Name: studying oxidative stress caused by the mitis group streptococci in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-03-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Wij danken Dr. Bing-Yan Wang, Dr. Gena Tribble (de Universiteit van Texas, School voor tandheelkunde), Dr. Richard Lamont (Universiteit van Louisville, de School voor tandheelkunde), en Dr. Samuel Shelburne (MD Anderson Cancer Center) voor het verstrekken van laboratorium- en klinische stammen van de mitis groep streptokokken. Wij danken ook Dr. Keith Blackwell (departement van genetica, Harvard Medical School) voor de stammen van C. elegans . Tot slot, wij danken Dr. Danielle Garsin en haar lab (de Universiteit van Texas, McGovern Medical School) voor het verstrekken van reagentia en worm stammen het onderzoek uit te voeren. Sommige stammen van worm werden verstrekt door de CGC, die wordt gefinancierd door de NIH kantoor van infrastructuur onderzoeksprogramma (P40 OD010440).

1. bereiding van uw platen van de Agar (Todd-Hewitt gistextract)
<ol><li>Voeg voor 1 liter media, 30 g van Todd-Hewitt poeder, 2 g gistextract en 20 g agar aan een erlenmeyer van 2 L. 970 mL gedeïoniseerd water toevoegen aan de inhoud van de kolf en omvatten een roer-bar. Autoclaaf de media op een temperatuur van 121 ° C en een druk van 15 lb/inch2 voor 30 min. Daarna stellen de media op een bord roer en laat voor koeling met zachte roeren.</li>
	<li>Giet de media in gepaste afmetingen steriele petrischale...

