Name: studying oxidative stress caused by the mitis group streptococci in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-03-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Vi takker Dr. Bing-Yan Wang, Dr. Gena Tribble (The University of Texas, Tandlægeskolen), Dr. Richard Lamont (University of Louisville, Tandlægeskolen), og Dr. Samuel Shelburne (MD Anderson Cancer Center) for at give laboratorie- og klinisk stammer af mitis gruppe streptokokker. Vi takker også Dr. Keith Blackwell (Institut for genetik, Harvard Medical School) for C. elegans stammer. Endelig, vi takker Dr. Danielle Garsin og hendes lab (The University of Texas, McGovern Medical School) for at give reagenser og ormen stammer til at gennemføre undersøgelsen. Nogle orm stammer blev leveret af CGC-udvalg, som er finansieret af NIH Office for forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440).

1. forberedelse af THY (Todd-Hewitt gærekstrakt) Agar plader
<ol><li>1 L medier, tilføje 30 g af Todd-Hewitt pulver, 2 g af gærekstrakt og 20 g agar til en 2 L erlenmeyerkolben. 970 mL deioniseret vand tilsættes til kolbens indhold og omfatter en røre bar. Autoklave medier ved en temperatur på 121 ° C og tryk på 15 lb/tommer2 til 30 min. Derefter indstille medierne på en røre pladen og mulighed for køling med blid omrøring.</li>
	<li>Hæld medierne i passende størrelse sterile petriskåle (100 m...

