tejido ocular pupal Drosophila para múltiples aplicaciones aguas abajo. La principal ventaja de esta técnica es que permite la rápida disección de un gran número de ojos pupales sin dañar el tejido. La disección de la retina pupal Drosophila será un reto para los principiantes.Practicar la técnica es la mejor manera de mejorar la velocidad de las disecciones y la calidad de los resultados. Después de colocar las pupas Drosophila en un plato de disección negro, coloque un pedazo fresco de cinta adhesiva de doble cara en el plato diseccionador, lejos de las pupas, y use un par de fórceps para colocar cuidadosamente el lado dorsal pupae hacia arriba en la cinta. Coloque el plato debajo de un microscopio estéreo y use fórceps para eliminar el opérculo de cada pupa.Utilice tijeras de microdisección para cortar cada caso de pupal, lo que permite que se abra la cabeza, el tórax y el segmento abdominal anterior, y asegure los bordes de la caja pupal a la cinta de doble cara. Perfora el abdomen de cada pupa con fórceps afilados, y retira la pupa de su estuche pupal. Coloque la pupa en el plato de disección, lejos de la cinta, y cubra la pupa con 400 microlitros de PBS helado.Use fórceps para agarrar cada uno por el abdomen, y use las tijeras de microdisección para hacer una incisión transversal limpia a través del tórax, cortando las pupas por la mitad. Usando dos pares de fórceps finos, agarre los bordes cortados de cada epítelio del tórax y desgarre gradualmente el tórax y la cápsula de la cabeza, exponiendo el complejo ojo-cerebro y el tejido graso circundante. Luego, sin agarrar el tejido, usa fórceps para guiar cada complejo ojo-cerebro translúcido, blanquecino y en forma de mancuerna, lejos de los restos de la cápsula de la cabeza.Después de diseccionar de seis a 10 pupas, corta una punta de micropipeta con una cuchilla de afeitar limpia a un diámetro de aproximadamente un milímetro, y lubrica la punta con una mezcla de PBS y grasa. Utilice la punta de la pipeta lubricada para transferir los complejos ojo-cerebro a un pozo de un plato de vidrio de nueve pocús que contiene 400 microlitros de PBS sobre hielo, y luego transfiera el tejido en 20 microlitros de PBS en al menos 250 microlitros de fijador para una incubación de 35 minutos en hielo. Al final de la fijación, utilice la misma punta de pipeta para transferir el tejido a un tercer pozo que contenga 400 microlitros de PBS fresco durante cinco a 10 minutos en hielo.Para bloquear cualquier unión de anticuerpos no específica, transfiera los complejos ojo-cerebro a 400 microlitros de PBS más Triton X para una incubación de 10 a 60 minutos sobre hielo. Al final de la incubación, aliquot 10 microlitros de la solución de anticuerpos primarios en el número necesario de pozos de una placa de micropocillos de 72 pocillos, y utilizar una micropipeta de desplazamiento de aire P10 con una punta modificada de 0,5 milímetros lubricada con PBS más Triton X para transferir no más de cinco complejos cerebrales oculares y no más de tres microlitros de PBS en cada pozo de solución de anticuerpos. Después de una incubación durante la noche a cuatro grados centígrados, lave las muestras dos veces en 400 microlitros de PBS más Triton X en un pozo de un plato de vidrio de nueve pogulos durante cinco a 10 minutos por lavado.Después del tercer lavado, transfiera el tejido a 100 microlitros de una solución de anticuerpos secundaria apropiada durante dos horas a temperatura ambiente, protegida de la luz, siguiendo tres lavados de cinco a 10 minutos en 400 microlitros de PBS más Triton X y un lavado en PBS. A continuación, equilibre las muestras en 200 microlitros de medio de montaje durante una o dos horas. Al final de la incubación, transfiera las muestras a un portaobjetos del microscopio y use una aguja de tungsteno resistente para fijar un complejo ojo-cerebro a la diapositiva bajo un microscopio diseccionado.Luego, usa una aguja fina de tungsteno para cortar cada ojo lejos de su lóbulo óptico asociado y maniobrar cada ojo a la superficie del portaobjetos del microscopio de modo que la superficie basal del ojo esté adyacente a la diapositiva. A continuación, aplique un cubreobjetos limpio sobre las muestras y selle el cubreobjetos con esmalte de uñas. Para preparar el tejido ocular pupal para el análisis de manchas occidentales, primero diseccione 10 a 16 pupas como se demostró anteriormente en dos lotes, 10 a 15 minutos de diferencia en PBS complementado con inhibidores de la proteasa y fosfatasa.Después de enjuagar brevemente los complejos ocular-cerebro aislados dos veces en pozos individuales