Name: studying oxidative stress caused by the mitis group streptococci in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-03-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

우리 감사 박사 빙 연의 왕, 박사 장군이 Tribble (텍사스 대학, 치과의 학교), 박사 리처드 Lamont (루이스 빌 대학, 치과의 학교), 및 실험실 및 임상 긴장의 제공에 대 한 박사 사무엘 셸 번 (MD 앤더슨 암 센터) mitis streptococci 그룹. 우리는 또한 선 충 C. 긴장에 대 한 박사 키이 스 블랙 웰 (유전학의 부, 하버드의과 대학) 감사합니다. 마지막으로, 우리 감사 박사 다니엘 Garsin와 그녀의 실험실 (텍사스 대학, 맥 거 번의과 대학) 시 약 및 연구 수행을 웜 변종. 일부 웜 변종 CGC, NIH 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 사무실에 의해 자금에 의해 제공 되었다.

1. 네 (토 드-휴이 트 효 모 추출 물) 한 천 배지 준비
<ol><li>미디어의 1 L, 토 드-휴이 트 분말, 효 모 추출 물 및 2 L 삼각 플라스 크를 한 20 g 2 세대의 30 g 추가. 이온된 수의 970 mL 플라스 크의 내용에 추가 하 고 볶음 바 포함. 압력솥에서 121 ° C의 온도 압력 30 분 동안 15 파운드/인치2 의 미디어. 그 후, 저 어 접시에 미디어를 설정 하 고 부드러운 감동으로 냉각 허용.</li>
	<li>층 류 흐름에서 ?...

<ol>
	<li>Human Microbiome Project, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+diversity+of+the+healthy+human+microbiome.">Structure, function and diversity of the healthy human microbiome.</a> Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).</li><li>Mitchell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+mitis:+walking+the+line+between+commensalism+and+pathogenesis.">Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis.</a> Molecular Oral Microbiology. 26 (2), 89-98 (2011).</li><li>Dyson, C., Barnes, R. A., Harrison, G. 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Enterococcus faecium, H2O2 에서 혐 기성 성장 생산 등 다른 병원 성 세균에 대 한 설명 하는 메서드를 사용할 수 있습니다 microaerophilic26조건 또는. 일반적으로, 대부분 병원 성 유기 체를 위한 그것은 걸립니다 몇 일 주 생존 분석 실험. 그러나, mitis 그룹의 구성원에 의해 H2O2 의 강력한 생산으로 인해 이러한 분석 5-6 h 설명 된 조건 내에서 완료 될 ...

