Name: studying oxidative stress caused by the mitis group streptococci in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-03-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Мы благодарим Бинг-Ян Ванг, доктор гена Трибл (Техасский университет, Школа стоматологии), д-р Ричард Ламонт (Луисвиллский университет, Школа стоматологии) и д-р Самуил Shelburne (MD Anderson Cancer Center) для предоставления лабораторных и клинических штаммов mitis стрептококки группы. Мы также благодарим д-р Кит Blackwell (Кафедра генетики, Гарвардской медицинской школы) для штаммов C. elegans . Наконец мы благодарим д-р Даниэль Garsin и ее лаборатории (университета Техаса, Макговерн медицинская школа) за предоставление реагентов и червь штаммов для проведения исследования. Некоторые штаммы червя были предоставлены CGC, которая финансируется Управлением NIH инфраструктуры научно-исследовательских программ (P40 OD010440).

1. Подготовка твоего плиты агара (Todd Хьюитт дрожжевой экстракт)
<ol><li>На 1 Л СМИ добавьте 30 г порошка Тодд-Хьюитт, 2 г экстракта дрожжей и 20 г агар колбу Эрленмейера 2 Л. Добавить содержимое колбы 970 мл деионизированной воды и включают в себя бар stir. Автоклав СМИ при температуре 121 ° C и давлени?...

<ol>
	<li>Human Microbiome Project, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+diversity+of+the+healthy+human+microbiome.">Structure, function and diversity of the healthy human microbiome.</a> Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).</li><li>Mitchell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+mitis:+walking+the+line+between+commensalism+and+pathogenesis.">Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis.</a> Molecular Oral Microbiology. 26 (2), 89-98 (2011).</li><li>Dyson, C., Barnes, R. A., Harrison, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infective+endocarditis:+an+epidemiological+review+of+128+episodes.">Infective endocarditis: an epidemiological review of 128 episodes.</a> Journal of Infection. 38 (2), 87-93 (1999).</li><li>Sahasrabhojane, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-level+assessment+of+the+molecular+basis+of+fluoroquinolone+resistance+among+viridans+group+streptococci+causing+bacteraemia+in+cancer+patients.">Species-level assessment of the molecular basis of fluoroquinolone resistance among viridans group streptococci causing bacteraemia in cancer patients.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 43 (6), 558-562 (2014).</li><li>Shelburne, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+mitis+strains+causing+severe+clinical+disease+in+cancer+patients.">Streptococcus mitis strains causing severe clinical disease in cancer patients.</a> Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 762-771 (2014).</li><li>van der Meer, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution,+antibiotic+susceptibility+and+tolerance+of+bacterial+isolates+in+culture-positive+cases+of+endocarditis+in+The+Netherlands.">Distribution, antibiotic susceptibility and tolerance of bacterial isolates in culture-positive cases of endocarditis in The Netherlands.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 10 (9), 728-734 (1991).</li><li>Han, X. Y., Kamana, M., Rolston, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viridans+streptococci+isolated+by+culture+from+blood+of+cancer+patients:+clinical+and+microbiologic+analysis+of+50+cases.">Viridans streptococci isolated by culture from blood of cancer patients: clinical and microbiologic analysis of 50 cases.</a> Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 160-165 (2006).</li><li>Hoshino, T., Fujiwara, T., Kilian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+phylogenetic+and+phenotypic+analyses+to+identify+nonhemolytic+streptococci+isolated+from+bacteremic+patients.">Use of phylogenetic and phenotypic analyses to identify nonhemolytic streptococci isolated from bacteremic patients.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (12), 6073-6085 (2005).</li><li>Kohno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+complications+in+patients+receiving+autologous+CD34-selected+hematopoietic+stem+cell+transplantation+for+severe+autoimmune+diseases.">Infectious complications in patients receiving autologous CD34-selected hematopoietic stem cell transplantation for severe autoimmune diseases.</a> Transplant Infectious Disease. 11 (4), 318-323 (2009).</li><li>Zhu, L., Kreth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+hydrogen+peroxide+in+environmental+adaptation+of+oral+microbial+communities.">The role of hydrogen peroxide in environmental adaptation of oral microbial communities.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 717843 (2012).</li><li>Okahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+contributes+to+the+epithelial+cell+death+induced+by+the+oral+mitis+group+of+streptococci.">Hydrogen peroxide contributes to the epithelial cell death induced by the oral mitis group of streptococci.</a> PLoS One. 9 (1), 88136 (2014).</li><li>Stinson, M. W., Alder, S., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+and+killing+of+human+endothelial+cells+by+viridans+group+streptococci.">Invasion and killing of human endothelial cells by viridans group streptococci.</a> Infection and Immunity. 71 (5), 2365-2372 (2003).