<ol>
	<li>Human Microbiome Project, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+diversity+of+the+healthy+human+microbiome.">Structure, function and diversity of the healthy human microbiome.</a> Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).</li><li>Mitchell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+mitis:+walking+the+line+between+commensalism+and+pathogenesis.">Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis.</a> Molecular Oral Microbiology. 26 (2), 89-98 (2011).</li><li>Dyson, C., Barnes, R. A., Harrison, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infective+endocarditis:+an+epidemiological+review+of+128+episodes.">Infective endocarditis: an epidemiological review of 128 episodes.</a> Journal of Infection. 38 (2), 87-93 (1999).</li><li>Sahasrabhojane, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-level+assessment+of+the+molecular+basis+of+fluoroquinolone+resistance+among+viridans+group+streptococci+causing+bacteraemia+in+cancer+patients.">Species-level assessment of the molecular basis of fluoroquinolone resistance among viridans group streptococci causing bacteraemia in cancer patients.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 43 (6), 558-562 (2014).</li><li>Shelburne, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+mitis+strains+causing+severe+clinical+disease+in+cancer+patients.">Streptococcus mitis strains causing severe clinical disease in cancer patients.</a> Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 762-771 (2014).</li><li>van der Meer, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution,+antibiotic+susceptibility+and+tolerance+of+bacterial+isolates+in+culture-positive+cases+of+endocarditis+in+The+Netherlands.">Distribution, antibiotic susceptibility and tolerance of bacterial isolates in culture-positive cases of endocarditis in The Netherlands.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 10 (9), 728-734 (1991).</li><li>Han, X. Y., Kamana, M., Rolston, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viridans+streptococci+isolated+by+culture+from+blood+of+cancer+patients:+clinical+and+microbiologic+analysis+of+50+cases.">Viridans streptococci isolated by culture from blood of cancer patients: clinical and microbiologic analysis of 50 cases.</a> Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 160-165 (2006).</li><li>Hoshino, T., Fujiwara, T., Kilian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+phylogenetic+and+phenotypic+analyses+to+identify+nonhemolytic+streptococci+isolated+from+bacteremic+patients.">Use of phylogenetic and phenotypic analyses to identify nonhemolytic streptococci isolated from bacteremic patients.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (12), 6073-6085 (2005).</li><li>Kohno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+complications+in+patients+receiving+autologous+CD34-selected+hematopoietic+stem+cell+transplantation+for+severe+autoimmune+diseases.">Infectious complications in patients receiving autologous CD34-selected hematopoietic stem cell transplantation for severe autoimmune diseases.</a> Transplant Infectious Disease. 11 (4), 318-323 (2009).</li><li>Zhu, L., Kreth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+hydrogen+peroxide+in+environmental+adaptation+of+oral+microbial+communities.">The role of hydrogen peroxide in environmental adaptation of oral microbial communities.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 717843 (2012).</li><li>Okahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+contributes+to+the+epithelial+cell+death+induced+by+the+oral+mitis+group+of+streptococci.">Hydrogen peroxide contributes to the epithelial cell death induced by the oral mitis group of streptococci.</a> PLoS One. 9 (1), 88136 (2014).</li><li>Stinson, M. W., Alder, S., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+and+killing+of+human+endothelial+cells+by+viridans+group+streptococci.">Invasion and killing of human endothelial cells by viridans group streptococci.</a> Infection and Immunity. 71 (5), 2365-2372 (2003).</li><li>Rai, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pneumoniae+secretes+hydrogen+peroxide+leading+to+DNA+damage+and+apoptosis+in+lung+cells.">Streptococcus pneumoniae secretes hydrogen peroxide leading to DNA damage and apoptosis in lung cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (26), 3421-3430 (2015).</li><li>Braun, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumococcal+pneumolysin+and+H(2)O(2)+mediate+brain+cell+apoptosis+during+meningitis.">Pneumococcal pneumolysin and H(2)O(2) mediate brain cell apoptosis during meningitis.</a> Journal of Clinical Investigation. 109 (2), 19-27 (2002).</li><li>Naji, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activation+of+the+oxidative+stress+response+transcription+factor+SKN-1+in+Caenorhabditis+elegans+by+mitis+group+streptococci.">The activation of the oxidative stress response transcription factor SKN-1 in Caenorhabditis elegans by mitis group streptococci.</a> PLoS One. 13 (8), 0202233 (2018).</li><li>Bolm, M., Jansen, W. T., Schnabel, R., Chhatwal, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide-mediated+killing+of+Caenorhabditis+elegans:+a+common+feature+of+different+streptococcal+species.">Hydrogen peroxide-mediated killing of Caenorhabditis elegans: a common feature of different streptococcal species.</a> Infection and Immunity. 72 (2), 1192-1194 (2004).</li><li>Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+worm+has+turned--microbial+virulence+modeled+in+Caenorhabditis+elegans.">The worm has turned--microbial virulence modeled in Caenorhabditis elegans.</a> Trends in Microbiology. 13 (3), 119-127 (2005).</li><li>Irazoqui, J. E., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=99th+Dahlem+conference+on+infection,+inflammation+and+chronic+inflammatory+disorders:+Caenorhabditis+elegans+as+a+model+to+study+tissues+involved+in+host+immunity+and+microbial+pathogenesis.">99th Dahlem conference on infection, inflammation and chronic inflammatory disorders: Caenorhabditis elegans as a model to study tissues involved in host immunity and microbial pathogenesis.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 160 (1), 48-57 (2010).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+and+Aging+in+Caenorhabditis+elegans:+Causal+or+Casual+Relationship.">Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 13 (12), 1911-1953 (2010).</li><li>Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+C.+elegans+for+aging+research.">Using C. elegans for aging research.</a> Invertebrate Reproduction &amp; Development. 59, 59-63 (2015).</li><li>Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKN-1/Nrf,+stress+responses,+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 88, 290-301 (2015).</li><li>Irazoqui, J. E., Urbach, J. M., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+host+innate+defence:+insights+from+Caenorhabditis+elegans+and+primitive+invertebrates.">Evolution of host innate defence: insights from Caenorhabditis elegans and primitive invertebrates.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (1), 47-58 (2010).</li><li>Park, S. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+as+mediated+by+SKN-1.">Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1.</a> Aging Cell. 8 (3), 258-269 (2009).</li><li>An, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Caenorhabditis+elegans+oxidative+stress+defense+protein+SKN-1+by+glycogen+synthase+kinase-3.">Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).</li><li>An, J. H., Blackwell, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKN-1+links+C.+elegans+mesendodermal+specification+to+a+conserved+oxidative+stress+response.">SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response.</a> Genes &amp; Development. 17 (15), 1882-1893 (2003).</li><li>Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+of+hydrogen+peroxide+produced+by+Enterococcus+faecium.">Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium.</a> Infection and Immunity. 72 (8), 4512-4520 (2004).</li><li>Pincus, Z., Mazer, T. C., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+as+a+measure+of+senescence+in+C.+elegans:+look+to+red,+not+blue+or+green.">Autofluorescence as a measure of senescence in C. elegans: look to red, not blue or green.</a> Aging (Albany NY). 8 (5), 889-898 (2016).</li><li>Teuscher, A. C., Ewald, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+Autofluorescence+to+Assess+GFP+Expression+During+Normal+Physiology+and+Aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Overcoming Autofluorescence to Assess GFP Expression During Normal Physiology and Aging in Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 8 (14), (2018).</li></ol>