Mitis 그룹 streptococci oropharyngeal 구멍1의 인간의 공생입니다. 그러나, 이러한 생물이이 틈새를 탈출 하 고 침략 적인 질병2의 다양 한을 발생할 수 있습니다. 이러한 미생물에의 한 감염 등 bacteremia, 심장 내 막 염, 궤도 cellulitis2,,34,,56. 또한, 그들은 혈 류 감염의 원인으로 대리인은 신흥 시내 immunocompromised, neutropenic, 그리고 화학 요법5,,78,9 받은 암 환자 .
몇 가지 독성 요인 확인 되었습니다 있기 때문에 기본 mitis 그룹 병 인은 애매 한 메커니즘. Mitis 그룹은 H2O2, 구강 미생물 커뮤니티10에서 중요 한 역할을 보여줘 생산으로 알려져 있다. 최근 여러 연구 cytotoxin 상피 세포 죽음11,12-유도로 H2O2 에 대 한 역할을 강조 했습니다. S. 폐 렴, 이 그룹에 속하는 DNA 손상 및13치경 세포 있는 apoptosis를 유도 하는 H2O2 의 높은 수준의 생산을 보였다. 급성 폐 렴 동물 모델을 사용 하 여, 동일한 연구원은 박테리아에 의해 H2O2 의 생산 독성 우위를 수 여 한다 설명 했다. 폐 렴 균 성 수 막 염에 대 한 연구 또한 그 병원 체 파생 된 H2O2 를 신경 세포 죽음14트리거 pneumolysin와 synergistically 역할 표시. 이 관측은 명확 하 게 박테리아의이 그룹에 의해 생산을 H2O2 는 그들의 pathogenicity에 대 한 중요 한 설정 합니다.
흥미롭게도, 그것은 또한 보였다는 mitis의 회원 그룹 S. mitis 및 H2O215,16의 생산을 통해 선 충 C. 선 충 의 죽음의 원인이 S. oralis . 이 살아있는 선 충 류는 많은 생물 학적 과정을 공부 하 간단 하 고, 유전으로 온순한 모형으로 사용 되었습니다. 더 최근에, 웜은 호스트 병원 체 상호 작용17,18연구 모델로 떠오르고 있다. 또한, 여러 연구 공부 하는이 유기 체19,20,21을 사용 하 여 산화 스트레스의 중요성을 강조 했습니다. 그것의 짧은 라이프 사이클, RNAi에 의해 관심의 최저의 유전자 및 녹색 형광 단백질 (GFP)의 사용-융합된 기자 유전자 발현을 모니터링 하는 특성을 그것에 게 매력적인 모델 시스템의 일부. 더 중요 한 것은, 산화 스트레스와 벌레에 타고 난 면역 조절 경로 높은 포유류20,22보존 됩니다.
이 프로토콜에서 그것는 연쇄 구 균 파생 된 H2O2로 인 한 pathogenicity 명료 하 C. 선 충 을 사용 하는 방법은 보여 줍니다. 수정 된 생존 분석 결과 표시 하 고 mitis 그룹의 구성원을 급속 하 게 벌레를 죽 일 수 있습니다 통해 H2O2의 생산. 반응 산소 종의 지속적인된 생물 소스 mitis 그룹의 구성원을 사용 하 여 (선생님) 제공, 벌레에 산화 스트레스를 유발 하는 화학 원본에 반대 합니다. 또한, 박테리아는 H2O2 (여러 방 벽을 교차 하 고 있는 다른 소스에 비해) 창 자 세포에 직접 타겟이 될 수 있는 벌레를 빠르게, 식민지 수 있습니다. 분석 결과 중 1)으로 skn-1 돌연변이 스트레인의 또는 2) skn-1 웜 N2 야생-타입 기준 및 벡터 제어 처리 벌레에 RNAi를 사용 하 여 아래로 노크 하 여 생존을 결정 하는 유효성이 검사 됩니다. SKN-1 C. 선 충23,,2425의 산화 스트레스 반응을 조절 하는 중요 한 전사 요소입니다. 생존 분석, 뿐만 아니라 SKN-1B/C::GFP 유전자 변형 기자 표현 웜 변형 mitis 그룹은 산화 긴장 응답을 통해 H2O2 의 생산의 활성화를 모니터링 하는 데 사용 됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:845px;" width="845">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Media and chemicals</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Bacto peptone&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0118-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Bacto Todd Hewitt Broth</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0492-17-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD BBL Sheep Blood, Defibrinated&#160;&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B11947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Difco Agar&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0145-17-0</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Difco LB Broth</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0446-17-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blood agar (TSA with Sheep Blood)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R01200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Carbenicillin</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP26481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Catalase&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C1345-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ICN10138201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">IPTG</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MP21021012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Nystatin</td>
			<td style="width:179px;">Acros organics</td>
			<td style="width:119px;">AC455500050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium chloride&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SS266-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">8.25% Sodium Hypochlorite</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Streptomycin Sulfate&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP910-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Tetracyclin</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">87128-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">(&#8722;)-Tetramisole hydrochloride</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L9756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1422-500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Consumables&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-565-269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 x 10 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">No. 1.5&#160; 18 mm X 18 mm Cover Slips</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-541A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-544-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Software&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Prism</td>
			<td style="width:179px;">Graphpad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Bacterial Strains</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. oralis ATCC 35037</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. mitis ATCC 49456</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. gordonii DL1 Challis&#160;&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">E. coli OP50</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">E. coli HT115</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Worm Strains</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Strain</td>
			<td style="width:179px;">Genotype</td>
			<td style="width:119px;">Transgene</td>
			<td>Source</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">N2</td>
			<td style="width:179px;">C. elegans wild isolate</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">EU1</td>
			<td style="width:179px;">skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">LD002</td>
			<td style="width:179px;">IdIs1</td>
			<td style="width:119px;">SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)</td>
			<td>Keith Blackwell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying oxidative stress caused by the mitis group streptococci in caenorhabditis elegans

