Name: studying oxidative stress caused by the mitis group streptococci in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-03-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

我々 は博士 Bing ヤン王、博士ジーナ ・ トリブル (テキサス大学、歯学部) に感謝博士リチャード ・ ラモント (ルイビル大学、歯学部), と博士サミュエル ・ シェルバーン (MD アンダーソンがんセンター) 研究室と臨床株の提供するため可鍛鋳鉄群連鎖球菌。我々 はまたc. の elegansの緊張のため博士キース ・ ブラックウェル (遺伝部、ハーバード大学医学部) を感謝します。最後に、試薬、研究を行なうワーム株を提供するため博士ダニエル ガーシン、彼女の研究室 (テキサス大学、マクガヴァン医学) をありがちましょう。いくつかのワームの系統は、CGC、研究インフラ プログラム (P40 OD010440) の NIH のオフィスによって資金が供給されるによって提供されました。

1. 汝 (トッド ・ ヒューイット酵母エキス) 寒天の調製
<ol><li>メディアの 1 L は、トッド ・ ヒューイット パウダー、酵母エキスと 2 L の三角フラスコに寒天 20 g 2 g の 30 g を追加します。970 mL の脱イオン水をフラスコの内容に追加し、攪拌棒を含めます。オートクレーブ 15 ポンド/インチ2 30 分のための 121 ° C の温度及び圧力でメディア。その後、メディアを撹拌プレート上に設定し?...

