Name: studying oxidative stress caused by the mitis group streptococci in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-03-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Si ringraziano il Dr. Bing-Yan Wang, Dr. Gena Tribble (The University of Texas, scuola di odontoiatria), Dr. Richard Lamont (Università di Louisville, scuola di odontoiatria) e Dr. Samuel Shelburne (MD Anderson Cancer Center) per la fornitura di laboratorio e ceppi clinici di gli streptococchi di gruppo mitis. Ringraziamo anche il dottor Keith Blackwell (dipartimento di genetica, Harvard Medical School) per i ceppi di c. elegans . Infine, ringraziamo Dr. Danielle Garsin e suo laboratorio (l'Università del Texas, McGovern Medical School) per la fornitura di reagenti e ceppi di vite senza fine per condurre lo studio. Alcuni ceppi di vite senza fine sono stati forniti da CGC, che è finanziato dall'ufficio di NIH di programmi di ricerca dell'infrastruttura (P40 OD010440).

1. preparazione dei tuoi piatti di Agar (Estratto di lievito Todd-Hewitt)
<ol><li>Per 1 L di media, aggiungere 30 g di polvere di Todd-Hewitt, 2 g di Estratto di lievito e 20 g di agar per un matraccio di Erlenmeyer 2L. Aggiungere il contenuto del matraccio 970 mL di acqua deionizzata e includere una barra per l'agitazione. Sterilizzare in autoclave i media ad una temperatura di 121 ° C e pressione di 15 libbre/pollice2 per 30 min. Successivamente, impostare il media su una zolla di mescolare e raffreddare ...

<ol>
	<li>Human Microbiome Project, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+diversity+of+the+healthy+human+microbiome.">Structure, function and diversity of the healthy human microbiome.</a> Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).</li><li>Mitchell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+mitis:+walking+the+line+between+commensalism+and+pathogenesis.">Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis.</a> Molecular Oral Microbiology. 26 (2), 89-98 (2011).</li><li>Dyson, C., Barnes, R. A., Harrison, G. 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I metodi descritti possono essere utilizzati per altri batteri patogeni quali Enterococcus faecium, che produce anche H2O2 cresciuti sotto anaerobico o microaerofili condizioni26. In genere, per più germi patogeni, ci vogliono diversi giorni per settimane per completare le analisi di sopravvivenza. Tuttavia, a causa della produzione robusta di H2O2 dai membri del gruppo di mitis, queste analisi potrebbero essere completate entro 5-6 h nelle con...