<ol>
	<li>Human Microbiome Project, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+diversity+of+the+healthy+human+microbiome.">Structure, function and diversity of the healthy human microbiome.</a> Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).</li><li>Mitchell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+mitis:+walking+the+line+between+commensalism+and+pathogenesis.">Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis.</a> Molecular Oral Microbiology. 26 (2), 89-98 (2011).</li><li>Dyson, C., Barnes, R. A., Harrison, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infective+endocarditis:+an+epidemiological+review+of+128+episodes.">Infective endocarditis: an epidemiological review of 128 episodes.</a> Journal of Infection. 38 (2), 87-93 (1999).</li><li>Sahasrabhojane, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-level+assessment+of+the+molecular+basis+of+fluoroquinolone+resistance+among+viridans+group+streptococci+causing+bacteraemia+in+cancer+patients.">Species-level assessment of the molecular basis of fluoroquinolone resistance among viridans group streptococci causing bacteraemia in cancer patients.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 43 (6), 558-562 (2014).</li><li>Shelburne, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+mitis+strains+causing+severe+clinical+disease+in+cancer+patients.">Streptococcus mitis strains causing severe clinical disease in cancer patients.</a> Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 762-771 (2014).</li><li>van der Meer, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution,+antibiotic+susceptibility+and+tolerance+of+bacterial+isolates+in+culture-positive+cases+of+endocarditis+in+The+Netherlands.">Distribution, antibiotic susceptibility and tolerance of bacterial isolates in culture-positive cases of endocarditis in The Netherlands.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 10 (9), 728-734 (1991).</li><li>Han, X. Y., Kamana, M., Rolston, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viridans+streptococci+isolated+by+culture+from+blood+of+cancer+patients:+clinical+and+microbiologic+analysis+of+50+cases.">Viridans streptococci isolated by culture from blood of cancer patients: clinical and microbiologic analysis of 50 cases.</a> Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 160-165 (2006).</li><li>Hoshino, T., Fujiwara, T., Kilian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+phylogenetic+and+phenotypic+analyses+to+identify+nonhemolytic+streptococci+isolated+from+bacteremic+patients.">Use of phylogenetic and phenotypic analyses to identify nonhemolytic streptococci isolated from bacteremic patients.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (12), 6073-6085 (2005).</li><li>Kohno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+complications+in+patients+receiving+autologous+CD34-selected+hematopoietic+stem+cell+transplantation+for+severe+autoimmune+diseases.">Infectious complications in patients receiving autologous CD34-selected hematopoietic stem cell transplantation for severe autoimmune diseases.</a> Transplant Infectious Disease. 11 (4), 318-323 (2009).</li><li>Zhu, L., Kreth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+hydrogen+peroxide+in+environmental+adaptation+of+oral+microbial+communities.">The role of hydrogen peroxide in environmental adaptation of oral microbial communities.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 717843 (2012).</li><li>Okahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+contributes+to+the+epithelial+cell+death+induced+by+the+oral+mitis+group+of+streptococci.">Hydrogen peroxide contributes to the epithelial cell death induced by the oral mitis group of streptococci.</a> PLoS One. 9 (1), 88136 (2014).</li><li>Stinson, M. W., Alder, S., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+and+killing+of+human+endothelial+cells+by+viridans+group+streptococci.">Invasion and killing of human endothelial cells by viridans group streptococci.</a> Infection and Immunity. 71 (5), 2365-2372 (2003).</li><li>Rai, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pneumoniae+secretes+hydrogen+peroxide+leading+to+DNA+damage+and+apoptosis+in+lung+cells.">Streptococcus pneumoniae secretes hydrogen peroxide leading to DNA damage and apoptosis in lung cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (26), 3421-3430 (2015).