<ol>
	<li>Human Microbiome Project, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+diversity+of+the+healthy+human+microbiome.">Structure, function and diversity of the healthy human microbiome.</a> Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).</li><li>Mitchell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+mitis:+walking+the+line+between+commensalism+and+pathogenesis.">Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis.</a> Molecular Oral Microbiology. 26 (2), 89-98 (2011).</li><li>Dyson, C., Barnes, R. A., Harrison, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infective+endocarditis:+an+epidemiological+review+of+128+episodes.">Infective endocarditis: an epidemiological review of 128 episodes.</a> Journal of Infection. 38 (2), 87-93 (1999).</li><li>Sahasrabhojane, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-level+assessment+of+the+molecular+basis+of+fluoroquinolone+resistance+among+viridans+group+streptococci+causing+bacteraemia+in+cancer+patients.">Species-level assessment of the molecular basis of fluoroquinolone resistance among viridans group streptococci causing bacteraemia in cancer patients.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 43 (6), 558-562 (2014).</li><li>Shelburne, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+mitis+strains+causing+severe+clinical+disease+in+cancer+patients.">Streptococcus mitis strains causing severe clinical disease in cancer patients.</a> Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 762-771 (2014).</li><li>van der Meer, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution,+antibiotic+susceptibility+and+tolerance+of+bacterial+isolates+in+culture-positive+cases+of+endocarditis+in+The+Netherlands.">Distribution, antibiotic susceptibility and tolerance of bacterial isolates in culture-positive cases of endocarditis in The Netherlands.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 10 (9), 728-734 (1991).</li><li>Han, X. Y., Kamana, M., Rolston, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viridans+streptococci+isolated+by+culture+from+blood+of+cancer+patients:+clinical+and+microbiologic+analysis+of+50+cases.">Viridans streptococci isolated by culture from blood of cancer patients: clinical and microbiologic analysis of 50 cases.</a> Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 160-165 (2006).</li><li>Hoshino, T., Fujiwara, T., Kilian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+phylogenetic+and+phenotypic+analyses+to+identify+nonhemolytic+streptococci+isolated+from+bacteremic+patients.">Use of phylogenetic and phenotypic analyses to identify nonhemolytic streptococci isolated from bacteremic patients.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (12), 6073-6085 (2005).</li><li>Kohno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+complications+in+patients+receiving+autologous+CD34-selected+hematopoietic+stem+cell+transplantation+for+severe+autoimmune+diseases.">Infectious complications in patients receiving autologous CD34-selected hematopoietic stem cell transplantation for severe autoimmune diseases.</a> Transplant Infectious Disease. 11 (4), 318-323 (2009).</li><li>Zhu, L., Kreth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+hydrogen+peroxide+in+environmental+adaptation+of+oral+microbial+communities.">The role of hydrogen peroxide in environmental adaptation of oral microbial communities.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 717843 (2012).</li><li>Okahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+contributes+to+the+epithelial+cell+death+induced+by+the+oral+mitis+group+of+streptococci.">Hydrogen peroxide contributes to the epithelial cell death induced by the oral mitis group of streptococci.</a> PLoS One. 9 (1), 88136 (2014).</li><li>Stinson, M. W., Alder, S., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+and+killing+of+human+endothelial+cells+by+viridans+group+streptococci.">Invasion and killing of human endothelial cells by viridans group streptococci.</a> Infection and Immunity. 71 (5), 2365-2372 (2003).</li><li>Rai, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pneumoniae+secretes+hydrogen+peroxide+leading+to+DNA+damage+and+apoptosis+in+lung+cells.">Streptococcus pneumoniae secretes hydrogen peroxide leading to DNA damage and apoptosis in lung cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (26), 3421-3430 (2015).</li><li>Braun, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumococcal+pneumolysin+and+H(2)O(2)+mediate+brain+cell+apoptosis+during+meningitis.">Pneumococcal pneumolysin and H(2)O(2) mediate brain cell apoptosis during meningitis.</a> Journal of Clinical Investigation. 109 (2), 19-27 (2002).</li><li>Naji, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activation+of+the+oxidative+stress+response+transcription+factor+SKN-1+in+Caenorhabditis+elegans+by+mitis+group+streptococci.">The activation of the oxidative stress response transcription factor SKN-1 in Caenorhabditis elegans by mitis group streptococci.</a> PLoS One. 13 (8), 0202233 (2018).</li><li>Bolm, M., Jansen, W. T., Schnabel, R., Chhatwal, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide-mediated+killing+of+Caenorhabditis+elegans:+a+common+feature+of+different+streptococcal+species.">Hydrogen peroxide-mediated killing of Caenorhabditis elegans: a common feature of different streptococcal species.</a> Infection and Immunity. 72 (2), 1192-1194 (2004).</li><li>Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+worm+has+turned--microbial+virulence+modeled+in+Caenorhabditis+elegans.">The worm has turned--microbial virulence modeled in Caenorhabditis elegans.</a> Trends in Microbiology. 13 (3), 119-127 (2005).</li><li>Irazoqui, J. E., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=99th+Dahlem+conference+on+infection,+inflammation+and+chronic+inflammatory+disorders:+Caenorhabditis+elegans+as+a+model+to+study+tissues+involved+in+host+immunity+and+microbial+pathogenesis.">99th Dahlem conference on infection, inflammation and chronic inflammatory disorders: Caenorhabditis elegans as a model to study tissues involved in host immunity and microbial pathogenesis.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 160 (1), 48-57 (2010).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+and+Aging+in+Caenorhabditis+elegans:+Causal+or+Casual+Relationship.">Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 13 (12), 1911-1953 (2010).</li><li>Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+C.+elegans+for+aging+research.">Using C. elegans for aging research.</a> Invertebrate Reproduction &amp; Development. 59, 59-63 (2015).</li><li>Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKN-1/Nrf,+stress+responses,+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 88, 290-301 (2015).</li><li>Irazoqui, J. E., Urbach, J. M., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+host+innate+defence:+insights+from+Caenorhabditis+elegans+and+primitive+invertebrates.">Evolution of host innate defence: insights from Caenorhabditis elegans and primitive invertebrates.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (1), 47-58 (2010).</li><li>Park, S. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+as+mediated+by+SKN-1.">Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1.</a> Aging Cell. 8 (3), 258-269 (2009).</li><li>An, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Caenorhabditis+elegans+oxidative+stress+defense+protein+SKN-1+by+glycogen+synthase+kinase-3.">Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).</li><li>An, J. H., Blackwell, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKN-1+links+C.+elegans+mesendodermal+specification+to+a+conserved+oxidative+stress+response.">SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response.</a> Genes &amp; Development. 17 (15), 1882-1893 (2003).</li><li>Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+of+hydrogen+peroxide+produced+by+Enterococcus+faecium.">Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium.</a> Infection and Immunity. 72 (8), 4512-4520 (2004).</li><li>Pincus, Z., Mazer, T. C., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+as+a+measure+of+senescence+in+C.+elegans:+look+to+red,+not+blue+or+green.">Autofluorescence as a measure of senescence in C. elegans: look to red, not blue or green.</a> Aging (Albany NY). 8 (5), 889-898 (2016).</li><li>Teuscher, A. C., Ewald, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+Autofluorescence+to+Assess+GFP+Expression+During+Normal+Physiology+and+Aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Overcoming Autofluorescence to Assess GFP Expression During Normal Physiology and Aging in Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 8 (14), (2018).</li></ol>

