Name: studying oxidative stress caused by the mitis group streptococci in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-03-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Wir danken Dr. Bing-Yan Wang, Dr. Gena Tribble (The University of Texas School of Dentistry), Dr. Richard Lamont (University of Louisville, School of Dentistry) und Dr. Samuel Shelburne (MD Anderson Cancer Center) für die Bereitstellung von Labor- und klinische Stämme von Mitis Gruppe Streptokokken. Wir danken Dr. Keith Blackwell (Department of Genetics, Harvard Medical School) für die C. Elegans -Stämme. Zu guter Letzt danken wir Dr. Danielle Garsin und ihr Labor (The University of Texas, McGovern Medical School) für die Bereitstellung von Reagenzien und Wurm-Stämme zur Durchführung der Studie. Einige Stämme der Wurm erbrachten die CGC vom NIH Büro Infrastruktur Forschungsprogramme (P40 OD010440) gefördert wird.

1. Vorbereitung von deinem Agarplatten (Todd Hewitt Hefeextrakt)
<ol><li>Fügen Sie für 1 L Medien 30 g Todd Hewitt Pulver, 2 g Hefeextrakt und 20 g Agar, ein 2 L-Erlenmeyerkolben hinzu. Der Inhalt des Kolbens 970 mL entionisiertem Wasser hinzu und bestehen aus einer Stir Bar. Autoklaven der Medien bei einer Temperatur von 121 ° C und Druck von 15 lb/Inch2 für 30 min. Danach legen Sie die Medien auf einem Teller rühren und zur Kühlung mit schonenden rühren lassen.</li>
	<li>Gießen Sie die Medien entsp...

<ol>
	<li>Human Microbiome Project, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+diversity+of+the+healthy+human+microbiome.">Structure, function and diversity of the healthy human microbiome.</a> Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).</li><li>Mitchell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+mitis:+walking+the+line+between+commensalism+and+pathogenesis.">Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis.</a> Molecular Oral Microbiology. 26 (2), 89-98 (2011).</li><li>Dyson, C., Barnes, R. A., Harrison, G. 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Die beschriebenen Methoden können verwendet werden, für andere pathogenen Bakterien wie Enterococcus Faecium, produziert auch H2O2 unter anaeroben angebaut oder mikroaerophil Bedingungen26. In der Regel für die meisten pathogenen Organismen dauert es mehrere Tage bis Wochen dauern die Überlebens-Assays. Jedoch konnte aufgrund der robusten Produktion von H2O2 von den Mitgliedern des Arbeitskreises Mitis, diese Tests innerhalb von 5-6 h unter ...