꼬마 선 충 (C. 선 충), 살아있는 선 충 류, 호스트 병원 체 상호 작용을 공부 하는 매력적인 모델로 떠오르고 있다. 제시 프로토콜이이 모델을 사용 하 여 H2O2의 생산을 통해 mitis 그룹 streptococci 기인한 pathogenicity 결정. Mitis 그룹 streptococci bacteremia, 심장 내 막 염, 궤도 봉와 직 염 등 많은 인간의 질병을 일으키는 원인이 되는 신흥 위협입니다. 여기에 설명 된 H2O2 에 대 한 응답에이 벌레의 생존을 결정 하는 프로토콜에 의해 생산 병원 체의이 그룹. 산화 긴장 응답 녹음 방송 요인에 대 한 유전자 skn-1 인코딩을 사용 하 여,이 모델은 연쇄 구 균 감염에 대 한 필수적인 호스트 유전자를 식별 하는 데 중요 한 표시 됩니다. 또한, 유전자 변형 기자 웜 변형, SKN-1 녹색 형광 단백질 (GFP)를 융합은 사용 하 여이 병원 균의 존재 산화 스트레스 반응의 활성화를 모니터링할 수 있습니다 표시 됩니다. 이 분석 실험 것 반대로 생물 소스에 의해 파생 된 H2O2 로 산화 스트레스 반응을 기회 반응성 산소 종 (선생님) 소스를 추가 제공 합니다.

mitis의 회원 그룹 S. mitis, S. oralis, S. gordonii 빠르게 사망 S. mutans, S. salivarius, 및 비 병원 성 대장균 에 반대 벌레, OP50 (그림 3A). S. mitis, S. oralis, S. gordonii 메디아 생존이 이었다 300 분, 300 분, 345 분, 각각. 살인 H2O2에 의해 중재 된 경우를 확인 하려면 catalase 네 agar에...

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Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

선 충 류 꼬마 선 충 호스트 병원 체 상호 작용을 해 부에 우수한 모델입니다. 여기에 설명 된 멤버 mitis 그룹 streptococci와 웜 감염 유 기체의이 그룹에 의해 생산 H2O2 에 대 한 산화 스트레스 반응의 활성화를 결정 하는 프로토콜이입니다.