腸球菌 faecium、また嫌気性下で栽培した H2O2を作り出すなど他の病原細菌の説明する方法を使用できるまたは微好気条件26。通常、最も病原性生物の週間生存の試金を完了するにいくつかの日が必要。ただし、H2O2可鍛鋳鉄グループのメンバーによって堅牢な生産のためこれらの試金は記載されている条件の下で 5-6 時間以内完了でした?...

可鍛鋳鉄群連鎖球菌は、口腔咽頭腔1の人間共生生物です。ただし、これらの生物はこのニッチを脱出し、侵襲性疾患2のさまざまなを引き起こすことができます。これらの微生物によって引き起こされる感染症は、菌血症、心内膜炎、眼窩蜂巣炎2,3,4,5,6に含まれます。さらに、彼らは浮上して血流感染症の病原体としての免疫不全、好中球減少、および化学療法5,7,8,9を受けている癌患者.
可鍛鋳鉄グループの根本的な発生機序はあいまいなので、いくつかの病原因子が同定されているメカニズムです。H2O2、口腔微生物10で重要な役割を果たすことを示している可鍛鋳鉄グループが知られています。最近では、いくつかの研究は、上皮細胞の死11,12を誘導する毒素としての H2O2の役割を強調しています。このグループに属しているs. 肺炎は、DNA 損傷と肺胞細胞13でアポトーシスを誘導する H2O2の高レベルを生成する示されています。急性肺炎動物モデルを使用して、同じ研究者は、細菌によって H2O2の生産が病原性の利点を付与を示した。肺炎球菌性髄膜炎に関する研究は、その病原体由来 H2O2は神経細胞死14をトリガーするニューモリシンと相乗的行為をも示しています。これらの観察は明らかに病原性の細菌のこのグループによって生成される、H2O2が大事を確立します。
興味深いことに、それも示されている、可鍛鋳鉄のメンバー グループ化剤H2O215,16の生産を介して線虫C. elegansの死を引き起こす口腔単純性疱疹を米します。この線虫は、多くの生物学的過程を研究する、シンプルで扱いやすい遺伝子モデルとして使用されています。最近では、ワームは、宿主-病原体相互作用17,18を研究するモデルとして登場しました。さらに、いくつかの研究は、この有機体19,20,21を使用して酸化ストレスを調査する重要性を強調しています。そのライフ サイクルは短い、RNAi が興味の遺伝子をノックダウンし、緑色蛍光タンパク質 (GFP) の使用能力-融合レポーター遺伝子の発現を監視する、いくつかの魅力的なモデル システムにする属性。もっと重要なは、酸化ストレスとワームの自然免疫を調節する経路は哺乳類20,22と非常に節約されます。
このプロトコルではc. の elegansを使用してレンサ球菌由来 H2O2による病原性を解明する方法を示した。変更された生存分析が表示され、可鍛鋳鉄グループのメンバーが急速にワームを殺すことでH2O2の生産。活性酸素種の持続的な生物的源可鍛鋳鉄グループのメンバーを使用してこの (ROS) がワームで酸化ストレスを誘発する化学のソースではなく、提供されます。さらに、細菌は急速に、ワームを植民地化することができる H2O2 (いくつかの障壁を交差する必要がある他の情報源と比較して) 腸管細胞へ直接ターゲットとすることができます。アッセイは、どちらかskn 1変異株のまたは 2) N2 野生型を基準にしてワームおよびベクター駆除処理されたワームで RNAi を用いたskn 1ノックダウンの生存を決定する 1) によって検証されます。SKN 1 はc. の elegans23,24,25の酸化ストレス応答を調節する重要な転写因子です。生存の試金、以外 SKN-1 b/C::GFP 遺伝子改変レポーターを表現するワームひずみは可鍛鋳鉄グループによる活性化、酸化ストレス応答を介してH2O2の生産を監視するために使用されます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:845px;" width="845">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Media and chemicals</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Bacto peptone&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0118-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Bacto Todd Hewitt Broth</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0492-17-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD BBL Sheep Blood, Defibrinated&#160;&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B11947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Difco Agar&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0145-17-0</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Difco LB Broth</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0446-17-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blood agar (TSA with Sheep Blood)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R01200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Carbenicillin</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP26481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Catalase&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C1345-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ICN10138201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">IPTG</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MP21021012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Nystatin</td>
			<td style="width:179px;">Acros organics</td>
			<td style="width:119px;">AC455500050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium chloride&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SS266-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">8.25% Sodium Hypochlorite</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Streptomycin Sulfate&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP910-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Tetracyclin</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">87128-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">(&#8722;)-Tetramisole hydrochloride</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L9756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1422-500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Consumables&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-565-269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 x 10 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">No. 1.5&#160; 18 mm X 18 mm Cover Slips</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-541A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-544-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Software&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Prism</td>
			<td style="width:179px;">Graphpad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Bacterial Strains</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. oralis ATCC 35037</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. mitis ATCC 49456</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. gordonii DL1 Challis&#160;&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">E. coli OP50</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">E. coli HT115</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Worm Strains</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Strain</td>
			<td style="width:179px;">Genotype</td>
			<td style="width:119px;">Transgene</td>
			<td>Source</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">N2</td>
			<td style="width:179px;">C. elegans wild isolate</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">EU1</td>
			<td style="width:179px;">skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">LD002</td>
			<td style="width:179px;">IdIs1</td>
			<td style="width:119px;">SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)</td>
			<td>Keith Blackwell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying oxidative stress caused by the mitis group streptococci in caenorhabditis elegans

