Name: studying oxidative stress caused by the mitis group streptococci in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-03-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Nous remercions m. Bing-Yan Wang, Dr Gena Tribble (The University of Texas, école de médecine dentaire), Dr. Richard Lamont (Université de Louisville, école de médecine dentaire) et le Dr Samuel Shelburne (MD Anderson Cancer Center) pour la fourniture de laboratoire et des souches cliniques de Les streptocoques de groupe mitis. Nous remercions également m. Keith Blackwell (département de génétique, Harvard Medical School) pour les souches de c. elegans . Enfin, nous remercions le Dr Danielle Garsin et son laboratoire (The University of Texas, faculté de médecine de McGovern) pour la fourniture de réactifs et souches de ver pour mener l’étude. Certaines souches de ver ont été fournis par la CCG, qui est financée par le NIH bureau des programmes d’Infrastructure de recherche (P40 OD010440).

1. préparation de tes plaques de gélose (extrait de levure de Todd-Hewitt)
<ol><li>Pour 1 L de médias, ajouter 30 g de poudre de Todd-Hewitt, 2 g d’extrait de levure et 20 g d’agar dans un Erlenmeyer de 2 L. Ajoute le contenu de la fiole de 970 mL d’eau désionisée et comprend un bar de remuer. Autoclave les médias à une température de 121 ° C et une pression de 15 lb/po2 pendant 30 min. Par la suite, mettre les médias sur une plaque de remuer et le laisser pour refroidir en agitant doucement....

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+as+a+measure+of+senescence+in+C.+elegans:+look+to+red,+not+blue+or+green.">Autofluorescence as a measure of senescence in C. elegans: look to red, not blue or green.</a> Aging (Albany NY). 8 (5), 889-898 (2016).</li><li>Teuscher, A. C., Ewald, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+Autofluorescence+to+Assess+GFP+Expression+During+Normal+Physiology+and+Aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Overcoming Autofluorescence to Assess GFP Expression During Normal Physiology and Aging in Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 8 (14), (2018).</li></ol>

Les méthodes décrites peuvent être utilisés pour d’autres bactéries pathogènes telles que Enterococcus faecium, qui produit aussi H2O2 cultivés en anaérobie ou26des conditions microaérophiles. En général, pour les plus pathogènes, il faut plusieurs jours à semaines pour réaliser les essais de survie. Toutefois, en raison de la production robuste de H2O2 par les membres du groupe mitis, ces épreuves pourraient être complétées ...