</li><li>Braun, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumococcal+pneumolysin+and+H(2)O(2)+mediate+brain+cell+apoptosis+during+meningitis.">Pneumococcal pneumolysin and H(2)O(2) mediate brain cell apoptosis during meningitis.</a> Journal of Clinical Investigation. 109 (2), 19-27 (2002).</li><li>Naji, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activation+of+the+oxidative+stress+response+transcription+factor+SKN-1+in+Caenorhabditis+elegans+by+mitis+group+streptococci.">The activation of the oxidative stress response transcription factor SKN-1 in Caenorhabditis elegans by mitis group streptococci.</a> PLoS One. 13 (8), 0202233 (2018).</li><li>Bolm, M., Jansen, W. T., Schnabel, R., Chhatwal, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide-mediated+killing+of+Caenorhabditis+elegans:+a+common+feature+of+different+streptococcal+species.">Hydrogen peroxide-mediated killing of Caenorhabditis elegans: a common feature of different streptococcal species.</a> Infection and Immunity. 72 (2), 1192-1194 (2004).</li><li>Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+worm+has+turned--microbial+virulence+modeled+in+Caenorhabditis+elegans.">The worm has turned--microbial virulence modeled in Caenorhabditis elegans.</a> Trends in Microbiology. 13 (3), 119-127 (2005).</li><li>Irazoqui, J. E., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=99th+Dahlem+conference+on+infection,+inflammation+and+chronic+inflammatory+disorders:+Caenorhabditis+elegans+as+a+model+to+study+tissues+involved+in+host+immunity+and+microbial+pathogenesis.">99th Dahlem conference on infection, inflammation and chronic inflammatory disorders: Caenorhabditis elegans as a model to study tissues involved in host immunity and microbial pathogenesis.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 160 (1), 48-57 (2010).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+and+Aging+in+Caenorhabditis+elegans:+Causal+or+Casual+Relationship.">Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 13 (12), 1911-1953 (2010).</li><li>Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+C.+elegans+for+aging+research.">Using C. elegans for aging research.</a> Invertebrate Reproduction &amp; Development. 59, 59-63 (2015).</li><li>Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKN-1/Nrf,+stress+responses,+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 88, 290-301 (2015).</li><li>Irazoqui, J. E., Urbach, J. M., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+host+innate+defence:+insights+from+Caenorhabditis+elegans+and+primitive+invertebrates.">Evolution of host innate defence: insights from Caenorhabditis elegans and primitive invertebrates.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (1), 47-58 (2010).</li><li>Park, S. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+as+mediated+by+SKN-1.">Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1.</a> Aging Cell. 8 (3), 258-269 (2009).</li><li>An, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Caenorhabditis+elegans+oxidative+stress+defense+protein+SKN-1+by+glycogen+synthase+kinase-3.">Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).</li><li>An, J. H., Blackwell, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKN-1+links+C.+elegans+mesendodermal+specification+to+a+conserved+oxidative+stress+response.">SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response.</a> Genes &amp; Development. 17 (15), 1882-1893 (2003).</li><li>Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+of+hydrogen+peroxide+produced+by+Enterococcus+faecium.">Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium.</a> Infection and Immunity. 72 (8), 4512-4520 (2004).</li><li>Pincus, Z., Mazer, T. C., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+as+a+measure+of+senescence+in+C.+elegans:+look+to+red,+not+blue+or+green.">Autofluorescence as a measure of senescence in C. elegans: look to red, not blue or green.</a> Aging (Albany NY). 8 (5), 889-898 (2016).</li><li>Teuscher, A. C., Ewald, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+Autofluorescence+to+Assess+GFP+Expression+During+Normal+Physiology+and+Aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Overcoming Autofluorescence to Assess GFP Expression During Normal Physiology and Aging in Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 8 (14), (2018).</li></ol>