De beschreven methoden kunnen worden gebruikt voor andere pathogene bacteriën zoals Enterococcus faecium, die ook H2O2 onder anaërobe geteeld produceert of microaerophilic voorwaarden26. Typisch, voor meest pathogene organismen duurt het enkele dagen tot weken te voltooien van de tests van de overleving. Echter, als gevolg van de robuuste productie van H2O2 door leden van de groep mitis, deze tests kunnen worden voltooid binnen 5-6 uur onder d...

Mitis groep streptokokken zijn menselijke commensals van de orofaryngeale holte1. Deze organismen kunnen echter ontsnappen deze niche en een verscheidenheid van invasieve ziekten2veroorzaken. De infecties veroorzaakt door deze micro-organismen bevatten bacteriëmie endocarditis en orbitale cellulitis (sinaasappelhuid)2,3,4,5,6. Bovendien komen ze als oorzakelijke agens van infecties van de bloedbaan in immuungecompromitteerde, neutropenic en kankerpatiënten die chemotherapie5,7,8,9 hebben ondergaan .
De mechanismen onderliggende mitis groep pathogenese is duister, omdat enkele virulentiefactoren zijn geïdentificeerd. De mitis-groep is bekend voor de productie van H2O2, waaruit blijkt een belangrijke rol spelen in mondelinge microbiële gemeenschappen10. Meer recentelijk, verschillende studies hebben gewezen op een rol voor de H2O2 als een cytotoxin dat epitheliale cellen dood11,12 induceert. S. longontsteking, die behoort tot deze groep, is aangetoond dat het produceren van hoge niveaus van H2O2 die DNA-beschadiging en apoptosis in alveolaire cellen13induceert. Met behulp van een acute longontsteking diermodel, de dezelfde onderzoekers aangetoond dat de productie van H2O2 door de bacteriën een virulentie voordeel toekent. Studies op pneumokokken meningitis hebben ook aangetoond dat pathogen afkomstige H2O2 werkt synergetisch met pneumolysin om te activeren van neuronale cel dood14. Deze opmerkingen duidelijk vaststellen dat H2O2 geproduceerd door deze groep van bacteriën is belangrijk voor hun pathogeniteit.
Het is interessant, ook aangetoond dat leden van de mitis groep S. mitis en S. oralis leiden tot de dood van de nematode C. elegans via de productie van H2O215,16. Deze free-living nematode is gebruikt als een eenvoudige, genetisch hanteerbare model om vele biologische processen te bestuderen. Meer recentelijk, de worm heeft ontpopt als een model voor het bestuderen van de gastheer-pathogeen interacties17,18. Bovendien hebben verschillende studies gewezen op het belang van het bestuderen van oxidatieve stress met behulp van dit organisme19,20,21. Zijn korte levenscyclus, mogelijkheden voor vechtpartij genen van belang door RNAi en het gebruik van groen fluorescent proteïne (GFP)-gesmolten verslaggevers om te controleren van genexpressie zijn enkele van de kenmerken die het een aantrekkelijk modelsysteem maken. Wat nog belangrijker is, zijn de trajecten die regelen van oxidatieve stress en aangeboren immuniteit in de worm zeer geconserveerd met zoogdieren20,22.
In dit protocol, wordt aangetoond hoe met C. elegans verhelderen van de pathogeniteit veroorzaakt door streptokokken afkomstige H2O2. Een gemodificeerde overleving assay wordt weergegeven, en leden van de groep mitis kunnen doden de wormen snel via de productie van H2O2. Met behulp van de leden van de mitis-groep, een duurzame biologische bron van reactieve zuurstof soorten wordt (ROS) verstrekt, in tegenstelling tot chemische bronnen die oxidatieve stress in het wormen veroorzaken. Bovendien, de bacteriën kunnen koloniseren de wormen snel, waardoor voor H2O2 rechtstreeks gericht aan de intestinale cellen (ten opzichte van andere bronnen die moeten oversteken van de verscheidene barrières). De test wordt gevalideerd of 1) door het bepalen van het voortbestaan van de gemuteerde stam van skn-1 of 2) door neerhalend skn-1 met behulp van RNAi in wormen ten opzichte van de N2 wild-type en vector controle behandeld wormen. SKN-1 is een belangrijke transcriptiefactor die de oxidatieve stressrespons in C. elegans23,24,25 regelt. Naast overleving testen, is een stam van de worm uiting van een transgene verslaggever van SKN-1B/C::GFP gebruikt om te controleren van de activering van de oxidatieve stress reactie via de productie van H2O2 door de mitis-groep.