Name: studying oxidative stress caused by the mitis group streptococci in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-03-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Agradecemos o Dr. Wang Bing-Yan, Dr. Gena Tribble (da Universidade do Texas, faculdade de Odontologia), Dr. Richard Lamont (Universidade de Louisville, faculdade de Odontologia) e Dr. Samuel Shelburne (MD Anderson Cancer Center) para fornecer o laboratório e estirpes clínicas de Os estreptococos do grupo mitis. Agradecemos também o Dr. Keith Blackwell (departamento de genética, faculdade de medicina de Harvard) para as cepas de c. elegans . Finalmente, agradecemos a Dr. Danielle Garsin e laboratório dela (da Universidade do Texas, faculdade de medicina de McGovern) para fornecimento de reagentes e cepas de worm para conduzir o estudo. Algumas cepas de vírus foram fornecidas pelo CGC, que é financiado pelo NIH escritório de programas de infra-estrutura de pesquisa (OD010440 P40).

1. preparação do vossos placas de ágar (extrato de levedura de Todd-Hewitt)
<ol><li>Para 1 litro de mídia, adicione 30 g de pó de Todd-Hewitt, 2 g de extrato de levedura e 20 g de ágar para um Erlenmeyer de 2 L. Adicionar 970 mL de água desionizada para o conteúdo do frasco e incluir uma barra de agitação. Autoclave a mídia a uma temperatura de 121 ° C e pressão de 15 lb/pol2 por 30 min. Depois disso, definir os meios de comunicação em uma placa de agitação e permitir para resfriamento com a...

<ol>
	<li>Human Microbiome Project, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+diversity+of+the+healthy+human+microbiome.">Structure, function and diversity of the healthy human microbiome.</a> Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).</li><li>Mitchell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+mitis:+walking+the+line+between+commensalism+and+pathogenesis.">Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis.</a> Molecular Oral Microbiology. 26 (2), 89-98 (2011).</li><li>Dyson, C., Barnes, R. A., Harrison, G. 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Os métodos descritos podem ser usados para outras bactérias patogénicas como Enterococcus faecium, que também produz H2O2 crescidas sob anaeróbio ou microaerofílicas condições26. Normalmente, para os organismos patogénicos mais, demora vários dias a semanas para completar os ensaios de sobrevivência. No entanto, devido à produção de robusta de H2O2 por membros do grupo mitis, estes ensaios podem ser concluídos no prazo de 5-6 h, n...