Streptocoques du groupe Mitis sont commensaux humaine de la cavité oropharyngée1. Toutefois, ces organismes peuvent échapper à ce créneau et causer une variété de maladies invasives2. Les infections provoquées par ces micro-organismes incluent une bactériémie, endocardite et orbitaire2,3,4,5,6. En outre, ils font leur apparition des agents comme responsables de bactériémies à neutropéniques immunodéprimés et cancéreux qui ont subi une chimiothérapie5,7,8,9 .
Les mécanismes sous-jacents pathogenèse de groupe mitis est obscur, parce que quelques-uns des facteurs de virulence ont été identifiés. Le groupe de la mitis est connu pour produire H2O2, qui a montré à jouer un rôle important dans les communautés microbiennes orale10. Plus récemment, plusieurs études ont mis en évidence un rôle pour H2O2 comme une cytotoxine qui induit des cellules épithéliales mort11,12. Pneumonie de S., qui appartient à ce groupe, a été démontré pour produire des niveaux élevés de H2O2 qui induit des lésions de l’ADN et l’apoptose dans les cellules alvéolaires13. À l’aide d’un modèle animal de pneumonie aiguë, les mêmes chercheurs ont démontré que la production de H2O2 par les bactéries confère un avantage de virulence. Études sur la méningite à pneumocoques ont également montré que dérivé de pathogène H2O2 agit en synergie avec pneumolysin pour déclencher des cellules neuronales mort14. Ces observations établissent clairement que l’H2O2 produites par ce groupe de bactéries est important pour leur pouvoir pathogène.
Fait intéressant, il a également été démontré que les membres de la mitis du groupe S. mitis et s. oralis entraînent la mort de la nématode c. elegans , via la production de H2O215,16. Ce nématode libre a été utilisé comme un modèle simple, génétiquement tractable pour étudier de nombreux processus biologiques. Plus récemment, le ver est devenue un modèle pour l’étude de17,des interactions hôte-pathogène18. En outre, plusieurs études ont souligné l’importance d’étudier le stress oxydatif, à l’aide de cet organisme19,20,21. Son cycle de vie court, la capacité de knockdown gènes présentant un intérêt par Arni et l’utilisation de la protéine fluorescente verte (GFP)-fusible reporters pour contrôler l’expression des gènes sont quelques-uns des attributs qui en font un système modèle attrayant. Plus important encore, les voies qui régulent le stress oxydatif et l’immunité innée dans la vis sans fin sont hautement conservées avec mammifères20,22.
Dans le présent protocole, on démontre comment utiliser le c. elegans pour élucider le pouvoir pathogène causé par le streptocoque dérivés H2O2. Un test de survie mis à jour l’apparaît, tandis que les membres du groupe mitis sont capables de tuer les vers rapidement via la production de H2O2. À l’aide des membres du groupe mitis, une source biologique durable des espèces réactives de l’oxygène (ROS) est fourni, par opposition aux sources chimiques qui provoquent le stress oxydatif dans les vers. En outre, les bactéries sont capables de coloniser les vers rapidement, ce qui permet pour H2O2 à cibler directement les cellules intestinales (par rapport à d’autres sources qui ont à franchir plusieurs obstacles). L’essai est validé soit 1) par détermination de la survie de la souche mutante skn-1 ou 2) en abattant de skn-1 à l’aide d’Arni en vers par rapport à la N2 sauvage et vector control traité vers. SKN-1 est un facteur de transcription importante qui régule la réponse de stress oxydatif chez c. elegans23,24,25. En plus des essais de survie, une souche ver exprimant un journaliste transgénique SKN-1 b/C::GFP est utilisée pour contrôler l’activation de la stress oxydatif réponse via la production de H2O2 par le groupe de la mitis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:845px;" width="845">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Media and chemicals</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Bacto peptone&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0118-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Bacto Todd Hewitt Broth</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0492-17-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD BBL Sheep Blood, Defibrinated&#160;&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B11947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Difco Agar&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0145-17-0</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Difco LB Broth</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0446-17-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blood agar (TSA with Sheep Blood)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R01200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Carbenicillin</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP26481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Catalase&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C1345-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ICN10138201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">IPTG</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MP21021012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Nystatin</td>
			<td style="width:179px;">Acros organics</td>
			<td style="width:119px;">AC455500050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium chloride&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SS266-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">8.25% Sodium Hypochlorite</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Streptomycin Sulfate&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP910-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Tetracyclin</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">87128-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">(&#8722;)-Tetramisole hydrochloride</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L9756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1422-500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Consumables&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-565-269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 x 10 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">No. 1.5&#160; 18 mm X 18 mm Cover Slips</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-541A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-544-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Software&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Prism</td>
			<td style="width:179px;">Graphpad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Bacterial Strains</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. oralis ATCC 35037</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. mitis ATCC 49456</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. gordonii DL1 Challis&#160;&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">E. coli OP50</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">E. coli HT115</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Worm Strains</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Strain</td>
			<td style="width:179px;">Genotype</td>
			<td style="width:119px;">Transgene</td>
			<td>Source</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">N2</td>
			<td style="width:179px;">C. elegans wild isolate</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">EU1</td>
			<td style="width:179px;">skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">LD002</td>
			<td style="width:179px;">IdIs1</td>
			<td style="width:119px;">SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)</td>
			<td>Keith Blackwell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying oxidative stress caused by the mitis group streptococci in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (c. elegans), un nématode libre, est devenue un modèle attrayant pour étudier les interactions hôte-pathogène. Le protocole présenté utilise ce modèle pour déterminer le caractère pathogène causé par le streptocoque du groupe mitis via la production de H2O2. Les streptocoques de groupe mitis sont une menace émergente qui provoquent de nombreuses maladies humaines telles que bactériémie, endocardite et orbitaire. Décrit ici est un protocole pour déterminer la survie de ces vers en réponse à H2O2 produit par ce groupe d’agents pathogènes. Utilisant le skn-1 gène codant pour un facteur de transcription de réponse de stress oxydatif, on montre que ce modèle est important pour l’identification des gènes hôtes essentiels contre une infection à streptocoque. En outre, il est démontré que l’activation de la réponse au stress oxydatif peut être surveillée en présence de ces agents pathogènes en utilisant une souche de ver journaliste transgéniques, dans lequel SKN-1 est fusionnée à la protéine fluorescente verte (GFP). Ces tests fournissent l’occasion d’étudier la réponse au stress oxydatif H2O2 résultant d’une source biologique par opposition à un exogène ajouté réactives de l’oxygène (dro) sources.

De la mitis, les membres du groupe S. mitis, S. oralis et S. gordonii rapidement tué les vers, par opposition à S. mutans, S. salivarius et non pathogène e. coli OP50 (Figure 3A). La médiane de survie pour S. mitis, S. oralis et S. gordonii était de 300 min 300 min et 345 min, respectivement. Pour déterminer si le meurtre a été véhiculé par H2</sub...