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:845px;" width="845">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Media and chemicals</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Bacto peptone&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0118-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Bacto Todd Hewitt Broth</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0492-17-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD BBL Sheep Blood, Defibrinated&#160;&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B11947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Difco Agar&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0145-17-0</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Difco LB Broth</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0446-17-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blood agar (TSA with Sheep Blood)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R01200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Carbenicillin</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP26481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Catalase&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C1345-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ICN10138201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">IPTG</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MP21021012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Nystatin</td>
			<td style="width:179px;">Acros organics</td>
			<td style="width:119px;">AC455500050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium chloride&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SS266-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">8.25% Sodium Hypochlorite</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Streptomycin Sulfate&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP910-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Tetracyclin</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">87128-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">(&#8722;)-Tetramisole hydrochloride</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L9756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1422-500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Consumables&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-565-269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 x 10 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">No. 1.5&#160; 18 mm X 18 mm Cover Slips</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-541A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-544-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Software&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Prism</td>
			<td style="width:179px;">Graphpad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Bacterial Strains</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. oralis ATCC 35037</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. mitis ATCC 49456</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. gordonii DL1 Challis&#160;&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">E. coli OP50</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">E. coli HT115</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Worm Strains</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Strain</td>
			<td style="width:179px;">Genotype</td>
			<td style="width:119px;">Transgene</td>
			<td>Source</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">N2</td>
			<td style="width:179px;">C. elegans wild isolate</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">EU1</td>
			<td style="width:179px;">skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">LD002</td>
			<td style="width:179px;">IdIs1</td>
			<td style="width:119px;">SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)</td>
			<td>Keith Blackwell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying oxidative stress caused by the mitis group streptococci in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), een free-living nematode, heeft ontpopt als een aantrekkelijk model te bestuderen van de gastheer-pathogeen interacties. Dit model wordt in het gepresenteerde protocol gebruikt om te bepalen van de pathogeniteit veroorzaakt door de mitis groep streptokokken via de productie van H2O2. De mitis groep streptokokken zijn een nieuwe bedreiging die ervoor zorgen dat vele menselijke ziekten zoals bacteriëmie endocarditis en orbitale cellulitis (sinaasappelhuid). Hier beschreven is een protocol om het voortbestaan van deze wormen in reactie op H2O2 geproduceerd door deze groep van ziekteverwekkers. Met behulp van de gene skn-1 codering voor een oxidatieve stress reactie transcriptiefactor, wordt aangetoond dat dit model belangrijk zijn voor de identificatie van de host-genen die essentieel zijn tegen streptokokken infectie. Bovendien is aangetoond dat de activering van de oxidatieve stressrespons kan worden gecontroleerd in de aanwezigheid van deze ziekteverwekkers met behulp van een transgene verslaggever worm stam, waarin SKN-1 is gesmolten tot groen fluorescente proteïne (GFP). Deze tests bieden de mogelijkheid om te studeren van de oxidatieve stress reactie op H2O2 afgeleid door een biologische bron in tegenstelling tot exogenously reactieve zuurstof soorten (ROS) bronnen toegevoegd.