線虫 (C. elegans)、線虫は、ホスト病原体の相互作用を研究する魅力的なモデルとして登場しました。提案するプロトコルは、H2O2の生産を介して可鍛鋳鉄群連鎖球菌によって引き起こされる病原性を決定するため、このモデルを使用します。可鍛鋳鉄群連鎖球菌菌血症、心内膜炎、眼窩蜂巣炎など多くの疾患を引き起こす新たな脅威であります。ここで説明した H2O2への応答でこれらのワームの生存を確認するためのプロトコルが病原体のこのグループによって生成されます。酸化ストレス応答転写因子の遺伝子skn 1エンコーディングを使用して、このモデルはレンサ球菌感染に対して不可欠な宿主遺伝子を識別するために重要であることを示す.さらに、緑色蛍光タンパク質 (GFP)、SKN 1 を融合遺伝子改変レポーター ワームひずみを用いたこれらの病原体の存在下で酸化ストレス応答の活性化を監視できることを示します。これらのアッセイは、H2O2を外ではなく、生物学的ソースによって派生する酸化ストレス応答を勉強する機会が活性酸素種 (ROS) ソースを追加提供します。

可鍛鋳鉄のメンバー グループ化剤、 s. 口腔単純性疱疹とs. gordonii急速に死亡とは対照的に, S. mutans、 s. レンサと非病原性大腸菌のワームは、OP50 (図 3A)。剤、 s. 口腔単純性疱疹、 S. gordoniiの生存期間の中央値は 300 分、300 分、345 分であった。殺害された H2O2</su...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

線虫の線虫は、宿主-病原体相互作用を分析する優れたモデルです。ここで説明した、可鍛鋳鉄群連鎖球菌のメンバーとワームに感染し、H2O2を有機体のこのグループによって生成に対する酸化ストレス応答の活性化を決定するプロトコルです。