산화 스트레스는 Mitis 그룹 Streptococci 꼬마 선 충 에 의해 발생 하는 공부

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

이 프로토콜에서 우리는 미티스 그룹 연쇄상 구균을 통해 생성된 과산화수소에 의한 병원성을 해명하기 위해 무료 생활 방법 c. elegans를 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 기술의 주요 장점은 우리가 화학 소스와 반대로 반응성 산소 종의 지속 가능한 생물학적 소스를 사용하여 벌레의 병원성과 스트레스 반응의 활성화를 연구 할 수 있다는 것입니다 메디 휴트 분말 의 30g, 효모 추출물 2g과 20g의 에이거2 리터 에를.플라스크의 내용물에 970ml의 탈이온된 물을 넣고 저어줄에 넣습니다. 알루미늄 호일을 사용하여 개구부를 덮습니다. 121도의 온도에서 플라스크에서 미디어를 오토클레이브하고 30 분 동안 평방 인치 당 15 파운드의 압력.그 후 부드러운 교반으로 식히기 위해 교반 접시에 플라스크를 설정합니다. 라미나르 후드 아래에 미디어를 적절히 크기로 멸균 페트리 접시에 붓습니다. 미디어를 2시간 동안 건조시키십시오.그 후 최대 1 개월 동안 섭씨 4도에 접시를 저장합니다. 미티스 그룹 연쇄상 구균의 준비 전에, 37섭씨에 인큐베이터에 THY 한천 판을 따뜻하게. 그 후 장소에 strepticocci의 원하는 긴장을 줄무늬멸 루프를 사용합니다.그런 다음 양초 항아리에 접시를 넣고 약 18 시간 동안 밤새 섭씨 37도에서 항아리를 배양하여 미세 한 환경을 제공합니다. 다음 날, 촛불 항아리에서 접시를 제거하고 고립 된 식민지를 선택하는 멸균 루프를 사용합니다. THY 국물 2ml를 함유한 멸균 원추형 튜브 15ml를 접종합니다.캡을 단단히 닫고 정적 조건에서 섭씨 37도에서 튜브를 배양합니다. 인큐베이터에서 37도까지 미리 따뜻하게 하는 THY 플레이트는 1000단위의 카탈라아제를 함유한 50마이크로리터의 용액을 THY 플레이트에 추가합니다. 멸균 스프레더를 사용하여 카탈라제 용액을 확산시키고 플레이트가 라미나르 플로우 후드에서 30분 동안 건조되도록 합니다.연쇄상 구균 균주로 플레이트를 시드하려면 파이펫을 사용하여 하룻밤 재배 배양 80 마이크로 리터를 접시에 추가하고 멸균 스프레더를 사용하여 식기 표면에 박테리아를 완전히 퍼뜨리습니다. 하룻밤 사이에 촛불 항아리에 37도에서 접시를 배양하십시오. 대조군으로, 두 NGM 플레이트에, 종종에 대한 E.coli OP-50의 하룻밤 재배 문화의 80 마이크로 리터를 추가합니다.하룻밤 사이에 37도에서 접시를 배양하십시오. 다음 날, 촛불 항아리에서 접시를 제거하고 접시가 실온으로 냉각 할 수 있습니다. 멸균 웜 픽을 사용하여 NGM 급식 플레이트에서 30 L4 애벌레를 연쇄상 구균 시드 THY 플레이트로 옮길 수 있습니다.섭씨 25도에서 접시를 배양하십시오. 해부 현미경에서, 여러 시간 지점에서 각 접시에 살아있는 L4 애벌레의 수를 계산합니다. 멸균 웜 픽을 사용하여 웜을 부드럽게 프로딩하고 죽었는지 살아 있는지 확인합니다.처음에 벌레를 죽은 것으로 채점하거나 30분마다 살 수 있습니다. 벌레가 빠르게 죽기 시작하면 15 분 간격으로 점수를 매습니다. 분석이 완료되는 데 5~6시간이 소요됩니다.그 후 실험을 두 번 더 반복합니다. 아가로즈 패드를 준비하려면 두 개의 유리 슬라이드를 따라 실험실 테이프를 세로로 붙입니다. 이렇게 하면 아가로즈 패드의 두께가 결정됩니다.두 개의 녹화된 슬라이드 사이에 깨끗한 유리 슬라이드를 놓습니다. 아가로즈를 탈온화된 물에 녹여 체중 2%를 만들고 전자레인지에서 용액을 가열합니다. 파이펫을 사용하여 100 마이크로리터의 용융 아가로즈를 깨끗한 슬라이드 의 중앙에 놓습니다.즉시 용융 아가로즈 위에 또 다른 깨끗한 유리 슬라이드를 놓고 부드럽게 아래로 눌러 패드를 만듭니다. 아가로즈가 고체화되고 그 후 상단 슬라이드를 제거하도록 허용합니다. 아가로즈 패드는 사용할 준비가 되어 있습니다.37섭씨까지 미리 따뜻합니다. 생존 성 약에서 이전에 수행 된 바와 같이 연쇄상 구균 균주로 플레이트를 시드. 종자 3 NGM 플레이트 E-coli OP-50 제어 및 하룻밤 섭씨 37도에서 배양.다음 날, 실온으로 접시를 식힙니다. M9W 버퍼를 사용하여 NGM 또는 NGM RNAi 급식 플레이트에서 L4 애벌레를 15ml 원추형 튜브로 세척하십시오. 원심분리기에서 1분 동안 튜브를 450배 g로 회전시합니다.상류제를 데칭하고 각 튜브에 10ml의 M9W를 추가합니다. 원심 단계를 세 번 더 반복합니다. M9W의 250 마이크로리터에서 웜을 다시 중단하고 벌레 서스펜션 35방울을 깨끗한 페트리 접시 뚜껑에 놓습니다.해부 현미경에서 마이크로 리터 당 웜수를 추정합니다. 파이펫을 사용하여 각 THY 연쇄상 구균 시드 및 NGM E.coli 시드 플레이트에 약 100 L4 애벌레를 추가합니다. 박테리아의 변형 당 세 접시를 사용합니다.섭씨 25도에서 2~3시간 동안 접시를 배양합니다. 