de un plato de vidrio de nueve pozos en hielo en 400 microlitros de PBS más inhibidores, transfiera todos los complejos ojo-cerebro en 400 microlitros de PBS helados más inhibidores decantados en un plato de disección negro limpio. Bajo un microscopio diseccionador limpio, usa una aguja de tungsteno resistente y una cuchilla de afeitar fina para cortar limpiamente cada ojo del lóbulo óptico, y usa una punta lubricada para transferir los complejos ojo-cerebro en cinco microlitros de PBS más inhibidores en un tubo de microcentrífuga de 500 microlitros sobre hielo. A continuación, agregue cinco microlitros de tampón de lisis de tejido occidental y 10 microlitros de tampón de muestra de proteína concentrada 2X al tubo.Para procesar los complejos ojo-cerebro para la extracción de ARN, usar guantes, limpiar la sobremesa, el microscopio, las herramientas de disección y los platos de disección negra con un reactivo de descontaminación de etanol y ARNA. Después de permitir que el área se seque, disecciona un total de 30 a 40 pupas en lotes de seis a ocho. Después de que cada lote de complejos ojo-cerebro se han diseccionado, transferir los complejos ojo-cerebro de la placa de nueve pozos en 400 microlitros de PBS fresco, helado, libre de nucasas en un plato de disección limpia, y utilizar una aguja de tungsteno resistente y una hoja de afeitar fina para cortar limpiamente cada ojo del lóbulo óptico.Cuando se hayan eliminado todos los ojos de un lote, transfiéralos a un tubo de microcentrífuga estéril sin RNase y congela las muestras en nitrógeno líquido antes de pasar al siguiente lote. El ojo pupal es un tejido de fácil acceso que sirve como un excelente modelo para investigar los procesos de desarrollo, incluyendo aquellos que impulsan la morfogénesis. Alrededor de 40 horas después de la formación del puparium, se logra la disposición final de las células.Esta es una edad ideal para evaluar las consecuencias de una mutación genética o expresión génica modificada. Por ejemplo, después de la expresión ectópica de Diap1, un inhibidor central de la apoptosis, el consiguiente aumento en el número de células de celosía se puede comparar con el observado en una retina de control. La apoptosis también se puede evaluar más directamente mediante la utilización de anticuerpos para activar una caspasa de la muerte-1 o mediante el uso de otros enfoques para detectar células moribundas.Los análisis de manchas occidentales de los litos oculares se pueden utilizar para determinar la presencia o expresión relativa de proteínas de interés o para comparar la expresión de proteínas en diferentes puntos de tiempo de desarrollo. Es importante tener en cuenta que diseccionar más de 60 ojos por genotipo o condición experimental es óptimo para aislar suficiente ARN de alta calidad. Lo más importante a recordar es que la retina pupal es extremadamente frágil, y se debe tener mucho cuidado durante su disección para asegurar su integridad.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

A gran escala de pez cebra embrionario del corazón Disección de Análisis transcripcional

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-proyección de imagen de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Ojo

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Aislamiento de células neurales madre / progenitoras de la región periventricular de la rata de Adultos y de la médula espinal humana

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Un método rápido y eficiente para disecar alas Pupal de Drosophila apto para Immunodetections o ensayos PCR

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

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Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

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Disección y la coloración de los ovarios Pupal de Drosophila

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

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Descongelación, cultivo y criopreservación de líneas de células de Drosophila

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

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Imágenes y análisis de la orientación del tejido y la dinámica del crecimiento en el desarrollo de la Drosophila Epithelia durante las etapas pupales

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

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Preparación de pruebas de larvas y pupales de Drosophila para el análisis de la división celular en vivo, tejido intacto

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...