Name: dissection of the drosophila pupal retina for immunohistochemistry, western analysis, and rna isolation
Uploaded: 2019-03-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation at JoVE.com

El yazması üzerinde Zack davul ve bizim yorumcular yararlı yorumlar için teşekkür ederiz. Bu eser R15GM114729 tarafından desteklenmiştir.

1. doku hazırlık
<ol><li>Drosophila kurmak haçlar (20daha önce açıklandığı gibi) veya istenen genotip pupa elde etmek için belirli Drosophila suşları kültür. Emin olmak için çok sayıda pupa rastlantısal ortaya, bu sinek kültürler içinde yinelenen besin açısından zengin gıda medya veya standart gıda medya cömertçe Maya-yapıştır ile desteklenmiş kurarsınız.</li>
	<li>25 ° C'de Drosophila kültürleri korumak UAS-GAL4 sistemi kullanan ha...

<ol>
	<li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+order+in+the+Drosophila+pupal+retina.">The emergence of order in the Drosophila pupal retina.</a> Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).</li><li>Wolff, T., Ready, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The development of Drosophila melanogaster. , 1277-1325 (1993).</li><li>Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye.">Pattern formation in the Drosophila eye.</a> Current opinion in genetics &amp; development. 17 (4), 309-313 (2007).</li><li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+an+ommatidium+one+cell+at+a+time.">Building an ommatidium one cell at a time.</a> Developmental Dynamics. 241 (1), 136-149 (2012).</li><li>Hayashi, T., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+mechanics+mediate+pattern+formation+in+the+developing+retina.">Surface mechanics mediate pattern formation in the developing retina.</a> Nature. 431, 647 (2004).</li><li>Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+Adhesion+Mediated+by+Hibris+and+Roughest+Regulates+Morphogenesis+and+Patterning+in+the+Drosophila+Eye.">Preferential Adhesion Mediated by Hibris and Roughest Regulates Morphogenesis and Patterning in the Drosophila Eye.</a> Developmental Cell. 8 (6), 925-935 (2016).</li><li>Cordero, J. B., Larson, D. E., Craig, C. R., Hays, R., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Decapentaplegic+signaling+regulates+patterning+and+adhesion+in+the+Drosophila+pupal+retina.">Dynamic Decapentaplegic signaling regulates patterning and adhesion in the Drosophila pupal retina.</a> Development (Cambridge, England). 134 (10), 1861-1871 (2007).</li><li>Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+behavior+in+the+developing+Drosophila+pupal+retina.">Cellular behavior in the developing Drosophila pupal retina.</a> Mechanisms of development. 125 (3-4), 223-232 (2008).</li><li>Mart&#237;n-Bermudo, M. D., Bardet, P. L., Bella&#239;che, Y., Malartre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vav+oncogene+antagonises+EGFR+signalling+and+regulates+adherens+junction+dynamics+during+Drosophila+eye+development.">The vav oncogene antagonises EGFR signalling and regulates adherens junction dynamics during Drosophila eye development.</a> Development. 142 (8), 1492-1501 (2015).</li><li>Chan, E. H., Chavadimane Shivakumar, P., Cl&#233;ment, R., Laugier, E., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+cortical+tension+mediated+by+N-cadherin+controls+cell+geometric+order+in+the+Drosophila+eye.">Patterned cortical tension mediated by N-cadherin controls cell geometric order in the Drosophila eye.</a> eLife. 6, e22796 (2017).</li><li>Lin, H. V., Rogulja, A., Cadigan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wingless+eliminates+ommatidia+from+the+edge+of+the+developing+eye+through+activation+of+apoptosis.">Wingless eliminates ommatidia from the edge of the developing eye through activation of apoptosis.</a> Development. 131 (10), 2409-2418 (2004).</li><li>Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+wingless+in+an+early+pupal+cell+death+event+that+contributes+to+patterning+the+Drosophila+eye.">A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye.</a> Mechanisms of development. 121 (12), 1523-1530 (2004).</li><li>Mendes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+c&#8208;d+regulates+developmental+apoptosis+in+the+Drosophila+retina.">Cytochrome c&#8208;d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina.</a> EMBO reports. 7 (9), 933-939 (2006).</li><li>Monserrate, J., Brachmann, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+death+zone:+a+spatially+restricted+region+for+programmed+cell+death+that+sculpts+the+fly+eye.">Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 14 (2), 209-217 (2007).</li><li>Bushnell, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JNK+is+antagonized+to+ensure+the+correct+number+of+interommatidial+cells+pattern+the+Drosophila+retina.">JNK is antagonized to ensure the correct number of interommatidial cells pattern the Drosophila retina.</a> Developmental Biology. 433 (1), 94-107 (2018).</li><li>Wolff, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+techniques+for+pupal+and+larval+Drosophila+eyes.">Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li><li>Hsiao, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+Immunohistochemistry+of+Larval,+Pupal+and+Adult+Drosophila+Retinas.">Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4347 (2012).</li><li>Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+Mounting+of+Drosophila+Pupal+Eye+Discs.">Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (93), e52315 (2014).</li><li>Johnson, R. I., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quantitative+Method+to+Analyze+Drosophila+Pupal+Eye+Patterning.">A Quantitative Method to Analyze Drosophila Pupal Eye Patterning.</a> PLoS ONE. 4 (9), e7008 (2009).</li><li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Ellis, M. C., O'Neill, E. M., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Drosophila+glass+protein+and+evidence+for+negative+regulation+of+its+activity+in+non-neuronal+cells+by+another+DNA-binding+protein.">Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein.</a> Development. 119 (3), 855-865 (1993).</li><li>Duffy, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+drosophila:+A+fly+geneticist's+swiss+army+knife.">GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife.</a> genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li><li>Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+broad+expression+profile+of+the+GMR-GAL4+driver+in+Drosophila+melanogaster.">A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster.</a> Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).</li><li>Song, Z., McCall, K., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCP-1,+a+Drosophila+Cell+Death+Protease+Essential+for+Development.">DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development.</a> Science. 275 (5299), 536-540 (1997).</li><li>Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+homologs+of+baculovirus+inhibitor+of+apoptosis+proteins+function+to+block+cell+death.">Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death.</a> Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).</li></ol>