Gli streptococchi del gruppo mitis sono commensals umano della cavità orofaringea1. Tuttavia, questi organismi possono sfuggire questa nicchia e causano una serie di malattie invasive2. Le infezioni causate da questi microrganismi sono batteriemia, endocardite e cellulite orbitale2,3,4,5,6. Inoltre, essi stanno emergendo come causativi agenti di infezioni del torrente sanguigno in immunocompromessi, neutropenic e malati di cancro sottoposti a chemioterapia5,7,8,9 .
I meccanismi di patogenesi di gruppo fondo mitis è oscuro, perché sono stati identificati alcuni fattori di virulenza. Il gruppo di mitis è noto per la produzione di H2O2, che ha dimostrato di giocare un ruolo importante nella comunità microbica orale10. Più recentemente, diversi studi hanno evidenziato un ruolo per H2O2 come una citotossina che induce la morte delle cellule epiteliali11,12. Polmonite S., che appartiene a questo gruppo, ha dimostrato di produrre alti livelli di H2O2 che induce il danno del DNA e l'apoptosi in cellule alveolari13. Utilizzando un modello animale di polmonite acuta, gli stessi ricercatori hanno dimostrato che la produzione di H2O2 dai batteri conferisce un vantaggio di virulenza. Studi su meningite pneumococcal hanno inoltre dimostrato che patogeno-derivati H2O2 agisce in sinergia con pneumolysin per innescare un neurone delle cellule morte14. Queste osservazioni stabiliscono chiaramente che H2O2 prodotto da questo gruppo di batteri è importante per loro patogenicità.
È interessante notare che, esso ha anche dimostrato che gruppo del mitis mitis dello s. e s. oralis causare la morte della del nematode c. elegans attraverso la produzione di H2O215,16. Questo nematode dissipato è stato utilizzato come un modello semplice, geneticamente trattabile per studiare molti processi biologici. Più recentemente, il worm è emerso come un modello per lo studio di interazioni ospite-patogeno17,18. Inoltre, diversi studi hanno evidenziato l'importanza dello studio dello stress ossidativo tramite questo organismo19,20,21. Suo ciclo di vita breve, la capacità di atterramento geni di interesse di RNAi e l'uso della proteina fluorescente verde (GFP)-reporter fuso per monitorare l'espressione genica sono alcuni degli attributi che lo rendono un sistema modello attraente. Ancora più importante, le vie che regolano lo stress ossidativo e l'immunità innata nel verme sono altamente conservate con mammiferi20,22.
In questo protocollo, è dimostrato come utilizzare c. elegans per delucidare la patogenicità causata da streptococco-derivati H2O2. Un'analisi di sopravvivenza modificate è mostrata, e membri del gruppo mitis sono in grado di uccidere i vermi rapidamente tramite la produzione di H2O2. Utilizzando i membri del gruppo di mitis, una costante fonte biologica di specie reattive dell'ossigeno (ROS) è prevista, al contrario di fonti chimiche che inducono lo sforzo ossidativo nei vermi. Inoltre, i batteri sono in grado di colonizzare rapidamente, i vermi che permette per H2O2 essere direttamente indirizzati alle cellule intestinali (rispetto ad altre fonti che devono attraversare diverse barriere). Il dosaggio è convalidato o 1) per determinare la sopravvivenza del ceppo mutante skn-1 o 2) battendo giù skn-1 mediante RNAi in worms rispetto la N2 selvaggio-tipo e vettoriale controllo trattato worms. SKN-1 è un fattore di trascrizione importante che regola la risposta allo stress ossidativo in c. elegans23,24,25. Oltre alle analisi di sopravvivenza, un ceppo di vite senza fine che esprimono un reporter transgenico SKN-1B/C::GFP viene utilizzato per monitorare l'attivazione della stress ossidativo risposta tramite la produzione di H2O2 dal gruppo mitis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:845px;" width="845">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Media and chemicals</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Bacto peptone&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0118-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Bacto Todd Hewitt Broth</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0492-17-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD BBL Sheep Blood, Defibrinated&#160;&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B11947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Difco Agar&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0145-17-0</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Difco LB Broth</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0446-17-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blood agar (TSA with Sheep Blood)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R01200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Carbenicillin</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP26481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Catalase&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C1345-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ICN10138201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">IPTG</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MP21021012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Nystatin</td>
			<td style="width:179px;">Acros organics</td>
			<td style="width:119px;">AC455500050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium chloride&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SS266-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">8.25% Sodium Hypochlorite</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Streptomycin Sulfate&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP910-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Tetracyclin</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">87128-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">(&#8722;)-Tetramisole hydrochloride</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L9756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1422-500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Consumables&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-565-269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 x 10 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">No. 1.5&#160; 18 mm X 18 mm Cover Slips</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-541A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-544-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Software&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Prism</td>
			<td style="width:179px;">Graphpad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Bacterial Strains</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. oralis ATCC 35037</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. mitis ATCC 49456</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. gordonii DL1 Challis&#160;&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">E. coli OP50</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">E. coli HT115</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Worm Strains</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Strain</td>
			<td style="width:179px;">Genotype</td>
			<td style="width:119px;">Transgene</td>
			<td>Source</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">N2</td>
			<td style="width:179px;">C. elegans wild isolate</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">EU1</td>
			<td style="width:179px;">skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">LD002</td>
			<td style="width:179px;">IdIs1</td>
			<td style="width:119px;">SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)</td>
			<td>Keith Blackwell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying oxidative stress caused by the mitis group streptococci in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (c. elegans), un nematode dissipato, è emerso come un modello interessante per studiare le interazioni ospite-patogeno. Il protocollo presentato utilizza questo modello per determinare la patogenicità causata da streptococchi gruppo mitis attraverso la produzione di H2O2. Gli streptococchi di gruppo mitis sono una minaccia emergente che causano molte malattie umane quali batteriemia, endocardite e cellulite orbitale. Descritto qui è un protocollo per determinare la sopravvivenza di questi vermi in risposta a H2O2 prodotto da questo gruppo di agenti patogeni. Usando il skn-1 del gene che codifica per un fattore di trascrizione di risposta di stress ossidativo, esso è indicato che questo modello è importante per l'identificazione di geni ospitanti che sono essenziali contro l'infezione streptococcica. Inoltre è dimostrato che l'attivazione della risposta allo stress ossidativo può essere monitorato in presenza di questi patogeni utilizzando un ceppo di vite senza fine di reporter transgenici, in cui viene fuso SKN-1 proteina fluorescente verde (GFP). Queste analisi forniscono la possibilità di studiare la risposta allo stress ossidativo di H2O2 derivato da una fonte biologica rispetto a esogenicamente aggiunto fonti (ROS) di specie reattive dell'ossigeno.

Gruppo del mitis S. mitis, S. oralis e S. gordonii rapidamente uccisi i vermi, al contrario di S. mutans, S. salivarius e non patogeni di e. coli OP50 (Figura 3A). La sopravvivenza mediana per S. mitis, S. oralis e S. gordonii era 300 min, min 300 e 345 min, rispettivamente. Per determinare se l'uccisione è stata mediata dalle H2O2, catalas...