</li><li>Rai, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pneumoniae+secretes+hydrogen+peroxide+leading+to+DNA+damage+and+apoptosis+in+lung+cells.">Streptococcus pneumoniae secretes hydrogen peroxide leading to DNA damage and apoptosis in lung cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (26), 3421-3430 (2015).</li><li>Braun, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumococcal+pneumolysin+and+H(2)O(2)+mediate+brain+cell+apoptosis+during+meningitis.">Pneumococcal pneumolysin and H(2)O(2) mediate brain cell apoptosis during meningitis.</a> Journal of Clinical Investigation. 109 (2), 19-27 (2002).</li><li>Naji, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activation+of+the+oxidative+stress+response+transcription+factor+SKN-1+in+Caenorhabditis+elegans+by+mitis+group+streptococci.">The activation of the oxidative stress response transcription factor SKN-1 in Caenorhabditis elegans by mitis group streptococci.</a> PLoS One. 13 (8), 0202233 (2018).</li><li>Bolm, M., Jansen, W. T., Schnabel, R., Chhatwal, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide-mediated+killing+of+Caenorhabditis+elegans:+a+common+feature+of+different+streptococcal+species.">Hydrogen peroxide-mediated killing of Caenorhabditis elegans: a common feature of different streptococcal species.</a> Infection and Immunity. 72 (2), 1192-1194 (2004).</li><li>Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+worm+has+turned--microbial+virulence+modeled+in+Caenorhabditis+elegans.">The worm has turned--microbial virulence modeled in Caenorhabditis elegans.</a> Trends in Microbiology. 13 (3), 119-127 (2005).</li><li>Irazoqui, J. E., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=99th+Dahlem+conference+on+infection,+inflammation+and+chronic+inflammatory+disorders:+Caenorhabditis+elegans+as+a+model+to+study+tissues+involved+in+host+immunity+and+microbial+pathogenesis.">99th Dahlem conference on infection, inflammation and chronic inflammatory disorders: Caenorhabditis elegans as a model to study tissues involved in host immunity and microbial pathogenesis.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 160 (1), 48-57 (2010).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+and+Aging+in+Caenorhabditis+elegans:+Causal+or+Casual+Relationship.">Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 13 (12), 1911-1953 (2010).</li><li>Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+C.+elegans+for+aging+research.">Using C. elegans for aging research.</a> Invertebrate Reproduction &amp; Development. 59, 59-63 (2015).</li><li>Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKN-1/Nrf,+stress+responses,+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 88, 290-301 (2015).</li><li>Irazoqui, J. E., Urbach, J. M., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+host+innate+defence:+insights+from+Caenorhabditis+elegans+and+primitive+invertebrates.">Evolution of host innate defence: insights from Caenorhabditis elegans and primitive invertebrates.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (1), 47-58 (2010).</li><li>Park, S. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+as+mediated+by+SKN-1.">Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1.</a> Aging Cell. 8 (3), 258-269 (2009).</li><li>An, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Caenorhabditis+elegans+oxidative+stress+defense+protein+SKN-1+by+glycogen+synthase+kinase-3.">Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).</li><li>An, J. H., Blackwell, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKN-1+links+C.+elegans+mesendodermal+specification+to+a+conserved+oxidative+stress+response.">SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response.</a> Genes &amp; Development. 17 (15), 1882-1893 (2003).</li><li>Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+of+hydrogen+peroxide+produced+by+Enterococcus+faecium.">Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium.</a> Infection and Immunity. 72 (8), 4512-4520 (2004).</li><li>Pincus, Z., Mazer, T. C., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+as+a+measure+of+senescence+in+C.+elegans:+look+to+red,+not+blue+or+green.">Autofluorescence as a measure of senescence in C. elegans: look to red, not blue or green.</a> Aging (Albany NY). 8 (5), 889-898 (2016).</li><li>Teuscher, A. C., Ewald, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+Autofluorescence+to+Assess+GFP+Expression+During+Normal+Physiology+and+Aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Overcoming Autofluorescence to Assess GFP Expression During Normal Physiology and Aging in Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 8 (14), (2018).</li></ol>

Описанные методы могут использоваться для других патогенных бактерий, таких как Enterococcus faecium, который также производит H2O2 выращиваемой в анаэробных или микроаэрофильных условиях26. Как правило для самых патогенных организмов, она занимает несколько дней, н?...

Стрептококки группы Mitis являются человеческие Комменсалами орофарингеальной области полости1. Однако эти организмы могут избежать этой ниши и вызывают различные заболевания инвазивным2. Инфекции, вызванные эти микроорганизмы включают бактериемии, эндокардите и орбитального целлюлита2,3,4,5,6. Кроме того, они появляются как возбудителей инфекций кровотока в нейтропенических с ослабленным иммунитетом и больных раком, которые прошли химиотерапию5,,78,9 .