Estreptococos do grupo mitis são humanos comensais da cavidade orofaríngea1. No entanto, estes organismos podem escapar deste nicho e causar uma variedade de doenças invasivas2. As infecções causadas por esses microorganismos incluem a bacteremia, endocardite e celulite orbital de2,3,4,5,6. Além disso, eles estão surgindo agentes como causadores de infecções da corrente sanguínea em imunocomprometidos, intermitente e pacientes com câncer submetidos a quimioterapia5,7,8,9 .
Os mecanismos subjacentes mitis patogênese de grupo é obscura, porque foram identificados alguns factores de virulência. O grupo mitis é conhecido por produzir H2O2, que tem se mostrado um importante papel em comunidades microbianas oral10. Mais recentemente, vários estudos têm destacado um papel para H2O2 como um cytotoxin que induz a célula epitelial morte11,12. Pneumonia de S., que pertence a este grupo, foi mostrado para produzir altos níveis de H2O2 , que induz os danos do DNA e apoptose em células alveolar13. Usando um modelo animal de pneumonia aguda, os mesmos pesquisadores demonstraram que a produção de H2O2 pela bactéria confere uma vantagem de virulência. Estudos sobre meningite pneumocócica também têm demonstrado que patógeno-derivado H2O2 atua em sinergia com pneumolysin para acionar a célula neuronal morte14. Estas observações estabelecem claramente que H2O2 produzido por este grupo de bactérias é importante para sua patogenicidade.
Curiosamente, ele também foi mostrado que os membros da mitis grupo S. mitis e s. oral provoca a morte do nemátodo c. elegans através da produção de H2O215,16. Este nematódeo de vida livre tem sido usado como um modelo simples, geneticamente tractable estudar muitos processos biológicos. Mais recentemente, o worm tem emergido como um modelo para o estudo de17,de interações patógeno-hospedeiro18. Além disso, diversos estudos evidenciaram a importância de se estudar o estresse oxidativo usando este organismo19,20,21. Seu ciclo de vida curto, a capacidade de "knockdown" genes de interesse por RNAi e uso de proteína fluorescente verde (GFP)-fundidos repórteres para monitorar a expressão do gene são alguns dos atributos que o tornam um sistema modelo atraente. Mais importante, as vias que regulam o estresse oxidativo e imunidade inata no worm são altamente conservadas com mamíferos20,22.
Neste protocolo, que é demonstrado como usar c. elegans para elucidar a patogenia causada por estreptococos-derivado H2O2. Um ensaio de sobrevivência modificada é mostrado, e membros do grupo mitis são capazes de matar os vermes rapidamente através da produção de H2O2. Usando os membros do grupo mitis, uma fonte biológica sustentado de espécies reativas de oxigênio (ROS) é fornecido, ao contrário de fontes químicas que induzem o stress oxidativo nos vermes. Além disso, as bactérias são capazes de colonizar as minhocas rapidamente, que permite a H2O2 ser direcionados diretamente para as células intestinais (em comparação com outras fontes que têm de atravessar várias barreiras). O ensaio é validado ou 1) por determinar a sobrevivência da estirpe mutante skn-1 ou 2) por derrubando skn-1 usando RNAi em worms em relação a N2 selvagem-tipo e vermes Tratado de controle de vetor. SKN-1 é um fator de transcrição importante que regula a resposta de estresse oxidativo em c. elegans23,24,25. Além de ensaios de sobrevivência, uma estirpe de worm expressando um repórter transgénico SKN-1B/C::GFP é usada para monitorar a ativação da estresse oxidativo resposta através da produção de H2O2 pelo grupo mitis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:845px;" width="845">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Media and chemicals</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Bacto peptone&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0118-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Bacto Todd Hewitt Broth</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0492-17-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD BBL Sheep Blood, Defibrinated&#160;&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B11947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Difco Agar&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0145-17-0</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Difco LB Broth</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0446-17-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blood agar (TSA with Sheep Blood)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R01200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Carbenicillin</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP26481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Catalase&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C1345-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ICN10138201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">IPTG</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MP21021012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Nystatin</td>
			<td style="width:179px;">Acros organics</td>
			<td style="width:119px;">AC455500050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium chloride&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SS266-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">8.25% Sodium Hypochlorite</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Streptomycin Sulfate&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP910-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Tetracyclin</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">87128-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">(&#8722;)-Tetramisole hydrochloride</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L9756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1422-500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Consumables&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-565-269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 x 10 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">No. 1.5&#160; 18 mm X 18 mm Cover Slips</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-541A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-544-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Software&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Prism</td>
			<td style="width:179px;">Graphpad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Bacterial Strains</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. oralis ATCC 35037</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. mitis ATCC 49456</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. gordonii DL1 Challis&#160;&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">E. coli OP50</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">E. coli HT115</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Worm Strains</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Strain</td>
			<td style="width:179px;">Genotype</td>
			<td style="width:119px;">Transgene</td>
			<td>Source</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">N2</td>
			<td style="width:179px;">C. elegans wild isolate</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">EU1</td>
			<td style="width:179px;">skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">LD002</td>
			<td style="width:179px;">IdIs1</td>
			<td style="width:119px;">SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)</td>
			<td>Keith Blackwell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying oxidative stress caused by the mitis group streptococci in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (c. elegans), um nematódeo de vida livre, tem emergido como um modelo atraente para estudar interações patógeno-hospedeiro. O protocolo apresentado usa esse modelo para determinar a patogenicidade causada por estreptococos de grupo o mitis através da produção de H2O2. Os estreptococos do grupo mitis são uma ameaça emergente que causam muitas doenças humanas tais como bacteremia, endocardite e celulite orbital. Aqui descrito é um protocolo para determinar a sobrevivência destes vermes em resposta a H2O2 produzido por este grupo de patógenos. Usando a codificação de skn-1 gene para um fator de transcrição de resposta de estresse oxidativo, é mostrado que este modelo é importante para a identificação de genes do hospedeiro que são essenciais contra a infecção estreptocócica. Além disso, é mostrado que a ativação da resposta ao estresse oxidativo pode ser monitorada na presença desses patógenos utilizando uma cepa de worm repórter transgénicas, no qual SKN-1 é fundido a proteína verde fluorescente (GFP). Estes ensaios fornecem a oportunidade de estudar a resposta de estresse oxidativo de H2O2 , derivada de uma fonte biológica, ao contrário de forma exógena adicionado fontes de (ROS) de espécies reactivas de oxigénio.

Membros do mitis grupo S. mitis, S. oral e S. gordonii rapidamente mataram os vermes, ao contrário de S. mutans, S. salivarius e não-patogênicas de Escherichia coli OP50(Figura 3). A sobrevida mediana para S. mitis, S. oral e S. gordonii foi 300 min, 300 min e min 345, respectivamente. Para determinar se a matança foi mediada por H2O2, c...