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Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Il nematode Caenorhabditis elegans è un eccellente modello per sezionare interazioni ospite-patogeno. Un protocollo per infettare il worm con membri degli streptococchi gruppo mitis e determinare l'attivazione della risposta di sforzo ossidativo contro H2O2 prodotto da questo gruppo di organismi è descritto qui.

Studiando lo Stress ossidativo causato dagli streptococchi di gruppo Mitis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

In questo protocollo dimostriamo come utilizzare un metodo di vita libera c. elegans per chiarire la patogenicità causata dal perossido di idrogeno prodotto tramite gli streptococchi del Gruppo Mitis. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo studiare la patogenicità e l'attivazione delle risposte allo stress nel verme utilizzando una fonte biologica sostenibile di specie reattive dell'ossigeno rispetto alle fonti chimiche Per un litro di media aggiungere 30g di polvere di Todd Hewitt, 2 g di estratto di lievito e 20g di ager a un pallone Erlin Myer da 2 litri.Aggiungere 970 ml di acqua deionizzata al contenuto del pallone e mettere in una barra di agitazione. Utilizzare un foglio di alluminio per coprire l'apertura. Autoclave del supporto nel pallone a una temperatura di 121 gradi Celsius e pressione di 15 libbre per pollice quadrato per 30 minuti.Successivamente impostare il pallone su una piastra di agitazione per raffreddare con delicata agitazione. Sotto un cappuccio laminare, versare il supporto in piastre di Petri sterili di dimensioni appropriata. Lasciare asciugare il supporto per 2 ore.Successivamente conservare le piastre a 4 gradi Celsius per un massimo di 1 mese. Prima della preparazione degli streptococchi del Gruppo Mitis, riscaldare le piastre di agar THY in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Dopo di che utilizzare un ciclo sterile per strisciare i ceppi desiderati di strepticocci sui luoghi.Quindi mettere i piatti in un barattolo di candele e incubare il barattolo a 37 gradi Celsius durante la notte per circa 18 ore per fornire un ambiente microerofilo. Il giorno dopo, rimuovere i piatti dal barattolo delle candele e utilizzare un anello sterile per raccogliere colonie isolate. Inoculare 15 ml di tubi conici sterili contenenti 2 ml di brodo THY.Chiudere i tappi stretti e incubare i tubi a 37 gradi Celsius in condizioni statiche. Le piastre THY pre-calde in un'incubatrice a 37 gradi Celsius aggiungono 50 microlitri di soluzione contenenti 1000 unità di catalasi sulla piastra THY. Utilizzare uno spargitore sterile per stendere la soluzione di catalasi e lasciare asciugare le piastre sulla cappa di flusso laminare per 30 minuti.Per seminare le piastre con i ceppi di streptococco, utilizzare una pipetta per aggiungere 80 microlitri di colture coltivate durante la notte al piatto e utilizzare uno spargitore sterile per diffondere completamente i batteri sulla superficie dell'agar. Incubare i piatti a 37 gradi Celsius in un barattolo di candele durante la notte. Come controllo, su due piastre NGM, aggiungere 80 microlitri di colture coltivate durante la notte di E.coli OP-50 per la semina.Incubare le piastre a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, rimuovere le piastre dal barattolo delle candele e lasciare raffreddare le piastre a temperatura ambiente. Utilizzando un piccone di vermi sterile, trasferire 30 larve L4 dalle piastre di alimentazione NGM alle piastre THY sementi di streptococco.Incubare le piastre a 25 gradi Celsius. Al microscopio sezionato, contare il numero di larve L4 vive e morte su ogni piatto in diversi punti di tempo. Utilizzare il piccone del verme sterile per pungere delicatamente i vermi e determinare se sono morti o vivi.Inizialmente, segna i vermi come morti o vivi ogni 30 minuti. Quando i vermi iniziano rapidamente a morire, segnali a intervalli di 15 minuti. Il test richiederà da 5 a 6 ore per essere completato.Dopodi tempo, ripeti l'esperimento altre due volte. Per preparare il tampone di agarosio, attaccare il labtape longitudinalmente lungo due scivoli di vetro. Questo determinerà lo spessore dei cuscinetti di agarosio.Posizionare uno scivolo di vetro pulito tra le due diapositive nastrate. Sciogliere l'agarosio in acqua deionizzata per fare il 2 per cento del volume di peso e riscaldare la soluzione in un forno a microonde. Utilizzare una pipetta per posizionare 100 microlitri di agarosio fuso al centro dello scivolo pulito.Posizionare immediatamente un altro scivolo di vetro pulito sopra l'agarosio fuso e premere delicatamente verso il basso per fare un tampone. Lasciare solidificare l'agarosio e successivamente rimuovere la diapositiva superiore. Il tampone di agarosio è pronto per l'uso.Pre-riscaldare