De beskrevne metoder kan bruges til andre patogene bakterier såsom Enterococcus faecium, som også producerer H2O2 dyrkes under anaerob eller microaerophilic betingelser26. Typisk for de fleste sygdomsfremkaldende organismer tager det flere dage til uger at gennemføre overlevelse assays. Den robuste produktion af H2O2 af medlemmer af gruppen mitis, kunne disse assays afsluttes inden for 5-6 h under de beskrevne betingelser. Dette sikrer evnen ...

Mitis gruppe streptokokker er menneskelige latente i svælg cavity1. Men, disse organismer kan undslippe denne niche og forårsage en række invasive sygdomme2. Infektioner forårsaget af disse mikroorganismer omfatter bakteriæmi, endocarditis, og orbital cellulitis2,3,4,5,6. Desuden, de dukker op som agenser af infektioner i blodet i immunkompromitterede, neutropeni, og kræftpatienter, der har undergået kemoterapi5,7,8,9 .
Mekanismerne underliggende mitis gruppe patogenesen er uklare, fordi få virulens faktorer er blevet identificeret. Gruppen mitis er kendt for at producere H2O2, som har vist sig for at spille en vigtig rolle i mundtlig mikrobielle samfund10. For nylig, flere undersøgelser har fremhævet en rolle for H2O2 som en cytotoxin, der inducerer epitelcelle død11,12. S. lungebetændelse, der tilhører denne gruppe, har vist sig at producere høje niveauer af H2O2 der inducerer DNA-skader og apoptose i alveolær celler13. Ved hjælp af en akut lungebetændelse dyremodel, vist de samme forskere, at produktionen af H2O2 af bakterier giver en virulens fordel. Undersøgelser på pneumokok-meningitis har også vist, at patogenet-afledte H2O2 virker synergistisk med pneumolysin til at udløse neuronal celle død14. Disse observationer fastsætter klart, at H2O2 produceret af denne gruppe af bakterier er vigtig for deres sygdomsfremkaldende evne.
Interessant, har det også vist sig at medlemmer af mitis gruppe S. mitis og S. oralis medføre døden af den ødelægge C. elegans via produktion af H2O215,16. Denne fritlevende nematode har været brugt som en enkel, genetisk tractable model til at studere mange biologiske processer. Mere nylig, ormen er opstået som en model til at studere vært-patogen interaktioner17,18. Derudover har flere undersøgelser fremhævet vigtigheden af at studere oxidativt stress ved hjælp af denne organisme19,20,21. Dens korte livscyklus, evne til knockdown gener af interesse af RNAi og brug af grønne fluorescerende proteiner (NGL)-sammensmeltet reportere til overvågning af genekspression er nogle af de attributter, der gør det til en attraktiv modelsystem. Endnu vigtigere, er de veje, der regulerer oxidativ stress og medfødt immunitet i ormen meget bevaret med pattedyr20,22.
I denne protokol, er det vist hvordan C. elegans til at belyse patogenicitet forårsaget af streptokok-afledte H2O2. En modificeret overlevelse assay er vist, og medlemmer af gruppen mitis er i stand til at dræbe ormene hurtigt via produktion af H2O2. Ved hjælp af medlemmer af gruppen mitis, en vedvarende biologisk kilde af reaktive ilt arter er (ROS) fastsat, i modsætning til kemiske kilder, der inducerer oxidativt stress i worms. Endvidere, bakterier er at kolonisere orme hurtigt, hvilket gør til H2O2 rettes direkte til tarmens celler (sammenlignet med andre kilder, der er nødt til at krydse flere barrierer). Analysen er valideret, enten 1) ved fastsættelsen overlevelse af skn-1 mutant stamme eller 2) ved at banke ned skn-1 ved hjælp af RNAi i orme i forhold til N2 vildtype og vektor kontrol behandles orme. SKN-1 er en vigtige transkriptionsfaktor, der regulerer oxidative stressrespons i C. elegans23,24,25. Ud over overlevelsen assays bruges en orm stamme at udtrykke en SKN-1B/C::GFP transgene reporter til at overvåge aktivering af oxidative stress respons via produktion af H2O2 af gruppen mitis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:845px;" width="845">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Media and chemicals</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Bacto peptone&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0118-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Bacto Todd Hewitt Broth</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0492-17-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD BBL Sheep Blood, Defibrinated&#160;&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B11947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Difco Agar&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0145-17-0</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Difco LB Broth</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0446-17-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blood agar (TSA with Sheep Blood)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R01200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Carbenicillin</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP26481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Catalase&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C1345-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ICN10138201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">IPTG</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MP21021012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Nystatin</td>
			<td style="width:179px;">Acros organics</td>
			<td style="width:119px;">AC455500050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium chloride&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SS266-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">8.25% Sodium Hypochlorite</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Streptomycin Sulfate&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP910-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Tetracyclin</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">87128-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">(&#8722;)-Tetramisole hydrochloride</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L9756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1422-500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Consumables&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-565-269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 x 10 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">No. 1.5&#160; 18 mm X 18 mm Cover Slips</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-541A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-544-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Software&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Prism</td>
			<td style="width:179px;">Graphpad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Bacterial Strains</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. oralis ATCC 35037</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. mitis ATCC 49456</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. gordonii DL1 Challis&#160;&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">E. coli OP50</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">E. coli HT115</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Worm Strains</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Strain</td>
			<td style="width:179px;">Genotype</td>
			<td style="width:119px;">Transgene</td>
			<td>Source</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">N2</td>
			<td style="width:179px;">C. elegans wild isolate</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">EU1</td>
			<td style="width:179px;">skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">LD002</td>
			<td style="width:179px;">IdIs1</td>
			<td style="width:119px;">SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)</td>
			<td>Keith Blackwell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying oxidative stress caused by the mitis group streptococci in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), en fritlevende nematode, fremstod som en attraktiv model til at studere vært-patogen interaktioner. Den præsenterede protokol bruger denne model til at bestemme patogenicitet forårsaget af mitis gruppe streptokokker via produktion af H2O2. Mitis gruppe streptokokker er en spirende trussel, der forårsager mange menneskelige sygdomme såsom bakteriæmi, endocarditis, og orbital cellulitis. Beskrevet her er en protokol til at bestemme overlevelse af disse orme som svar på H2O2 produceret af denne gruppe af patogener. Ved at bruge gen skn-1 kodning for en oxidativ stress reaktion transskription faktor, er det vist, at denne model er vigtige for at identificere vært gener, der er væsentlige mod streptokok infektion. Desuden er det vist, at aktivering af oxidative stressrespons kan overvåges i nærværelse af disse patogener ved hjælp af en transgene reporter orm stamme, hvor SKN-1 er sammenvokset til grøn fluorescerende proteiner (NGL). Disse assays giver mulighed for at studere oxidative stress reaktionen på H2O2 afledt af en biologisk kilde i modsætning til eksogent tilføjet reaktive ilt arter (ROS) kilder.