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Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

O nemátodo Caenorhabditis elegans é um excelente modelo para dissecar as interações patógeno-hospedeiro. Aqui descrito é um protocolo para infectar o verme com membros dos estreptococos do grupo mitis e determinar a ativação da resposta stress oxidativo contra H2O2 , produzido por este grupo de organismos.

Estudando estresse oxidativo causado pelo estreptococos grupo Mitis em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Neste protocolo demonstramos como usar um método de vida livre c. elegans para elucidar a patogenicidade causada pelo peróxido de hidrogênio produzido através de estreptococos do Grupo Mitis. A principal vantagem desta técnica é que podemos estudar a patogenicidade e a ativação das respostas ao estresse no verme usando uma fonte biológica sustentável de espécies de oxigênio reativo em oposição a fontes químicas Para um litro de mídia adicionar 30g de pó todd hewitt, 2g de extrato de levedura e 20g de ager a um frasco Erlin Myer de 2 litros.Adicione 970ml de água deionizada ao conteúdo do frasco e coloque em uma barra de mexida. Use papel alumínio para cobrir a abertura. Autoclave a mídia no frasco a uma temperatura de 121 graus Celsius e pressão de 15 libras por polegada quadrada por 30 minutos.Depois disso, coloque o frasco em uma placa de agitação para esfriar com agitação suave. Sob um capô laminar, despeje a mídia em pratos petri apropriadamente dimensionados e estéreis. Deixe a mídia secar por 2 horas.Depois disso, guarde as placas a 4 graus Celsius por até 1 mês. Antes da preparação do Grupo Mitis streptococci, aqueça as placas de ágar thy em uma incubadora a 37 graus Celsius. Depois disso, use um laço estéril para exatar as cepas desejadas de estrepticocci nos locais.Em seguida, coloque as placas em um frasco de vela e incubar o frasco a 37 graus Celsius durante a noite por cerca de 18 horas para fornecer um ambiente microerófilo. No dia seguinte, remova as placas do frasco de velas e use um laço estéril para escolher colônias isoladas. Inocular tubos cônicos estéreis de 15 ml contendo 2 ml de caldo THY.Feche as tampas apertadas e incubar os tubos a 37 graus Celsius em condições estáticas. Placas de THY pré-aquecidas em uma incubadora a 37 graus Celsius adicionam 50 microliters de solução contendo 1000 unidades de catalase na placa THY. Use um espalhador estéril para espalhar a solução de catalase e deixe as placas secarem na coifa de fluxo laminar por 30 minutos.Para semear as placas com as cepas de estreptococos, use uma pipeta para adicionar 80 microliters de culturas cultivadas durante a noite à placa e use um espalhador estéril para espalhar as bactérias completamente pela superfície do ágar. Incubar as placas a 37 graus Celsius em um frasco de velas durante a noite. Como controle, em duas placas de NGM, adicione 80 microliters de culturas cultivadas durante a noite de E.coli OP-50 para semeadura.Incubar as placas a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, retire as placas do frasco de velas e deixe as placas esfriarem até a temperatura ambiente. Usando uma picareta de vermes estéril, transfira 30 larvas L4 das placas de alimentação do NGM para as placas de TEU semeadas de estreptococos.Incubar as placas a 25 graus Celsius. Sob um microscópio dissecando, conte o número de larvas L4 vivas e mortas em cada placa em vários pontos de tempo. Use a picareta de vermes estéreis para gentilmente cutucar os vermes e determinar se eles estão vivos ou mortos.Inicialmente, marque os vermes como mortos ou viva a cada 30 minutos. Quando os vermes começarem a morrer rapidamente, marque-os em intervalos de 15 minutos. O ensaio levará de 5 a 6 horas para ser concluído.Depois disso, repita o experimento mais duas vezes. Para preparar a almofada de agarose, coloque o labtape longitudinalmente ao longo de duas lâminas de vidro. Isso determinará a espessura das almofadas agarose.Coloque um deslizamento de vidro limpo entre os dois slides colados. Dissolver agarose em água deionizada para fazer 2 por cento de volume de peso e aquecer a solução em um micro-ondas. Use uma pipeta para colocar 100 microliters de agarose derretida no centro do escorregador limpo.Coloque imediatamente outro deslizamento de vidro limpo em cima da agarose derretida e pressione suavemente para baixo para fazer uma almofada. Deixe que a agarose solidifique e, posteriormente, remova o slide superior. A almofada de agarose está pronta para uso.Placas thy pré-aquecidas a 37 graus Celsius. Semente as placas com um estreptococos cepas como feito anteriormente nos ensaios de sobrevivência. Semente 3 placas de NGM com E-coli OP-50 como controle e incubação a 37 graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, esfrie as placas à temperatura ambiente. Use tampão M9W para lavar larvas L4 de placas de alimentação NGM ou NGM RNAi em tubos cônicos de 15 ml. Gire os tubos a 450 vezes g, por um minuto em uma centrífuga.Decante o supernasal e adicione 10 ml de M9W a cada tubo. Repita o passo centrífuga mais três vezes. Suspenda os vermes em 250 microlitadores de M9W e coloque três gotas de 5 microliteres da suspensão do verme em uma tampa limpa de placa de Petri.Sob um microscópio dissecando, estimar o número de vermes por microliter. Usando uma pipeta, adicione aproximadamente 100 larvas L4 a cada estreptococos de TE THY semeadas e placas semeadas NGM E.coli. Use três placas por cepa de bactérias.Incubar as placas por 2 a 3 horas a 25 graus Celsius. Depois disso, remova as placas da incubadora. Lave-os com M9W e colete os vermes em tubos cônicos de 15ml.Lave os vermes três vezes mais do que antes na etapa centrífuga. Remova a maior parte do M9W por aspiração. E adicione 500 microlitres de M9W contendo 2 milimônios de azida de sódio ou cloridrato de tetramisole à pelota de verme para anestesia.Incubar o tubo com pelotas de vermes em temperatura ambiente por 15 minutos. Então, solte 15 microliters da suspensão do verme em uma almofada de agorose preparada. Sob um microscópio fluorescente, visualize a localização dos filtros Skn-1 utilizando filtros Fitzy e Dappy.Vermes de imagem em 10 vezes e 20 vezes ampliações. Escore os vermes com base em três níveis de localização;baixa localização, onde não é observada localização nuclear, localização média, com SKN 1 BCGFP no anterior ou posterior do verme, e alta localização, onde a localização nuclear de skn-1 BCGFP é observada em todas as células intestinais. Neste experimento, membros do Grupo Mitis rapidamente mataram os vermes, ao contrário de S.mutans, S.salivarius e E.coli OP-50 não patogênicos.Quando a catalase foi suplementada à THY ager, a morte dos vermes foi abolida. A morte dos vermes não foi observada na cepa mutante delta spxB em comparação com as cepas de tipo selvagem e elogios. Esses dados sugerem que o peróxido de hidrogênio produzido pelo Grupo Mitis media a morte dos vermes.Observou-se uma diminuição significativa na sobrevivência dos vermes knockdown skn-1 em comparação com os vermes tratados pelo controle vetorial. Um fenótipo de morte semelhante foi observado com a cepa mutante skn-1 e os vermes do tipo selvagem N2. Isso demonstra que o skn-1 influencia a sobrevivência dos vermes no Grupo Mitis.A localização do skn-1 BCGFP foi observada em vermes expostos às cepas de n-compliment do tipo selvagem e não em resposta à cepa mutante Delta spxB do S cordonae. Depois que componentes da via de quinase do mapa P38 foram derrubados, observou-se a localização reduzida de vermes tratados skn-1 BCGFP e knockdown, em relação aos vermes tratados com controle vetorial. Usando o estreptococo c.sistema elegans, os efeitos do peróxido de hidrogênio no estresse verticular endoplasmica, dano mitocondrial, mitoforgia e tophogia podem ser estudados. Além disso, podem ser identificados mecanismos pelos quais o peróxido de hidrogênio atua como fator de viriecência para obter respostas imunes, interrompendo os processos centrais da célula.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Avaliação Compreensiva de Germline Chemical Toxicity Usando o Nemátodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Biologia do Desenvolvimento