Mitis Gruppe Streptokokken sind menschliche Kommensalen der oropharyngealen Hohlraum1. Diese Organismen können jedoch diese Nische zu entkommen und eine Vielzahl von invasiven Erkrankungen2verursachen. Infektionen durch diese Mikroorganismen gehören Bakteriämie, Endokarditis und Orbitaphlegmone2,3,4,5,6. Darüber hinaus entstehen sie als Erreger von Infektionen der Blutbahn in immungeschwächten, neutropenisch und Krebspatienten, die Chemotherapie5,7,8,9 durchlaufen haben .
Die Mechanismen, die zugrunde liegenden Mitis Gruppe Pathogenese ist dunkel, weil einige Virulenzfaktoren identifiziert wurden. Mitis Gruppe ist bekannt, H2O2, zu produzieren, die gezeigt hat, eine wichtige Rolle in oralen mikrobiellen Lebensgemeinschaften10spielen. Mehrere Studien haben vor kurzem eine Rolle für H2O2 als ein Zytotoxin hervorgehoben, die Epithelzelle Tod11,12induziert. S. Lungenentzündung, die zu dieser Gruppe gehört hat gezeigt, dass hohe Konzentrationen von H2O2 zu produzieren, die DNA-Schädigung und Apoptose in alveoläre Zellen13induziert. Mit einer akuten Lungenentzündung Tiermodell, zeigten die gleichen Forscher, dass die Produktion von H2O2 von den Bakterien einen Virulenz Vorteil verschafft. Studien über Pneumokokken Meningitis haben auch gezeigt, dass dieser Erreger abgeleitet H2O2 wirkt synergistisch mit Pneumolysin neuronale Zelle Tod14auslösen. Diese Beobachtungen stellen klar, dass H2O2 produziert von dieser Gruppe von Bakterien für wichtig, dass ihre Pathogenität.
Interessanterweise hat sich auch gezeigt, dass Mitglieder der Mitis S. Mitis und S. Oralis verursachen Tod von den Nematoden C. Elegans über die Herstellung von H2O215,16. Diese freilebenden Nematoden diente als ein einfaches, genetisch gefügig Modell, viele biologische Prozesse zu studieren. Vor kurzem hat der Wurm ein Modell zur Wirt-Pathogen Interaktionen17,18entwickelt. Mehrere Studien haben darüber hinaus die Bedeutung des Studiums oxidativen Stress mit diesem Organismus19,20,21hervorgehoben. Seine kurzen Lebenszyklus, Knockdown Gene des Interesses von RNAi und Verwendung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP)-fused Reporter, Genexpression zu überwachen sind einige der Attribute, die eine attraktives Modellsystem machen. Noch wichtiger ist, sind die Wege, die Regulierung von oxidativem Stress und angeborene Immunität in der Wurm mit Säugetieren20,22hoch konserviert.
In diesem Protokoll wird gezeigt wie C. Elegans zu verwenden, um die Pathogenität, verursacht durch Streptokokken abgeleitet H2O2aufzuklären. Ein modifizierte überleben Assay gezeigt, und Mitglieder des Arbeitskreises Mitis sind in der Lage, schnell die Würmer zu töten über die Produktion von H2O2. Mit Mitgliedern des Arbeitskreises Mitis, eine nachhaltige biologische Quelle von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), im Gegensatz zu chemischen Quellen erfolgt, die oxidativen Stress in den Würmern zu induzieren. Darüber hinaus können die Bakterien besiedeln die Würmer schnell, wodurch für H2O2 direkt ausgerichtet werden, um die Darmzellen (im Vergleich zu anderen Quellen, die mehrere Hindernisse zu überqueren). Der Test wird überprüft, entweder (1) durch Bestimmung das Überleben der Mutante Skn-1 oder 2) durch Skn-1 mit RNAi in Worms im Verhältnis zu der N2 Wildtyp und Vektor-Steuerelement behandelt Würmer umzuwerfen. SKN-1 ist eine wichtige Transkriptionsfaktor, die die oxidativen Stress-Reaktion in C. Elegans23,24,25regelt. Zusätzlich zu überleben-Assays ist Wurm verwendet ein Stamm mit dem Ausdruck eines SKN-1 b/C::GFP transgenen Reporters zur Aktivierung der oxidativen Stress Reaktion über die Produktion von H2O2 Überwachung von Mitis-Gruppe.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:845px;" width="845">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Media and chemicals</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Bacto peptone&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0118-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Bacto Todd Hewitt Broth</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0492-17-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD BBL Sheep Blood, Defibrinated&#160;&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B11947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Difco Agar&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0145-17-0</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Difco LB Broth</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0446-17-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blood agar (TSA with Sheep Blood)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R01200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Carbenicillin</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP26481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Catalase&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C1345-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ICN10138201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">IPTG</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MP21021012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Nystatin</td>
			<td style="width:179px;">Acros organics</td>
			<td style="width:119px;">AC455500050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium chloride&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SS266-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">8.25% Sodium Hypochlorite</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Streptomycin Sulfate&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP910-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Tetracyclin</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">87128-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">(&#8722;)-Tetramisole hydrochloride</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L9756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1422-500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Consumables&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-565-269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 x 10 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">No. 1.5&#160; 18 mm X 18 mm Cover Slips</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-541A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-544-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Software&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Prism</td>
			<td style="width:179px;">Graphpad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Bacterial Strains</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. oralis ATCC 35037</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. mitis ATCC 49456</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. gordonii DL1 Challis&#160;&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">E. coli OP50</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">E. coli HT115</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Worm Strains</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Strain</td>
			<td style="width:179px;">Genotype</td>
			<td style="width:119px;">Transgene</td>
			<td>Source</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">N2</td>
			<td style="width:179px;">C. elegans wild isolate</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">EU1</td>
			<td style="width:179px;">skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">LD002</td>
			<td style="width:179px;">IdIs1</td>
			<td style="width:119px;">SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)</td>
			<td>Keith Blackwell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying oxidative stress caused by the mitis group streptococci in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis Elegans (C. Elegans), eine freilebende Nematode, entstanden als ein attraktives Modell für Wirt-Pathogen Interaktionen zu untersuchen. Die vorgestellte Protokoll verwendet dieses Modell um die Pathogenität von Mitis Gruppe Streptokokken über die Herstellung von H2O2verursacht zu bestimmen. Mitis Gruppe Streptokokken sind eine neue Bedrohung, die vielen menschlichen Krankheiten wie Bakteriämie, Endokarditis und Orbitaphlegmone verursachen. Hier beschriebenen entsteht ein Protokoll, um das Überleben dieser Würmer als Reaktion auf H2O2 festzustellen durch diese Gruppe von Krankheitserregern. Mithilfe der gen Skn-1 Codierung für einen Transkriptionsfaktor oxidativen Stress Reaktion, wird es gezeigt, dass dieses Modell wichtig ist für die Identifizierung von Host-Genen, die gegen Streptokokken-Infektion sind. Darüber hinaus wird gezeigt, dass Aktivierung der oxidativen Stress-Reaktion in Gegenwart dieser Erreger mit einem transgenen Reporter Wurm Stamm, in der SKN-1, grün fluoreszierendes Protein (GFP) verschmolzen wird überwacht werden kann. Diese Tests bieten die Möglichkeit, die oxidativen Stress-Reaktion auf H2O2 abgeleitet von einer biologischen Quelle im Gegensatz zu exogen studieren reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS) Quellen hinzugefügt.