Medlemmer af mitis gruppe S. mitis, S. oralis, og S. gordonii hurtigt dræbt orme, i modsætning til S. mutans, S. salivarius, og ikke-sygdomsfremkaldende E. coli OP50 (fig. 3A). Den mediane overlevelse for S. mitis, S. oralis, og S. gordonii var 300 min, 300 min. og 345 min, henholdsvis. For at bestemme, hvis drab blev formidlet af H2O2, bl...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Nematode Caenorhabditis elegans er en fremragende model for dissekere vært-patogen interaktioner. Beskrevet her er en protokol til at inficere orm med medlemmer af mitis gruppe streptokokker og bestemme aktivering af oxidative stress reaktion mod H2O2 produceret af denne gruppe af organismer.

At studere Oxidative Stress forårsaget af Mitis gruppe streptokokker i Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

I denne protokol demonstrerer vi, hvordan man bruger en fri levende metode c. elegans til at belyse den patogenicitet forårsaget af hydrogenperoxid produceret via Mitis Group streptococci. Den største fordel ved denne teknik er, at vi kan studere patogenicitet og aktivering af stress reaktioner i ormen ved hjælp af en bæredygtig biologisk kilde til reaktive ilt arter i modsætning til kemiske kilder For en liter medier tilføje 30g todd Hewitt pulver, 2g gær ekstrakt og 20g ager til en 2 liter Erlin Myer kolbe.Der tilsættes 970 ml deioniseret vand til kolbens indhold, og der sættes rørest i en rørestang. Brug aluminiumsfolie til at dække åbningen. Autoklave medierne i kolben ved en temperatur på 121 grader Celsius og tryk på 15 pounds per kvadrattomme i 30 minutter.Derefter indstilles kolben på en røreplade for at køle af med let omrøring. Under en laminar hætte, hæld medierne i passende størrelse, sterile petriskåle. Lad mediet tørre i 2 timer.Derefter opbevares pladerne ved 4 grader Celsius i op til 1 måned. Før fremstilling af Mitis Group streptococci, varm THY agar plader i en inkubator til 37 grader Celsius. Efter at bruge en steril løkke til at stribe ud ønskede stammer af strepticocci på de steder.Derefter sætte pladerne i et stearinlys krukke og inkubere krukken ved 37 grader Celsius natten over i omkring 18 timer for at give en mikroerofil miljø. Den næste dag, fjerne pladerne fra stearinlys krukken og bruge en steril løkke til at plukke isolerede kolonier. Inokuler 15 ml sterile koniske rør indeholdende 2 ml THY bouillon.Luk hætterne stramt og inkubere rørene ved 37 grader Celsius under statiske forhold. Forvarpiske THY-plader i en inkubator til 37 grader Celsius tilsættes 50 mikroliter opløsning, der indeholder 1000 enheder katalase, på THY-pladen. Brug en steril spreder til at sprede katalaseopløsningen og lad pladerne tørre på laminarflowhætten i 30 minutter.For at frø pladerne med streptokokker stammer, skal du bruge en pipette til at tilføje 80 mikroliter af natten dyrkede kulturer til pladen og bruge en steril spreder til at sprede bakterierne helt over agar overfladen. Inkuber pladerne ved 37 grader Celsius i en stearinlyskrukke natten over. Som en kontrol, på to NGM plader, tilsættes 80 mikroliter af natten dyrkede kulturer af E.coli OP-50 til såning.Inkuber pladerne ved 37 grader Celsius natten over. Den næste dag, fjerne pladerne fra stearinlys krukken og lad pladerne afkøle til stuetemperatur. Ved hjælp af en steril orm pick, overføre 30 L4 larver fra NGM fodring plader til streptokokker seedede THY plader.Inkuber pladerne ved 25 grader Celsius. Under et dissekerende mikroskop tælles antallet af levende og døde L4-larver på hver plade på flere tidspunkter. Brug den sterile orm pick til forsigtigt prod ormene og afgøre, om de er døde eller levende.I første omgang score ormene som døde eller leve hver 30 minutter. Når orme hurtigt begynder at dø, score dem med 15 minutters mellemrum. Analysen vil tage 5 til 6 timer at fuldføre.Derefter gentages eksperimentet to gange mere. For at forberede agarose pad, stick labtape på langs langs to glas dias. Dette vil bestemme tykkelsen af agarose puder.Placer en ren glasrutsjebane mellem de to tapede dias. Opløs agarose i deioniseret vand for at gøre 2 vægt volumen procent og varme opløsningen i en mikrobølgeovn. Brug en pipette til at placere 100 mikroliter smeltet agarose på midten af den rene rutsjebane.Placer straks en anden ren glas slide på toppen af den smeltede agarose og tryk forsigtigt ned for at lave en pude. Lad agarosen størkne og derefter fjerne det øverste dias. Agarosepuden er klar til brug.Forvarsyd THY plader til 37 grader Celsius. Frø pladerne med en streptokokker stammer som gjort tidligere i overlevelse assays. Seed 3 NGM plader med E-coli OP-50 som kontrol og inkubere ved 37 grader Celsius natten over.Den næste dag, afkøles pladerne til stuetemperatur. Brug M9W buffer til at vaske L4 larver fra