Drosophila pupa göz diseksiyon burada açıklanan yöntemi 6-10 göz-beyin kompleksleri 10-15 dakika içinde yalıtım olanak sağlar. Ancak, sabır ve uygulama diseksiyonu tekniği master ve diseksiyonu hızını ve kalitesini geliştirmek için gereklidir. Bu kısa diseksiyon kez her gözün retina bir veri kümesindeki fenotip veya gen ifadesi değişkenliği azaltmak yaklaşık aynı gelişimsel sahne, sağlanır. Alternatif iletişim kuralları daha az pratik master için gerekli olabilir ederken, bizim il...

Drosophila retina pigment hücreleri bir petek kafes1,2,3,4' te düzenlenen çevrili yaklaşık 750 ommatidia oluşur. Her ommatidium sekiz photoreceptor nöronlar, dört lens salgılayan koni hücreleri ve iki birincil pigment hücreleri içerir. Her ommatidium çevreleyen pigment üreten kafes hücreleri ve duyusal kıl grupları vardır. Onun sonrası Mitotik doğa ve klişeleşmiş altıgen düzenleme nedeniyle, Drosophila pupa retina morfogenetik süreçleri hücre adezyon5,6de dahil olmak üzere çalışma için bir mükemmel model sistemi sağlar, 7,8,9,10 ve Apoptozis11,12,13,14,15.
Birkaç yayımlanmış protokol hava basıncı Drosophila pupa16,17,18--dan göz-beyin kompleksleri ayıklamak için kullanmak. Açıklanan protokol burada yerine mikrodiseksiyon araçlar için dikkatli bir şekilde kullanır ve tam olarak göz-beyin kompleksleri hasarsız retina doku elde etme amacı ile izole. Bu retina için kullanılmak üzere iseniz çok önemlidir morfolojik, protein veya gen ekspresyonu inceliyor retina hasar hücresel stres veya hücresel fenotip veya gen ifade değişiklik olabilir ölüm neden olabilir beri. Ayrıca, antrenmandan sonra 6-10 göz-beyin kompleksleri 10-15 dk, yaş ve gelişim aşaması disseke göz dokusunun değişkenlik minimize amacı kolaylaştırmak izole.
Fiksasyon, immunostaining ve aşağıda açıklanan bütün Dağı Protokolü floresan mikroskopi Drosophila gözleri hazırlanması için uygundur. Retina protein ilgi hedefleme antikorlar ile inkübe. Örneğin, antikorlar adherens junction bileşenlerine hücrelerinin apikal circumferences böylece hücre türü de dahil olmak üzere özellikleri, şekil ve düzenleme biçilen19olabilir görselleştirmek için yararlı olabilir. Fiksasyon önce gözleri onun yerine--dan Batı analiz için protein veya RNA qRT-PCR kullanımda veya RNA-sıralama çekme amacıyla beyin i ciddi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Adobe Photoshop</td>
			<td style="width:131px;">Adobe</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Image processing software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Bamboo splints, 6&#34;&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Ted Pella Inc</td>
			<td style="width:95px;">116</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Beta mercaptoethanol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">M3148</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Beta-glycerol phosphate</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">50020</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="90">
			<td height="90" style="height:91px;width:145px;">Black dissecting dish</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Blade holder</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">10053</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">A7906</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:131px;">Roche</td>
			<td style="width:95px;">4693132001</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Confocal microscope (Zeiss LSM 501)</td>
			<td style="width:131px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Diethyl Pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">40718</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Double-sided tape</td>
			<td style="width:131px;">3M</td>
			<td style="width:95px;">665</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:145px;">Drosophila food media, nutrient-rich&#160;</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">Drosophila food media, standard</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe.&#160; (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">E6758</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Fixative solution</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">4% formadehyde in PBS, pH 7.4.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope)</td>
			<td style="width:131px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">91150-20</td>
			<td style="width:285px;">Forceps should be sharpened frequently.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:131px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:95px;">28908</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Glass 9-well dishes&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:95px;">7220-85</td>
			<td style="width:285px;">Also known as 9-well dishes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Glass coverslips (22 x 22 mm)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:95px;">12-542-B</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:95px;">12-550-413</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Glass petri dish</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:95px;">3160-100BO</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Glycerol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">G5516</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Image Studio software version 5.2.5</td>
			<td style="width:131px;">LI-COR Biosciences</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Image processing software for quantitation of Western blots.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Laemmli sample buffer</td>
			<td style="width:131px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:95px;">161-0737</td>
			<td style="width:285px;">2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Lane marker reducing sample buffer&#160;</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:95px;">39000</td>