線虫剤群連鎖球菌によって引き起こされる酸化ストレスの勉強

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

このプロトコルでは、Mitis Groupストレプトコックシを介して生成された過酸化水素によって引き起こされる病原性を解明するために、自由な生きている方法c.エレガンスを使用する方法を示す。この技術の主な利点は、1リットルのメディアに対してトッド・ヒューイット粉末30g、酵母エキス2g、20gのアガーを2リットルのエルリン・マイヤーフラスコに加える化学源とは対照的に、活性酸素種の持続的な生物学的供給源を使用して、ワームの病原性とストレス応答の活性化を研究できることです。フラスコの内容物に970mlの脱イオン水を加え、攪拌棒に入れます。開口部をカバーするためにアルミホイルを使用してください。121°Cの温度でフラスコにメディアをオートクレーブし、30分間平方インチあたり15ポンドの圧力を加えます。その後、フラスコを攪拌プレートにセットし、穏やかな攪拌で冷まします。ラミナーフードの下に、適切なサイズの無菌ペトリ皿にメディアを注ぎます。メディアを2時間乾燥させます。その後、プレートを摂氏4度で1ヶ月まで保管します。ミティスグループレンサ球菌の準備の前に、THY寒天プレートをインキュベーターで摂氏37度に温めます。その後、場所にレンサプチコッシの所望の株をストリークアウトする無菌ループを使用します。その後、プレートをキャンドルジャーに入れ、瓶を摂氏37度で一晩で約18時間インキュベートし、微小性好水性環境を提供します。翌日、キャンドルジャーからプレートを取り出し、滅菌ループを使用して孤立したコロニーを選びます。2 ml の THY ブロスを含む 15 ml の滅菌コニカル チューブを接種します。キャップをしっかりと閉じ、静電気条件下で37°Cでチューブをインキュベートします。37°Cのインキュベーターで事前に暖かいTHYプレートは、THYプレートに1000単位のカタラーゼを含む溶液50マイクロリットルを追加します。滅菌スプレッダーを使用してカタラーゼ溶液を広げ、プレートを層流フードで30分間乾燥させます。レンサ球菌株でプレートを播種するには、ピペットを使用して一晩栽培された培養物の80マイクロリットルをプレートに加え、無菌スプレッダーを使用して寒天表面全体に細菌を完全に広げます。一晩キャンドルジャーに摂氏37度でプレートをインキュベートします。コントロールとして、2つのNGMプレートに、播種用に大腸菌OP-50の一晩成長培養物の80マイクロリットルを加える。一晩で摂氏37度でプレートをインキュベートします。翌日、キャンドルジャーからプレートを取り出し、プレートを室温まで冷却します。滅菌ワームピックを使用して、NGMフィードプレートから30 L4幼虫をレンサ球菌播種THYプレートに移します。プレートを摂氏25度でインキュベートします。解剖顕微鏡の下で、いくつかの時点で各プレート上の生きているおよび死んだL4幼虫の数を数える。滅菌ワームピックを使用して、ワームを穏やかに推進し、それらが死んでいるか生きているかを判断します。最初は、ワームを死んだものとしてスコア付けするか、30分ごとに生きています。ワームが急速に死に始めたら、15分間隔でそれらを採点する。アッセイの完了には5~6時間かかります。その後、実験を2回繰り返します。アガロースパッドを準備するには、2つのガラススライドに沿ってラボテープを縦に貼ります。これはアガロースパッドの厚さを決定します。2 つのテーピングスライドの間にきれいなガラススライドを置きます。アガロースを脱イオン水に溶かし、2重量体積%にし、溶液を電子レンジで加熱します。ピペットを使用して、100マイクロリットルの溶融アガロースをきれいなスライドの中央に置きます。すぐに溶融アガロースの上に別のきれいなガラススライドを置き、パッドを作るために穏やかに押し下げます。アガロースを固め、その後、トップスライドを削除します。アガロースパッドは使用する準備ができています。THYプレートを摂氏37度に予め温めます。生存アッセイで以前に行われたように、レンサ球菌株でプレートをシードします。コントロールとしてE-大腸菌OP-50と種子3 NGMプレートと一晩摂氏37度でインキュベート。翌日、プレートを室温まで冷やします。M9Wバッファーを使用して、NGMまたはNGM RNAiの給餌プレートから15mlの円錐形チューブにL4幼虫を洗浄します。チューブを450回gで回転し、遠心分離機で1分間回転させます。上清をデカントし、各チューブにM9Wの10 mlを加えます。遠心工程をさらに3回繰り返します。M9Wの250マイクロリットルでワームを再中断し、ワームサスペンションの3つの5マイクロリットルの滴をきれいなペトリ皿の蓋に置きます。解剖顕微鏡の下で、マイクロリットル当たりのワーム数を推定する。ピペットを使用して、各THYレンサ球菌種とNGM大腸菌種のプレートに約100 L4幼虫を加えます。細菌の株ごとに3つのプレートを使用してください。25°Cで2〜3時間プレートをインキュベートします。