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Espaciais e temporais Análise do Active ERK na<em&gt; C. elegans</em&gt; germinativa

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Imobilização de Caenorhabditis elegans , para analisar o transporte intracelular nos neurônios

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Aplicação de RNAi e calor-choque-induzida expressão de fator de transcrição para reprogramar as células germinativas de neurônios em c. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Avaliação dos lisossomos Alkalinization no intestino de viver elegans de Caenorhabditis

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Análise computacional do Germline Caenorhabditis elegans , para estudar a distribuição de núcleos, as proteínas e o citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualizando o nó e placa Notochordal em Gastrulating embriões de rato usando microscopia eletrônica e imunofluorescência de montagem inteira

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

A Mini-Invasive Internal Fixation Technique for Studying Immobilization-Induced Knee Flexion Contracture in Rats

Técnica de fixação interna mini-invasiva para estudo de contratura de flexão de joelho induzida por imobilização em ratos

Joint contracture, resulting from a prolonged joint immobilization, is a common complication in orthopedics. Currently, utilizing an internal fixation to ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Microscopia de folha de luz isotrópica e análise de linhagem de células automatizadas para catalogar Caenorhabditis elegans Embryogenesis com resolução subcelular

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Medindo a orientação e a motilidade do esperma dentro do intervalo reprodutivo hermafrodita dos elegans de Caenorhabditis

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...