			<td style="width:285px;">5X concentrated protein sample buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Microcentrigure tubes&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Axygen</td>
			<td style="width:95px;">MCT-175-C</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Microdissection scissors&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">15000-03</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Microwell trays (72 x 10 &#181;L wells)</td>
			<td style="width:131px;">Nunc</td>
			<td style="width:95px;">438733</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Mounting media</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">N-propylgallate</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">P3130</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:145px;">Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">P5368</td>
			<td style="width:285px;">Prepare according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">PBT</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Pin holder</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">26016-12</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Primary antibody: goat anti-GAPDH</td>
			<td style="width:131px;">Imgenex</td>
			<td style="width:95px;">IMG-3073</td>
			<td style="width:285px;">For Western blotting. Used at 1:3000</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1</td>
			<td style="width:131px;">Cell signaling</td>
			<td style="width:95px;">9578S</td>
			<td style="width:285px;">For immunofluorescence. Used at 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Primary antibody: rat anti-DEcad</td>
			<td style="width:131px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:95px;">DCAD2</td>
			<td style="width:285px;">For immunofluorescence. Used at 1:20</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Primary antibody: rat anti-DEcad</td>
			<td style="width:131px;">DOI: 10.1006/dbio.1994.1287</td>
			<td style="width:95px;">DCAD1</td>
			<td style="width:285px;">&#160;Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Promega</td>
			<td style="width:95px;">Z6110</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">Rnase decontamination reagent (RNase Away)</td>
			<td style="width:131px;">Molecular BioProducts</td>
			<td style="width:95px;">7002</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">10050</td>
			<td style="width:285px;">Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">Secondary antibody: 488-conjugated&#160; donkey anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:131px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:95px;">712-545-153</td>
			<td style="width:285px;">For immunofluorescence. Used at 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:131px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:95px;">111-165-144</td>
			<td style="width:285px;">For immunofluorescence. Used at 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:131px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:95px;">7077</td>
			<td style="width:285px;">For Western blotting. Used at 1:3000</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:85px;width:145px;">Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:131px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:95px;">305-035-003</td>
			<td style="width:285px;">For Western blotting. Used at 1:3000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">S3014</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Sodium Fluoride</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">215309</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Sodium vanadate</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">50860</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Spectrophotometer (NanoDrop)</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:95px;">2000c&#160;</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:145px;">Stereo dissecting microscope (M60 or M80)</td>
			<td style="width:131px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">or similar microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Sylgard (black)</td>
			<td style="width:131px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:95px;">SYLG170</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Sylgard (transparent)</td>
			<td style="width:131px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:95px;">SYLG184</td>
			<td style="width:285px;">Color black with finely ground charcol powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Tissue: Kimwipes</td>
			<td style="width:131px;">KIMTECH</td>
			<td style="width:95px;">34120</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">TritonX</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">T8787</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Trizma hydrochloride pH7.5</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">T5941</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Tungsten needle, fine</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">10130-10</td>
			<td style="width:285px;">Insert into pin holder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:145px;">Tungsten needle, sturdy</td>
			<td style="width:131px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:95px;">10130-20</td>
			<td style="width:285px;">Insert into pin holder</td>
		</tr>
		<tr height="130">
			<td height="130" style="height:130px;width:145px;">WTLB (western tissue lysis buffer)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution.</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:145px;">Yeast paste</td>
			<td style="width:131px;">(local supermarket)</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:285px;">Approximately 2 tablespoons Fleischmann&#39;s ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of the drosophila pupal retina for immunohistochemistry, western analysis, and rna isolation