Leden van de mitis groep S. mitis, S. oralis, en S. gordonii snel gedood de wormen, in tegenstelling tot niet-pathogene E. coli , S. mutansen S. salivarius, OP50 (Figuur 3A). De mediane overleving voor S. mitis, S. oralis, en S. gordonii was 300 minuten, 300 min en 345 min, respectievelijk. Om te bepalen als het doden was gemedieerd door H2O2</sub...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

De nematode Caenorhabditis elegans is een uitstekend model te ontleden gastheer-pathogeen interacties. Hier beschreven is een protocol te infecteren de worm met leden van de mitis groep streptokokken en activering van de oxidatieve stressrespons tegen H2O2 geproduceerd door deze groep van organismen te bepalen.

Studeren oxidatieve Stress veroorzaakt door de streptokokken groep Mitis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

In dit protocol laten we zien hoe je een vrije leefmethode c. elegans gebruiken om de pathogeniteit te verduidelijken die wordt veroorzaakt door waterstofperoxide geproduceerd via Streptococci van de Mitis Group. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we pathogeniteit en de activering van stressreacties in de worm kunnen bestuderen met behulp van een duurzame biologische bron van reactieve zuurstofsoorten in tegenstelling tot chemische bronnen Voor een liter media voeg 30 g Todd Hewitt poeder, 2g gistextract en 20g ager toe aan een 2 liter Erlin Myer-kolf.Voeg 970 ml gedeïsized water toe aan de inhoud van de kolf en doe er een roerstaaf in. Gebruik aluminiumfolie om de opening te dekken. Autoclave de media in de kolf bij een temperatuur van 121 graden Celsius en druk van 15 pond per vierkante inch gedurende 30 minuten.Zet daarna de kolf op een roerplaat om af te koelen met zacht roeren. Onder een laminaire kap, giet de media in de juiste grootte, steriele petrischaaltjes. Laat de media 2 uur drogen.Bewaar daarna de platen op 4 graden Celsius voor maximaal 1 maand. Verwarm vóór de bereiding van Mitis Group streptococci de THY agar platen in een couveuse tot 37 graden Celsius. Daarna gebruik maken van een steriele lus te strepen uit de gewenste stammen van strepticocci op de plaatsen.Zet vervolgens de platen in een kaarsenpot en broed de pot op 37 graden Celsius 's nachts voor ongeveer 18 uur om een microerofiele omgeving te bieden. De volgende dag, verwijder de platen uit de kaars pot en gebruik een steriele lus te plukken geïsoleerde kolonies. Inenting 15 ml steriele conische buizen met 2 ml THY bouillon.Sluit de doppen strak en broed de buizen bij 37 graden Celsius onder statische omstandigheden. Pre-warme THY platen in een couveuse tot 37 graden Celsius voeg 50 microliter oplossing met 1000 eenheden catalase op de THY-plaat. Gebruik een steriele spreader om de catalase oplossing te verspreiden en laat de platen drogen op de laminaire stroomkap gedurende 30 minuten.Om de platen met de streptococcusstammen te zaaien, gebruik een pipet om 80 microliters van 's nachts gekweekte culturen aan de plaat toe te voegen en een steriele spreader te gebruiken om de bacteriën volledig over het agaroppervlak te verspreiden. Incubeer de platen op 37 graden Celsius in een kaarsenpot 's nachts. Als een controle, op twee NGM platen, voeg 80 microliters van 's nachts geteelde culturen van E.coli OP-50 voor zaaien.Incubeer de platen op 37 graden Celsius 's nachts. De volgende dag, verwijder de platen uit de kaars pot en laat de platen afkoelen tot kamertemperatuur. Met behulp van een steriele worm pick, breng 30 L4 larven van de NGM voederplaten naar de streptokokken gezaaide THY platen.Broed de platen uit op 25 graden Celsius. Tel onder een ontledenmicroscoop het aantal levende en dode L4-larven op elke plaat op verschillende tijdstippen. Gebruik de steriele worm pick om voorzichtig prikken de wormen en bepalen of ze dood of levend zijn.In eerste instantie, score de wormen als dood of leven elke 30 minuten. Wanneer wormen snel beginnen te sterven, score ze op 15 minuten intervallen. De test duurt 5 tot 6 uur.Herhaal het experiment daarna nog twee keer. Om het agarosepad voor te bereiden, plak labtape in de lengte langs twee glazen platen. Dit zal de dikte van de agarose pads bepalen.Plaats een schone glazen schuif tussen de twee afgeplakte dia's. Los agarose op in