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Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Le nématode Caenorhabditis elegans est un excellent modèle pour disséquer les interactions hôte-pathogène. Décrit ici est un protocole visant à infecter le ver avec des membres des mitis streptocoques et déterminer l’activation de la réponse au stress oxydatif contre H2O2 produites par ce groupe d’organismes.

Étudier le Stress oxydatif causé par les streptocoques de groupe Mitis chez Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Dans ce protocole, nous démontrons comment utiliser une méthode de vie libre c. elegans pour élucider la pathogénie causée par le peroxyde d’hydrogène produit par l’intermédiaire des streptocoques du Groupe Mitis. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons étudier la pathogénicité et l’activation des réponses au stress dans le ver en utilisant une source biologique durable d’espèces réactives d’oxygène par opposition aux sources chimiques Pour un litre de médias ajouter 30g de poudre Todd Hewitt, 2g d’extrait de levure et 20g d’ager à un flacon Erlin Myer de 2 litres.Ajouter 970 ml d’eau déionisée au contenu du flacon et mettre dans une barre d’agitation. Utilisez du papier d’aluminium pour couvrir l’ouverture. Autoclave le média dans le flacon à une température de 121 degrés Celsius et la pression de 15 livres par pouce carré pendant 30 minutes.Par la suite, mettre le flacon sur une plaque à remuer pour refroidir en remuant doucement. Sous une capuche laminaire, verser les médias dans des boîtes de Petri de taille appropriée et stériles. Laisser sécher les médias pendant 2 heures.Ensuite, conservez les assiettes à 4 degrés Celsius jusqu’à 1 mois. Avant la préparation des streptocoques du Groupe Mitis, réchauffer les plaques d’agar THY dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Après cela, utilisez une boucle stérile pour strier les souches désirées de streptocoques sur les lieux.Ensuite, mettez les assiettes dans un bocal à chandelles et couvez le bocal à 37 degrés Celsius pendant une nuit pendant environ 18 heures pour fournir un environnement microérophilique. Le lendemain, retirez les assiettes du bocal à chandelles et utilisez une boucle stérile pour ramasser les colonies isolées. Inoculer 15 ml de tubes coniques stériles contenant 2 ml de bouillon THY.Fermez les bouchons serrés et incubez les tubes à 37 degrés Celsius dans des conditions statiques. Les plaques THY préchauffées dans un incubateur à 37 degrés Celsius ajoutent 50 microlitres de solution contenant 1000 unités de catalase sur la plaque THY. Utilisez un épandeur stérile pour étendre la solution catalase et laisser sécher les plaques sur le capot d’écoulement laminaire pendant 30 minutes.Pour ensemencer les plaques avec les souches de streptocoque, utilisez une pipette pour ajouter 80 microlitres de cultures cultivées pendant la nuit à la plaque et utilisez un épandeur stérile pour propager complètement les bactéries à travers la surface de l’agar. Incuber les assiettes à 37 degrés Celsius dans un bocal à chandelles pendant la nuit. À titre de contrôle, sur deux plaques NGM, ajouter 80 microlitres de cultures cultivées pendant la nuit d’E.coli OP-50 pour l’ensemencement.Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, retirez les assiettes du bocal à chandelles et laissez refroidir les assiettes à température ambiante. À l’aide d’un pic de ver stérile, transférer 30 larves de L4 des plaques d’alimentation du MNM vers les plaques THY ensemencées par le streptocoque.Incuber les plaques à 25 degrés Celsius. Au microscope disséquant, compter le nombre de larves vivantes et mortes de L4 sur chaque plaque à plusieurs moments. Utilisez le pic de ver stérile pour propulser doucement les vers et déterminer s’ils sont morts ou vivants.Initialement, marquer les vers comme morts ou vivre toutes les 30 minutes. Lorsque les vers commencent rapidement à mourir, marquez-les à intervalles de 15 minutes. L’analyse prendra de 5 à 6 heures.Après cela, répétez l’expérience deux fois de plus. Pour préparer la garniture d’agarose, collez labtape dans le sens de la longueur le long de deux glissières en verre. Ceci déterminera l’épaisseur des garnitures d’agarose.Placez une glissière en verre propre entre les deux glissières enregistrées. Dissoudre l’agarose dans l’eau déionisée pour faire 2 pour cent de volume de poids et chauffer la solution dans un four à micro-ondes. Utilisez une pipette pour placer 100 microlitres d’agarose fondue au centre de la glissière propre.Placez immédiatement une autre glissière en verre propre sur le dessus de l’agarose fondue et appuyez doucement vers le bas pour faire un tampon. Laissez l’agarose se solidifier et retirez ensuite la glissière supérieure. Le tampon agarose est prêt à l’emploi.Plaques THY préchauffées à 37 degrés Celsius. Ensemencer les assiettes avec une souche de streptocoque comme cela a été fait précédemment dans les analyses de survie. Graine 3 plaques NGM avec E-coli OP-50 comme contrôle et incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain, refroidir