Mitglieder der der Mitis Gruppe S. Mitis, S. Oralis und S. Gordonii schnell getötet, die Würmer, im Gegensatz zu S. Mutans, S. Salivarius und nicht-pathogenen E. Coli OP50(Abbildung 3). Die mediane Überlebenszeit für S. Mitis, S. Oralis und S. Gordonii betrug 300 min., 300 min. bzw. 345 min.. Um festzustellen, ob die Tötung durch H2O2ve...

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Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans ist ein hervorragendes Modell, Wirt-Pathogen Interaktionen zu zergliedern. Hier beschrieben, ist ein Protokoll zu infizieren den Wurm mit den Mitgliedern der Gruppe Streptokokken Mitis und Aktivierung der oxidativen Stress-Reaktion gegen H2O2 produziert von dieser Gruppe von Organismen zu bestimmen.

Studium der oxidativen Stress verursachten Mitis Gruppe Streptokokken in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

In diesem Protokoll zeigen wir, wie man eine freie Lebensmethode c. elegans verwendet, um die Pathogenität zu klären, die durch Wasserstoffperoxid verursacht wird, das über Mitis Group streptococci erzeugt wird. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass wir Pathogenität und die Aktivierung von Stressreaktionen im Wurm studieren können, indem wir eine nachhaltige biologische Quelle von reaktiven Sauerstoffspezies im Gegensatz zu chemischen Quellen verwenden Für einen Liter Medien 30g Todd Hewitt Pulver, 2g Hefeextrakt und 20g Ager zu einem 2-Liter-Erlin Myer Kolben hinzufügen.970ml entionisiertes Wasser in den Inhalt des Kolbens geben und in eine Rührstange geben. Verwenden Sie Aluminiumfolie, um die Öffnung zu bedecken. Autoclave die Medien in der Flasche bei einer Temperatur von 121 Grad Celsius und Druck von 15 Pfund pro Quadratzoll für 30 Minuten.Danach den Kolben auf eine Rührplatte stellen, um ihn mit sanftem Rühren abzukühlen. Unter einer laminaren Haube, gießen Sie die Medien in entsprechend große, sterile Petri-Gerichte. Lassen Sie die Medien 2 Stunden trocknen.Danach lagern sie die Platten bei 4 Grad Celsius für bis zu 1 Monat. Vor der Zubereitung von Mitis Group Streptokokken, erwärmen Sie die THY AgarPlatten in einem Brutkasten auf 37 Grad Celsius. Danach verwenden Sie eine sterile Schleife, um gewünschte Stämme von Strepticocci auf den Stellen auszustreichen.Dann legen Sie die Teller in ein Kerzenglas und bebrüten das Glas bei 37 Grad Celsius über Nacht für etwa 18 Stunden, um eine mikroerophile Umgebung zu schaffen. Am nächsten Tag, entfernen Sie die Platten aus dem Kerzenglas und verwenden Sie eine sterile Schleife, um isolierte Kolonien zu pflücken. 15 ml sterile konische Röhrchen mit 2 ml THY-Brühe impfen.Schließen Sie die Kappen fest und bebrüten Sie die Rohre bei 37 Grad Celsius unter statischen Bedingungen. Vorwärmte THY-Platten in einem Inkubator auf 37 Grad Celsius fügen 50 Mikroliter Lösung mit 1000 Einheiten Kataalase auf die THY-Platte. Verwenden Sie einen sterilen Streuer, um die Katalawase-Lösung zu verteilen und lassen Sie die Platten auf der laminaren Strömungshaube für 30 Minuten trocknen.Um die Platten mit den Streptokokkenstämmen auszusäen, verwenden Sie eine Pipette, um 80 Mikroliter über Nacht angebaute Kulturen auf die Platte zu bringen und verwenden Sie einen sterilen Streuer, um die Bakterien vollständig über die Agaroberfläche zu verteilen. Die Teller bei 37 Grad Celsius in einem Kerzenglas über Nacht bebrüten. Als Kontrolle, auf zwei NGM-Platten, fügen Sie 80 Mikroliter der über Nacht gewachsenen Kulturen von E.coli OP-50 für die