NGM eller NGM RNAi foderplader i 15 ml koniske rør. Drej rørene ved 450 gange g i et minut i en centrifuge.Supernatanten dekanteres, og der tilsættes 10 ml M9W til hvert rør. Gentag centrifugaltrinnet tre gange mere. Re-suspendere orme i 250 mikroliter af M9W og placere tre 5 mikroliter dråber af ormen suspension på en ren Petriskål låg.Under et dissekerende mikroskop skal du anslå antallet af orme pr. mikroliter. Ved hjælp af en pipette tilsættes ca. 100 L4 larver til hver THY streptokokkerede og NGM E.coli-seedede plader. Brug tre plader pr stamme af bakterier.Inkuber pladerne i 2 til 3 timer ved 25 grader Celsius. Fjern derefter pladerne fra inkubatoren. Vask dem med M9W og indsamle orme i 15ml koniske rør.Vask ormene tre gange som tidligere i centrifugaltrinnet. Fjern det meste af M9W ved aspiration. Og tilsæt 500 mikroliter M9W indeholdende 2 millimolar natrium azide eller tetramisole hydrochlorid til ormen pellet for anæstesi.Inkuber røret med ormepiller ved stuetemperatur i 15 minutter. Derefter drop 15 mikroliter af ormen suspension på en forberedt agorose pad. Under et fluorescerende mikroskop visualiser du lokaliseringen af skn-1 ved hjælp af Fitzy- og Dappy-filtre.Billedorme ved 10 gange og 20 gange forstørrelser. Spræst ormene baseret på tre lokaliseringsniveauer;lav lokalisering, hvor der ikke observeres nuklear lokalisering, mellem lokalisering med SKN 1 BCGFP i ormens forreste eller bageste del og høj lokalisering, hvor nuklear lokalisering af skn-1 BCGFP observeres i alle tarmceller. I dette eksperiment dræbte medlemmer af Mitis-gruppen hurtigt ormene i modsætning til S.mutans, S.salivarius og non patogen e.coli OP-50.Når katalase blev suppleret til THY ager, drabet på ormene blev afskaffet. Ormenes død blev ikke observeret på delta spxB mutant stamme sammenlignet med vildtype og komplimentstammer. Disse data tyder på, at hydrogenperoxid produceret af Mitis Group mægle drab på orme.Et betydeligt fald i skn-1 knockdown ormens overlevelse blev observeret sammenlignet med vektorkontrolbehandlede orme. En lignende drab fænotype blev observeret med skn-1 mutant stamme og N2 vilde-type orme. Dette viser, at skn-1 påvirker ormenes overlevelse på Mitis-gruppen.Lokalisering af skn-1 BCGFP blev observeret i orme, der blev eksponeret for de vilde N-komplimentstammer og ikke som reaktion på Delta spxB-mutantstammen fra S cordonae. Efter komponenter af P38 kort kinase vej blev slået ned, reduceret lokalisering af skn-1 BCGFP og knockdown behandlede orme, i forhold til vektor kontrol behandlede orme, blev observeret. Ved at bruge streptokokker c.elegans system, virkningerne af hydrogenperoxid på endoplasmic vertikulær stress, mitokondrielle skader, mitophogy, og tophogy kan undersøges yderligere. Endvidere kan mekanismer, hvorigennem hydrogenperoxid fungerer som en virilescencefaktor for at fremkalde immunrespons ved at forstyrre cellernes kerneprocesser, identificeres.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Omfattende vurdering af Kimcellelinje kemiske toksicitet Brug nematoden<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Rumlig og tidsmæssig analyse af Active ERK i<em&gt; C. elegans</em&gt; Kimcellelinje

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilisering af Caenorhabditis elegans at analysere intracellulær Transport i neuroner

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Anvendelse af RNAi og Heat-shock-induceret transskription faktor udtryk til at omprogrammere kønsceller til neuroner i C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Vurdering af lysosomale basisk i tarmen af Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsmæssige analyse af Caenorhabditis elegans kønscelleoverførsel at studere Distribution kerner, proteiner og cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal plade i Gastrulating mus embryoner ved hjælp af Scanning elektronmikroskopi og hele Mount immunfluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

A Mini-Invasive Internal Fixation Technique for Studying Immobilization-Induced Knee Flexion Contracture in Rats

En mini-invasiv intern fiksering teknik til at studere immobilisering-induceret knæ Fleksation kontraktur i rotter

Joint contracture, resulting from a prolonged joint immobilization, is a common complication in orthopedics. Currently, utilizing an internal fixation to ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Isotropisk lys-Sheet mikroskopi og automatiseret celle Lineage analyser til kataloget Caenorhabditis elegans Embryogenesis med Subcellular opløsning

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Måling sperm vejledning og motilitet i Caenorhabditis elegans hermaphrodite reproduktive tarmkanalen

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...