Drosophila pupa retina bir mükemmel model sistemi geliştirme sırasında morfogenetik işlemler çalışma için sağlar. Bu yazıda, biz hassas Drosophila pupa retina diseksiyon için güvenilir bir iletişim kuralı mevcut. Bizim cerrahi yaklaşım pupa açmak ve tam olarak ayıklayın göz-beyin kompleksleri için gönüllülük elde edilebilir mikrodiseksiyon araçları kullanır. Bunlar sabit, immünhistokimya ve retina tabi o zaman mikroskop slaytlar monte edilebilir ve hedef hücre veya hücre altı yapıları algılamak için ise görüntüsü. Alternatif olarak, sabitlenmemiş retina olabilir beyin dokusundan izole, uygun arabellekleri lysed ve (protein veya gen ifadesi, sırasıyla değerlendirmek) protein Jel Elektroforez veya mRNA çıkarma için kullanılmaktadır. Önemli uygulama ve sabır açıklanan mikrodiseksiyon Protokolü master için gerekli olabilir, ama hakim sonra protokol çoğunlukla hasarsız retina nispeten hızlı yalıtım sağlar.

Pupa göz gelişimsel süreçleri araştırmak için mükemmel bir model hizmet veren bu sürücü morfogenez kolayca erişilebilir bir dokudur. Burada, retina disseke ve ayirt apikal adherens kavşaklar (şekil 3A, C) veya apoptosis (şekil 3)25sırasında aktif Dcp-1 caspase (şekil 3D) algılamak için kullanılan. Bu yaklaşımlar açıkça işe alım ve morfogenetik Primer hücre (dan 18...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation at JoVE.com

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Bu kağıt doku immünhistokimya, Batı analiz ve RNA-ekstraksiyon için işlenmesi için protokolleri ile birlikte Drosophila pupa retina dissekan için cerrahi bir yöntem sunuyor.

Drosophila pupa Retina diseksiyon immünhistokimya, Batı analiz ve RNA izolasyon için