Aussaat.Die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius bebrüten. Am nächsten Tag die Teller aus dem Kerzenglas entfernen und die Platten auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Mit einem sterilen Wurmpick 30 L4-Larven von den NGM-Futterplatten auf die streptokokkensamen THY-Platten übertragen.Inkubieren Sie die Platten bei 25 Grad Celsius. Zählen Sie unter einem Sezierendes Mikroskop die Anzahl der lebenden und toten L4-Larven auf jeder Platte zu mehreren Zeitpunkten. Verwenden Sie die sterile Wurmpick, um die Würmer vorsichtig zu prod und festzustellen, ob sie tot oder lebendig sind.Zuerst, punkten Sie die Würmer als tot oder leben alle 30 Minuten. Wenn Würmer schnell zu sterben beginnen, punkten Sie sie im 15-Minuten-Takt. Der Test dauert 5 bis 6 Stunden.Danach wiederholen Sie das Experiment noch zwei Weitere Male. Um das Agarose-Pad vorzubereiten, kleben Sie Labtape längs entlang zweiglaser Dias. Dadurch wird die Dicke der Agarose-Pads bestimmt.Platzieren Sie eine saubere Glasrutsche zwischen den beiden verklebten Dias. Lösen Sie Agrose in entionisiertem Wasser, um 2 Gewichtsvolumenprozent zu machen und erhitzen Sie die Lösung in einer Mikrowelle. Verwenden Sie eine Pipette, um 100 Mikroliter geschmolzene Agarose in der Mitte des sauberen Schlittens zu platzieren.Legen Sie sofort eine weitere saubere Glasrutsche auf die geschmolzene Agarose und drücken Sie vorsichtig nach unten, um ein Pad zu machen. Lassen Sie die Agarose verfestigen und entfernen Sie anschließend die obere Folie. Das Agarose-Pad ist einsatzbereit.Vorwarme THY-Platten auf 37 Grad Celsius. Säen Sie die Platten mit einem Streptokokken-Stämme, wie zuvor in den Überlebenstests getan. Samen 3 NGM Platten mit E-coli OP-50 als Kontrolle und inkubieren bei 37 Grad Celsius über Nacht.Am nächsten Tag die Platten auf Raumtemperatur abkühlen. Verwenden Sie den M9W-Puffer, um L4-Larven aus NGM- oder NGM RNAi-Zuführungsplatten in 15 ml konische Röhrchen zu waschen. Drehen Sie die Rohre bei 450 mal g, für eine Minute in einer Zentrifuge.Dekantieren Sie den Überstand und fügen Sie 10 ml M9W in jede Tube. Wiederholen Sie den Zentrifugalschritt noch dreimal. Die Würmer in 250 Mikroliter M9W wieder aufhängen und drei 5 Mikroliter Tropfen der Schneckensuspension auf einen sauberen Petrischalendeckel legen.Schätzen Sie unter einem Sezierendes Mikroskop die Anzahl der Würmer pro Mikroliter. Mit einer Pipette ca. 100 L4-Larven zu jedem THY Streptokokken-Samen und NGM E.coli-Samenplatten hinzufügen. Verwenden Sie drei Platten pro Bakterienstamm.Inkubieren Sie die Platten für 2 bis 3 Stunden bei 25 Grad Celsius. Danach entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator. Waschen Sie sie mit M9W und sammeln Sie die Würmer in 15ml konischen Schläuchen.Waschen Sie die Würmer dreimal wie zuvor im Zentrifugalschritt. Entfernen Sie den größten Teil des M9W durch Aspiration. Und fügen Sie 500 Mikroliter M9W mit 2 Millimolaren Natriumazid oder Tetramisolehydrochlorid in das Wurmpellet zur Anästhesie.Inkubieren Sie das Rohr mit Wurmpellets bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Dann 15 Mikroliter der Schneckensuspension auf ein vorbereitetes Agorosepad fallen lassen. Visualisieren Sie unter einem Fluoreszenzmikroskop die Lokalisierung von skn-1 unter Verwendung von Fitzy- und Dappy-Filtern.Bildwürmer bei 10-facher und 20-facher Vergrößerung. Bewerten Sie die Würmer auf der Grundlage von drei Lokalisationsebenen;niedrige Lokalisierung, bei der keine nukleare Lokalisierung