gedeïsteerd water om 2 gewichtsvolume procent te maken en verwarm de oplossing in een magnetron. Gebruik een pipet om 100 microliters gesmolten agarose op het midden van de schone glijbaan te plaatsen.Plaats onmiddellijk een andere schone glazen glijbaan op de top van de gesmolten agarose en druk zachtjes naar beneden om een pad te maken. Laat de agarose stollen en verwijder vervolgens de bovenste dia. De agarose pad is klaar voor gebruik.Verwarm THY-platen tot 37 graden Celsius. Zaad de platen met een streptokokken stammen zoals eerder gedaan in de overlevingstesten. Zaad 3 NGM platen met E-coli OP-50 als controle en incubaal op 37 graden Celsius 's nachts.De volgende dag, koel de platen op kamertemperatuur. Gebruik M9W buffer om L4 larven van NGM of NGM RNAi voerplaten te wassen in 15 ml conische buizen. Draai de buizen op 450 keer g, gedurende een minuut in een centrifuge.Decanteer de supernatant en voeg 10 ml M9W toe aan elke buis. Herhaal de centrifugaal stap nog drie keer. Stel de wormen opnieuw op in 250 microliter M9W en plaats drie 5 microliter druppels van de wormsuspensie op een schoon petrischaaldeksel.Schat onder een ontledenmicroscoop het aantal wormen per microliter. Voeg met behulp van een pipet ongeveer 100 L4-larven toe aan elke THY streptokokken ingezaaide en NGM E.coli gezaaide platen. Gebruik drie platen per stam van bacteriën.Incubeer de platen voor 2 tot 3 uur bij 25 graden Celsius. Verwijder vervolgens de platen uit de couveuse. Was ze met M9W en verzamel de wormen in 15ml conische buizen.Was de wormen drie keer zoals eerder gedaan in de centrifugale stap. Verwijder het grootste deel van de M9W door aspiratie. En voeg 500 microliter M9W met 2 millimolar natriumajaide of tetramisole hydrochloride toe aan de wormpellet voor anesthesie.Incubeer de buis met wormkorrels bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Laat vervolgens 15 microliter van de wormsuspensie op een voorbereid agorosepad vallen. Visualiseer onder een fluorescerende microscoop de lokalisatie van skn-1 met behulp van Fitzy en Dappy filters.Beeldwormen bij 10 keer en 20 keer vergrotingen. Scoor de wormen op basis van drie niveaus van lokalisatie;lage lokalisatie, waar geen nucleaire lokalisatie wordt waargenomen, medium lokalisatie, met SKN 1 BCGFP in het voorste of achterste van de worm, en hoge lokalisatie, waar nucleaire lokalisatie van skn-1 BCGFP wordt waargenomen in alle darmcellen. In dit experiment doodden leden van de Mitis Group de wormen snel, in tegenstelling tot S.mutans, S.salivarius en niet-pathogene E.coli OP-50.Toen catalase werd aangevuld met THY ager, werd het doden van de wormen afgeschaft. De dood van de wormen werd niet waargenomen op de delta spxB mutant stam in vergelijking met de wilde-type en compliment stammen. Deze gegevens suggereren dat de waterstofperoxide geproduceerd door de Mitis Group bemiddelt het doden van de wormen.Een significante afname van de overleving van de skn-1 knockdown wormen werd waargenomen in vergelijking met de vector controle behandeld wormen. Een soortgelijk dodend fenotype werd waargenomen met de skn-1 mutant stam en de N2 wild-type wormen. Dit toont aan dat skn-1 de overleving van de wormen op de Mitis Groep beïnvloedt.Lokalisatie van skn-1 BCGFP werd waargenomen bij wormen die werden blootgesteld aan de wild-type N-compliment stammen en niet in reactie op de Delta spxB mutant stam van de S cordonae. Nadat onderdelen van de P38-kaart kinase-pad waren afgebroken, werd de verminderde lokalisatie van skn-1 BCGFP en knockdown behandelde wormen, ten opzichte van de met vectorcontrole behandelde wormen, waargenomen. Door het gebruik van de streptococci c.elegans systeem, de effecten van waterstofperoxide op endoplasmische verticulaire stress, mitochondriale schade, mitophogie, en tophogy kan verder worden bestudeerd. Verder kunnen mechanismen worden geïdentificeerd waarmee waterstofperoxide fungeert als een virilescentiefactor om immuunreacties uit te lokken door de kernprocessen van de cel te verstoren.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Uitgebreide beoordeling van Kiembaan chemische toxiciteit De nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Ruimtelijke en temporele analyse van Active ERK in de<em&gt; C. elegans</em&gt; Kiembaan