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Bu çoklu downstream uygulamaları için Drosophila pupal göz dokusunun izolasyonu için etkili bir yöntem olduğu için bu protokol önemlidir. Bu tekniğin en büyük avantajı doku zarar vermeden pupal gözlerin çok sayıda hızlı diseksiyon sağlar olmasıdır. Drosophila pupal retina diseksiyon acemiler için zor olacak.Tekniği uygulamak, diseksiyonlarin hızını ve sonuçların kalitesini artırmanın en iyi yoludur. Drosophila pupasını siyah bir kesiştaba yerleştirdikten sonra, mezhebin üzerine yeni bir çift taraflı bant yerleştirin, pupadan uzak, ve pupa dorsal tarafını dikkatlice bandın üzerine yerleştirmek için bir çift çifenlik kullanın. Bir stereo mikroskop altında çanak yerleştirin ve her pupa operkülkaldırmak için çerofma kullanın.Her pupal durumda dilim mikrodiseksiyon makas kullanın, baş ortaya çıkarmak için açık flapped izin, toraks, ve ön karın segmenti, ve çift taraflı bant pupal durumda kenarları güvenli. Her pupanın karnını keskin bir şekilde delin ve pupal kılıfından pupayı çıkarın. Pupayı teypten uzakta, diseksiyonu tablanın üzerine yerleştirin ve 400 mikrolitre buz gibi PBS ile pupayı kapatın.Karın tarafından her birini kavramak için forceps kullanın ve toraks ile temiz bir kesit kesit yapmak için mikrodiseksiyon makas kullanın, ikiye pupa kesme. İnce forceps iki çift kullanarak, her toraks epitel kesme kenarları kavramak ve yavaş yavaş göğüs ve baş kapsülü açık gözyaşı, göz-beyin kompleksi ve çevresindeki yağ dokusu açığa. Sonra, doku kavramadan, her yarı saydam, off-beyaz, dumbbell şeklinde göz-beyin kompleksi rehberlik etmek için forceps kullanın, uzak baş kapsülünün kalıntılarından.Altı ila 10 pupa inceledikten sonra, yaklaşık bir milimetre çapında temiz bir jilet ile bir mikropipet ucu kesti ve PBS ve yağ karışımı ile ucu yağlayın. Göz-beyin komplekslerini buz üzerinde 400 mikrolitre PBS içeren dokuz kuyulu cam bir cam çanağa aktarmak için yağlanmış pipet ucunu kullanın ve sonra 20 mikrolitre PBS'deki dokuyu 35 dakikalık bir kuluçka için en az 250 mikrolitre fiksatife aktarın. Fiksasyon sonunda, buz üzerinde beş ila 10 dakika boyunca taze PBS 400 mikrolitre içeren üçüncü bir kuyuya doku aktarmak için aynı pipet ucu kullanın.Spesifik olmayan antikor bağlanmasını engellemek için, göz-beyin komplekslerini 400 mikrolitre PBS artı Triton X'e aktarın ve buz üzerinde 10 ila 60 dakikalık bir kuluçka için. Kuluçka sonunda, aliquot 10 mikrolitre birincil antikor solüsyonunun 10 mikrolitresi 72 kuyulu bir mikrokuyunun gerekli sayıdaki kuyularına ve PBS artı Triton X ile yağlanmış modifiye edilmiş 0,5 milimetrelik bir ucu olan P10 hava deplasmanlı mikropipetkullanarak en fazla beş göz-beyin kompleksi ve en fazla üç mikrolitre PBS PBS'i antikor çözeltisine aktarın. Dört santigrat derecede bir gece kuluçka sonra, yıkama başına beş ila 10 dakika için dokuz kuyulu cam çanak bir kuyuda PBS artı Triton X 400 mikrolitre örnekleri iki kez yıkayın.Üçüncü yıkamadan sonra, doku yutun oda sıcaklığında iki saat boyunca uygun bir ikincil antikor çözeltisi 100 mikrolitre içine aktarın, ışıktan korunan, PBS ve Triton X 400 mikrolitre üç beş ila 10 dakikalık yıkar ve PBS bir yıkama aşağıdaki. Daha sonra, 1-2 saat boyunca montaj ortamı 200 mikrolitre örnekleri dengeleyin. Kuluçka sonunda, bir mikroskop slayt örnekleri aktarın ve bir diseksiyon mikroskop altında slayt bir göz-beyin kompleksi pin sağlam bir tungsten iğne kullanın.Daha sonra, her gözü ilişkili optik lobundan uzaklaştırmak ve her gözü mikroskop slaytının yüzeyine çıkarmak için ince bir tungsten iğnesi kullanın, böylece gözün bazal yüzeyi slayta bitişiktir. Daha sonra, örneklerin üzerine temiz bir coverslip uygulayın ve oje ile coverslip mühür. Batı leke analizi için pupal göz dokusu hazırlamak için, ilk diseksiyon 10-16 pupa daha önce iki toplu olarak gösterildiği gibi, PBS 10 ila 15 dakika arayla proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile birlikte.PBS artı inhibitörlerin 400 mikrolitre buz üzerinde dokuz