les assiettes à température ambiante. Utilisez le tampon M9W pour laver les larves L4 des plaques d’alimentation NGM ou NGM RNAi en tubes coniques de 15 ml. Faire tourner les tubes à 450 fois g, pendant une minute dans une centrifugeuse.Décanter le supernatant et ajouter 10 ml de M9W à chaque tube. Répétez l’étape centrifuge trois fois de plus. Suspendre à nouveau les vers dans 250 microlitres de M9W et placer trois gouttes de 5 microlitres de la suspension du ver sur un couvercle de boîte de Pétri propre.Sous un microscope disséquant, estimer le nombre de vers par microlitre. À l’aide d’une pipette, ajouter environ 100 larves de L4 à chaque streptocoque THY épépiné et plaques ensemencées NGM E.coli. Utilisez trois plaques par souche de bactéries.Incuber les plaques pendant 2 à 3 heures à 25 degrés Celsius. Par la suite, retirer les assiettes de l’incubateur. Lavez-les avec M9W et recueillez les vers dans des tubes coniques de 15ml.Lavez les vers trois fois comme cela a été fait précédemment dans l’étape centrifuge. Supprimez la majeure partie du M9W par aspiration. Et ajouter 500 microlitres de M9W contenant 2 millimilliards d’azide de sodium ou hydrochlorure tétramisole à la pastille de ver pour l’anesthésie.Incuber le tube avec des granulés de ver à température ambiante pendant 15 minutes. Ensuite, déposez 15 microlitres de la suspension de ver sur un tampon d’agorose préparé. Au microscope fluorescent, visualisez la localisation des filtres Skn-1 à l’aide de filtres Fitzy et Dappy.Vers d’image à 10 fois et 20 fois grossissements. Marquer les vers en fonction de trois niveaux de localisation;faible localisation, où aucune localisation nucléaire n’est observée, localisation moyenne, avec SKN 1 BCGFP dans l’antérieur ou postérieur du ver, et localisation élevée, où la localisation nucléaire de skn-1 BCGFP est observée dans toutes les cellules intestinales. Dans cette expérience, les membres du Groupe Mitis ont rapidement tué les vers, par opposition à S.mutans, S.salivarius et non pathogène E.coli OP-50.Lorsque la catalase a été complétée à THY ager, le meurtre des vers a été aboli. La mort des vers n’a pas été observée sur la souche mutante delta spxB par rapport aux souches de type sauvage et compliment. Ces données suggèrent que le peroxyde d’hydrogène produit par le Groupe Mitis médie l’abattage des vers.Une diminution significative de la survie des vers knockdown skn-1 a été observée par rapport aux vers traités à la lutte antivectorielle. Un phénotype mortifuge similaire a été observé avec la souche mutante skn-1 et les vers de type sauvage N2. Cela démontre que skn-1 influencer la survie des vers sur le groupe Mitis.La localisation du SKN-1 BCGFP a été observée chez les vers exposés aux souches de N-compliment de type sauvage et non en réponse à la souche mutante Delta spxB des cordonae S. Après que des composants de la voie de kinase de carte P38 aient été renversés, la localisation réduite du BCGFP skn-1 et des vers traités de knockdown, par rapport aux vers traités de lutte antivectorielle, a été observée. En utilisant le streptocoque c.système elegans, les effets du peroxyde d’hydrogène sur le stress verticulaire endoplasmique, les dommages mitochondriaux, la mitophogie et la tophogie peuvent être étudiés plus avant. En outre, les mécanismes par lesquels le peroxyde d’hydrogène agit comme un facteur de virilescence pour obtenir des réponses immunitaires en perturbant les processus de base de la cellule peuvent être identifiés.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Évaluation complète de la lignée germinale toxicité chimique Utilisation du nématode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Recherche

Biologie du développement

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

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Analyse spatiale et temporelle d&#39;Active ERK dans le<em&gt; C. elegans</em&gt; germinale

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

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Immobilisation Caenorhabditis elegans , à analyser le Transport intracellulaire dans les neurones

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

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Application de RNAi et Expression du facteur de Transcription induite par la chaleur-choc pour reprogrammer les cellules germinales de neurones chez c. elegans

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Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiser le nœud et la notochorde plaque en Gastrulating des embryons de souris à l’aide de la microscopie électronique à balayage et toute monture Immunofluorescence

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Microscopie isotrope en feuilles légères et analyse automatisée de la lignée cellulaire au catalogue Caenorhabditis elegans embryogenèse avec résolution subcellulaire

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Mesure du sperme guidage et motilité dans le Caenorhabditis elegans hermaphrodite appareil de reproduction

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...