その後、インキュベーターからプレートを取り出します。M9Wでそれらを洗浄し、15ml円錐管でワームを収集します。遠心工程で以前に行われたようにワームを3回洗います。吸引によってM9Wのほとんどを取除く。そして、麻酔のためのワームペレットに2ミリモルナトリウムアジ化ナトリウムまたは四量体塩酸塩を含むM9Wの500マイクロリットルを加える。室温で15分間、ワームペレットでチューブをインキュベートします。次いで、15マイクロリットルのウォーム懸濁液を調製したアゴローズパッドに落とす。蛍光顕微鏡で、フィッツィーフィルターとダッピーフィルターを利用したskn-1の局所化を可視化します。画像ワームは10倍と20倍の倍率で表示されます。3つのレベルの局所化に基づいてワームを採点し、核局所化が観察されない低局所化、中局所化、SKN 1 BCGFPをワームの前部または後部に、そしてskn-1 BCGFPの核局所化がすべての腸細胞で観察される高い局地化を有する。この実験では、ミティスグループのメンバーは、S.ミュータン、S.サリバリウス、非病原性大腸菌OP-50とは対照的に、急速にワームを殺しました。カタラーゼをTHYアガーに補うと、ワームの殺滅は廃止された。ワームの死は、野生型および賛辞株と比較してデルタspxB突然変異株では観察されなかった。これらのデータは、ミティスグループによって産生された過酸化水素がワームの殺滅を仲介することを示唆している。skn-1ノックダウンワームの生存率の有意な減少は、治療されたワームのベクター制御と比較して観察された。同様の殺死表現型は、skn-1変異株およびN2野生型ワームで観察された。これは、skn-1がミティスグループのワームの生存に影響を与えることを示しています。skn-1 BCGFPの局地化は、野生型N-補間株にさらされたワームで観察され、SコルドナエのデルタspxB突然変異株に応答しなかった。P38マップキナーゼ経路の成分を倒した後、skn-1 BCGFPおよびノックダウン処理されたワームの局所化を減少させ、治療されたワームのベクター制御に対して、観察された。レンサ球菌cを用いた。エレガンス系は、過酸化水素が小胞性ストレスに及ぼす影響、ミトコンドリア損傷、ミトポホギ、およびトフォギーをさらに検討することができる。さらに、過酸化水素が細胞のコアプロセスを破壊することによって免疫応答を引き出すビリエンス因子として作用するメカニズムを同定することができる。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

線虫を用いて生殖化学毒性を総合的に評価<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

で活躍ERKの時空間解析<em&gt; C。エレガンス</em&gt;生殖細胞系列

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

線虫ニューロンの細胞内輸送を分析するための固定化

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

線虫のニューロンに生殖細胞を再プログラムする RNAi と熱衝撃による転写因子の発現のアプリケーション

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

腸の生きている線虫のライソゾーム アルカリ化を評価します。

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

核の分布、蛋白質および細胞骨格を研究する線虫生殖細胞の解析

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

A Mini-Invasive Internal Fixation Technique for Studying Immobilization-Induced Knee Flexion Contracture in Rats

ラットの固定化誘発膝屈曲収縮を研究するための小型侵襲的内部固定技術

Joint contracture, resulting from a prolonged joint immobilization, is a common complication in orthopedics. Currently, utilizing an internal fixation to ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

等方性光シート顕微鏡と自動細胞系譜分析による、細胞内分解能を Caenorhabditis elegans 胚発生

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Caenorhabditis elegansふたなり生殖管内の精子の誘導と運動性の測定

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...