kuyucam çanak bireysel kuyularda izole göz-beyin kompleksleri iki kez durulama sonra, buz gibi PBS ve inhibitörleri 400 mikrolitre içine tüm göz-beyin kompleksleri transfer temiz bir siyah diseksiyon çanak üzerine decanted. Temiz bir diseksiyon mikroskobu altında, optik lobdan her gözü temiz bir şekilde kesmek için sağlam bir tungsten iğnesi ve ince bir jilet kullanın ve göz-beyin komplekslerini beş mikrolitre PBS artı inhibitörleri buzüzerinde 500 mikrolitrelik mikrosentrifuge tüpüne aktarmak için yağlanmış bir uç kullanın. Daha sonra, tüp e batı doku lysis tampon beş mikrolitre ve 2X konsantre protein örnek tampon 10 mikrolitre ekleyin.RNA ekstraksiyonu için göz-beyin komplekslerini işlemek için, eldiven takmak, tezgahüstü, mikroskopu, diseksiyon araçlarını ve %70 etanol ve RNase dekontaminasyon reaktifi ile siyah diseksiyon yemeklerini temizleyin. Bölgenin kurumasını sağladıktan sonra, toplam 30 ila 40 pupanın 6 ila 8'li gruplar halinde incelenmesi. Göz-beyin kompleksleri her toplu kesildikten sonra, temiz bir kesme çanak taze, buz gibi, nükleaz içermeyen PBS 400 mikrolitre içine dokuz iyi çanak göz-beyin kompleksleri aktarın ve temiz bir inceleme çanak sağlam bir tungsten iğne ve ince bir jilet kullanın temiz optik lob her göz kesmek için.Bir toplu iş için tüm gözler çıkarıldığında, steril, RNase içermeyen mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve numuneleri bir sonraki toplu işleme geçmeden önce sıvı nitrojenle flaş dondurun. Pupal göz gelişimsel süreçleri araştırmak için mükemmel bir model olarak hizmet veren kolay erişilebilir bir dokudur, bu sürücü morfogenez de dahil olmak üzere. Puparium oluşumundan yaklaşık 40 saat sonra hücrelerin son düzenlemesi sağlanır.Bu, genetik mutasyonun veya modifiye gen ekspresyonunun sonuçlarını değerlendirmek için ideal bir yaştır. Örneğin, apoptozun bir çekirdek inhibitörü olan Diap1'in ektopik ekspresyonu sonrasında, kafes hücrelerinin sayısındaki artış, kontrol retinasında gözlenenle karşılaştırılabilir. Apoptoz da bir ölüm kaspase-1 etkinleştirmek için antikorlar kullanılarak ya da ölmekte olan hücreleri tespit etmek için diğer yaklaşımlar kullanılarak daha doğrudan değerlendirilebilir.Göz lysatlarının batı lı blot analizleri, ilgi çeken proteinlerin varlığını veya göreceli ekspresyonunu belirlemek veya farklı gelişimsel zaman noktalarında protein ekspresyonunu karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu genotip veya deneysel durum başına 60'tan fazla göz diseksiyon yeterli yüksek kaliteli RNA izole etmek için en uygun olduğunu unutmayın. Hatırlanması gereken en önemli şey pupal retina son derece kırılgan olduğunu, ve bütünlüğünü sağlamak için diseksiyon sırasında büyük özen alınmalıdır.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Transkripsiyonal Analiz Büyük ölçekli Zebra balığı Embriyonik Kalp Diseksiyon

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Canlı-görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Periventriküler Yetişkin Rat Bölgesinde ve İnsan Omurilik gelen Nöral Kök / Progenitör Hücreler izolasyonu

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Drosophila Immunodetections veya PCR deneyleri için uygun pupa Wings incelemek için hızlı ve etkili bir yöntem

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Bağdaşık süper çözünürlük ve elektron mikroskobu Zebra balığı Retina Protein yerelleşme gidermek için

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Diseksiyon ve Drosophila pupa yumurtalık boyama

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Çözdürme, kültür ve Drosophila hücre hatları Cryopreserving

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Pupal Evrelerinde Gelişen Drosophila Epitelinde Doku Oryantasyonu ve Büyüme Dinamiğinin Görüntülenmesi ve Analizi

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Drosophila Larval ve Pupal Testislerinin Canlı, Sağlam Dokuda Hücre Bölünmesi Analizi İçin Hazırlanması

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...