그 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. M9W로 씻어 내고 15ml 원물 튜브로 벌레를 수집합니다.원심 단계에서 이전에 했던 것처럼 벌레를 세 번 씻으세요. 포부로 대부분의 M9W를 제거하십시오. 그리고 마취를 위한 벌레 펠릿에 2 밀리머 나트륨 아지드 또는 테트라미솔 염산염을 포함하는 M9W의 500 마이크로리터를 추가합니다.15 분 동안 실온에서 벌레 펠릿으로 튜브를 배양하십시오. 그런 다음, 웜 서스펜션의 15 마이크로리터를 준비된 전초 패드에 떨어뜨립니다. 형광 현미경으로 Fitzy 및 Dappy 필터를 사용하여 skn-1의 국소화를 시각화합니다.이미지 웜은 10배, 20배 배율로 합니다. 핵 국산화가 관찰되지 않는 국소화; 낮은 국소화, 중간 국소화, SKN 1 BCGFP가 웜의 전방 또는 후방에 있는 및 모든 장 세포에서 핵 국산화가 관찰되는 높은 현지화를 기반으로 웜을 점수. 이 실험에서, 미티스 그룹의 구성원은 신속하게 S.mutans반대로, S.salivarius 및 비 병원성 대장균 OP-50반대로 벌레를 죽였다.카탈라제가 THY 에이거로 보충되었을 때, 벌레의 학살은 폐지되었다. 웜의 죽음은 야생 형 및 칭찬 균주에 비해 델타 spxB 돌연변이 균주에서 관찰되지 않았다. 이 데이터는 Mitis Group에 의해 생성된 과산화수소가 벌레의 살인을 중재한다는 것을 건의합니다.skn-1 녹다운 웜의 생존율이 벡터 제어 처리 웜에 비해 현저한 감소가 관찰되었다. skn-1 돌연변이 균주와 N2 야생형 웜과 유사한 살인 표현형이 관찰되었다. 이것은 skn-1이 미티스 그룹에 벌레의 생존에 영향을 미친다는 것을 보여줍니다.skn-1 BCGFP의 국소화는 S 코르도나에의 델타 spxB 돌연변이 균주에 대한 응답이 아닌 야생 형 N-칭찬 균주에 노출 된 웜에서 관찰되었다. P38 맵 키나아제 통로의 성분이 쓰러진 후, skn-1 BCGFP의 국소화를 감소시키고, 벡터 제어 처리 웜에 비해 처리된 웜을 녹다운하였다. 연쇄상 구균 c를 사용 하 여.elegans 시스템, 과산화수소가 내피 성 구균 스트레스, 미토콘드리아 손상, 미토포이 및 토포지에 미치는 영향은 더 연구 될 수 있습니다. 또한, 과산화수소가 세포의 핵심 공정을 방해하여 면역 반응을 유도하는 virilescence 인자로서 작용하는 메커니즘을 확인할 수 있다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

선충을 사용하여 생식선 화학 독성의 종합 평가<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

연구

발생학

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

활성 ERK의 공간 및 시간 분석<em&gt; C. 엘레</em&gt; 생식선

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

신경 세포에서 세포내 수송 분석 꼬마 선 충 의 동원 정지

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

C. 선 충 에서 신경 세포를 세균 세포를 재 설 정할 RNAi 및 열 충격 유도 하는 전사 인자 식의 적용

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

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라이브 창 꼬마 선 충 에 Lysosomal Alkalinization 평가

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

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꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

A Mini-Invasive Internal Fixation Technique for Studying Immobilization-Induced Knee Flexion Contracture in Rats

쥐에서 고정 유도 무릎 굴곡 계약을 연구하기위한 미니 침략적 인 내부 고정 기술

Joint contracture, resulting from a prolonged joint immobilization, is a common complication in orthopedics. Currently, utilizing an internal fixation to ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

등방성 라이트 시트 현미경 검사 및 자동 세포 계보 분석을 통해 아닌 간 분해능을 통한 배아 발생 발생

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

정자 지도 및 운동 성 아닌 간 남녀 양성 생식 기관에서 측정

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...