beobachtet wird, mittlere Lokalisierung, mit SKN 1 BCGFP im Vorderen oder Hinterteil des Wurms und hoher Lokalisierung, wo die nukleare Lokalisierung von skn-1 BCGFP in allen Darmzellen beobachtet wird. In diesem Experiment töteten Mitglieder der Mitis-Gruppe die Würmer schnell, im Gegensatz zu S.mutans, S.salivarius und nicht pathogenen E.coli OP-50.Als die Kataalase zu THY ager ergänzt wurde, wurde das Töten der Würmer abgeschafft. Der Tod der Würmer wurde auf der Delta spxB mutierten Sorte im Vergleich zu den Wildtyp- und Komplimentstämmen nicht beobachtet. Diese Daten deuten darauf hin, dass das von der Mitis-Gruppe produzierte Wasserstoffperoxid die Tötung der Würmer vermittelt.Im Vergleich zu den mit Vektorsteuerung behandelten Würmern wurde eine signifikante Abnahme des Überlebens der skn-1 Knockdown-Würmer beobachtet. Ein ähnlicher tötender Phänotyp wurde mit dem skn-1 Mutantenstamm und den N2-Wildwürmern beobachtet. Dies zeigt, dass skn-1 das Überleben der Würmer auf der Mitis-Gruppe beeinflusst.Die Lokalisierung von skn-1 BCGFP wurde bei Würmern beobachtet, die den Wildtyp-N-Kompliment-Stämmen ausgesetzt waren und nicht als Reaktion auf den Delta spxB mutierten Stamm der S cordonae. Nachdem Komponenten des P38-Kartenkinasewegs abgerissen wurden, wurde eine reduzierte Lokalisation von skn-1 BCGFP und knockdown behandelten Würmern im Verhältnis zu den vektorkontrollbehandelten Würmern beobachtet. Durch die Verwendung der Streptokokken c.Elegans System, die Auswirkungen von Wasserstoffperoxid auf endoplasmatische verticulare Belastung, mitochondriale Schäden, Mitophogy, und Tophogie können weiter untersucht werden. Darüber hinaus können Mechanismen identifiziert werden, durch die Wasserstoffperoxid als Virilszenzfaktor wirkt, um Immunreaktionen auszulösen, indem Kernprozesse der Zelle gestört werden.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Umfassende Beurteilung der Keimbahn Chemical Toxicity Mit der Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Räumliche und zeitliche Analyse von Active ERK in der<em&gt; C. elegans</em&gt; Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilisierung von Caenorhabditis Elegans analysieren intrazellulären Transport in Neuronen

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Anwendung von RNAi und Hitze-Schock-induzierte Transkription Faktor Ausdruck zu programmieren Keimzellen Neuronen in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Beurteilung der lysosomalen Alkalisierung in den Darm von Leben Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computergestützte Analyse der Keimbahn Caenorhabditis Elegans , die Verteilung der Kerne, Proteine und das Zytoskelett zu studieren

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

A Mini-Invasive Internal Fixation Technique for Studying Immobilization-Induced Knee Flexion Contracture in Rats

Eine Mini-invasive interne Fixierungstechnik zum Studium der Immobilisierung-induzierten Knieflexionskontraktur bei Ratten

Joint contracture, resulting from a prolonged joint immobilization, is a common complication in orthopedics. Currently, utilizing an internal fixation to ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Isotrope Licht-Sheet-Mikroskopie und automatisierte Zelllineage-Analysen zu Katalog-Caenorhabditis elegans Embryogenese mit subzellulärer Auflösung

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Messung der Spermienführung und-beweglichkeit innerhalb der Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...