i tuoi piatti a 37 gradi Celsius. Seminare le piastre con ceppi di streptococco come fatto in precedenza nei test di sopravvivenza. Seme 3 piastre NGM con E-coli OP-50 come controllo e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte.Il giorno dopo, raffreddare i piatti a temperatura ambiente. Utilizzare il tampone M9W per lavare le larve L4 dalle piastre di alimentazione NGM o NGM RNAi in tubi conici da 15 ml. Ruotare i tubi a 450 volte g, per un minuto in una centrifuga.Decantare il supernatante e aggiungere 10 ml di M9W ad ogni tubo. Ripetere il passo centrifugo altre tre volte. Sospendere di nuovo i vermi in 250 microlitri di M9W e posizionare tre gocce da 5 microlitri della sospensione del verme su un coperchio della piastra di Petri pulito.Al microscopio sezionato, stimare il numero di vermi per microlitro. Utilizzando una pipetta, aggiungere circa 100 larve L4 ad ogni piastre sementi di STREPTOCOCCUS THY e piastre sementi NGM E.coli. Utilizzare tre piastre per ceppo di batteri.Incubare le piastre per 2-3 ore a 25 gradi Celsius. Successivamente, rimuovere le piastre dall'incubatore. Lavarli con M9W e raccogliere i vermi in tubi conici da 15 ml.Lavare i vermi tre volte come fatto in precedenza nella fase centrifuga. Rimuovere la maggior parte dell'M9W per aspirazione. E aggiungere 500 microlitri di M9W contenenti 2 azide di sodio millimolare o cloridrato di tetramisolo al pellet di verme per l'anestesia.Incubare il tubo con pellet di verme a temperatura ambiente per 15 minuti. Quindi, lascia cadere 15 microlitri della sospensione del verme su un tampone di agorose preparato. Al microscopio fluorescente, visualizza la localizzazione dello skn-1 utilizzando filtri Fitzy e Dappy.Vermi immagine a 10 volte e 20 volte gli ingrandimenti. Segnare i vermi in base a tre livelli di localizzazione;bassa localizzazione, dove non si osserva localizzazione nucleare, localizzazione media, con SKN 1 BCGFP nella parte anteriore o posteriore del verme e elevata localizzazione, dove si osserva la localizzazione nucleare di SKN-1 BCGFP in tutte le cellule intestinali. In questo esperimento, i membri del Gruppo Mitis uccisero rapidamente i vermi, al contrario di S.mutans, S.salivarius e E.coli OP-50 non patogeno.Quando la catalasi fu integrata al THY ager, l'uccisione dei vermi fu abolita. La morte dei vermi non è stata osservata sul ceppo mutante delta spxB rispetto ai ceppi di wild-type e complimenti. Questi dati suggeriscono che il perossido di idrogeno prodotto dal Gruppo Mitis media l'uccisione dei vermi.Una significativa diminuzione della sopravvivenza dei vermi knockdown skn-1 è stata osservata rispetto ai vermi trattati con controllo vettoriale. Un fenotipo di uccisione simile è stato osservato con il ceppo mutante skn-1 e i vermi di tipo selvatico N2. Ciò dimostra che lo skn-1 influenza la sopravvivenza dei vermi sul gruppo Mitis.La localizzazione dello skn-1 BCGFP è stata osservata nei vermi esposti ai ceppi di N-complimento di tipo selvatico e non in risposta al ceppo mutante Delta spxB delle cordone S. Dopo che i componenti della via della chinasi cartografica P38 sono stati abbattuti, è stata osservata una ridotta localizzazione di SKN-1 BCGFP e vermi trattati con abbattimento, rispetto ai vermi trattati con controllo vettoriale. Utilizzando gli streptococchi c.sistema elegans, gli effetti del perossido di idrogeno sullo stress verticolare endoplasmatico, sui danni mitocondriali, sulla mitofogia e sulla tophogy possono essere ulteriormente studiati. Inoltre, possono essere identificati meccanismi attraverso i quali il perossido di idrogeno agisce come fattore di virilescenza per suscitare risposte immunitarie interrompendo i processi core della cellula.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Valutazione completa della linea germinale Chemical Tossicità Utilizzando il nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

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Applicazione di RNAi ed espressione di fattore di trascrizione indotta da calore-shock per riprogrammare le cellule germinali ai neuroni in c. elegans

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Joint contracture, resulting from a prolonged joint immobilization, is a common complication in orthopedics. Currently, utilizing an internal fixation to ...

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Microscopia isotropica leggera e analisi di lignaggio cellulare automatizzate al catalogo Caenorhabditis elegans embriogenesi con risoluzione subcellulare

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Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Misurare la guida dello sperma e la motilità all'interno del tratto riproduttivo ermafrodita di Caenorhabditis elegans

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...