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilisatie van Caenorhabditis elegans te analyseren intracellulair Transport in neuronen

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Toepassing van RNAi en warmte-schok-geïnduceerde transcriptie Factor expressie te herprogrammeren kiemcellen aan neuronen in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Beoordeling van lysosomale gealkaliseerd in de darm van levende Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computationele analyse van de Caenorhabditis elegans Germline te bestuderen van de distributie van kernen, eiwitten en het cytoskelet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiseren van het knooppunt en de Notochordal plaat In Gastrulating muis embryo's met behulp van Scanning elektronen microscopie en hele Mount immunofluorescentie

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

A Mini-Invasive Internal Fixation Technique for Studying Immobilization-Induced Knee Flexion Contracture in Rats

Een mini-invasieve interne fixatie techniek voor het bestuderen van immobilisatie-geïnduceerde knie Flexion contractuur bij ratten

Joint contracture, resulting from a prolonged joint immobilization, is a common complication in orthopedics. Currently, utilizing an internal fixation to ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Isotrope licht-vel microscopie en geautomatiseerde Cell Lineage analyses catalogus Caenorhabditis embryogenese met subcellulaire resolutie

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Het meten van sperma begeleiding en beweeglijkheid binnen de Caenorhabditis van het hermafrodiet-reproductieve kanaal

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...