Механизмы, основные группы патогенеза mitis скрывать, потому что было выявлено несколько факторов вирулентности. Известно, что группа mitis производят H2O2, который показал, чтобы играть важную роль в устной микробных сообществ10. Совсем недавно несколько исследований показали роль H2O2 как cytotoxin, которая вызывает эпителиальных клеток смерть11,12. Было показано, что S. пневмонии, которая принадлежит к этой группе, производят высокий уровень H2O2 , которая вызывает повреждение ДНК и апоптоз в альвеолярных клеток13. Использование животной модели острой пневмонии, же исследователи показали, что производство H2O2 бактериями дает преимущества вирулентности. Исследования по пневмококковой инфекции менингит также показали, что возбудитель производные H2O2 действует синергически с pneumolysin для запуска нейрональных клеток смерть14. Эти наблюдения четко установить, что подготовленные этой группой бактерий H2O2 имеет важное значение для их патогенности.
Интересно, что он также было показано что члены mitis группы S. mitis и S. oralis вызывают смерть нематоды C. elegans через производство H2O215,16. Это Свободноживущие нематоды использовался как простой, генетически шансов справиться с возникающими модель для изучения многих биологических процессов. Совсем недавно червь стала моделью для изучения хост возбудитель взаимодействия17,18. Кроме того некоторые исследования показали важность изучения оксидативного стресса, используя этот организм19,,2021. Его короткий жизненный цикл, способность после нокдауна генов интерес к RNAi и использование зеленого флуоресцентного белка (ГПУП)-плавленый репортеров для мониторинга экспрессии генов являются одними из атрибутов, которые делают его привлекательным модели системы. Что еще более важно пути, которые регулируют оксидативного стресса и врожденный иммунитет в червь высоко консервируют с млекопитающих20,22.
В этом протоколе показано, как использовать C. elegans для выяснения патогенности, вызванных стрептококками производные H2O2. Показано изменение выживания пробирного, и члены группы mitis способны убить черви быстро через производство H2O2. С помощью членов группы mitis, устойчивый биологический источник реактивнооксигенных видов (ROS) при условии, в отличие от химических источников, которые вызывают Оксидативный стресс в глистах. Кроме того бактерии способны колонизировать черви быстро, что позволяет для H2O2 быть непосредственно направлены на кишечные клетки (по сравнению с другими источниками, которые должны пересечь несколько барьеров). Assay проверяется либо 1) путем определения выживания мутантный штамм skn-1 или 2), стучать вниз skn-1 с помощью РНК-интерференции в червей по отношению к N2 одичал тип и вектор управления лечение глистов. SKN-1 является важным транскрипционный фактор, который регулирует оксидативного стресса ответ в C. elegans23,24,25. Помимо выживания анализов червь штамм, выражая трансгенных репортер SKN-1B/C::GFP используется для отслеживания активации окислительного стресса ответ через производство H2O2 mitis группой.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:845px;" width="845">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Media and chemicals</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Bacto peptone&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0118-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Bacto Todd Hewitt Broth</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0492-17-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD BBL Sheep Blood, Defibrinated&#160;&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B11947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Difco Agar&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0145-17-0</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Difco LB Broth</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0446-17-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blood agar (TSA with Sheep Blood)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R01200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Carbenicillin</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP26481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Catalase&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C1345-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ICN10138201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">IPTG</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MP21021012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Nystatin</td>
			<td style="width:179px;">Acros organics</td>
			<td style="width:119px;">AC455500050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium chloride&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SS266-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">8.25% Sodium Hypochlorite</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Streptomycin Sulfate&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP910-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Tetracyclin</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">87128-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">(&#8722;)-Tetramisole hydrochloride</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L9756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1422-500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Consumables&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-565-269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 x 10 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">No. 1.5&#160; 18 mm X 18 mm Cover Slips</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-541A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-544-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Software&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Prism</td>
			<td style="width:179px;">Graphpad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Bacterial Strains</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. oralis ATCC 35037</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. mitis ATCC 49456</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. gordonii DL1 Challis&#160;&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">E. coli OP50</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">E. coli HT115</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Worm Strains</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Strain</td>
			<td style="width:179px;">Genotype</td>
			<td style="width:119px;">Transgene</td>
			<td>Source</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">N2</td>
			<td style="width:179px;">C. elegans wild isolate</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">EU1</td>
			<td style="width:179px;">skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">LD002</td>
			<td style="width:179px;">IdIs1</td>
			<td style="width:119px;">SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)</td>
			<td>Keith Blackwell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying oxidative stress caused by the mitis group streptococci in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), Свободноживущие нематоды, стала привлекательной модель для изучения взаимодействия хост патогена. Представленные протокол использует эту модель для определения патогенности, вызванных стрептококки группы mitis через производство H2O2. Стрептококки группы mitis являются возникающие угрозы, что причиной многих заболеваний человека как бактериемия, эндокардите и орбитального целлюлита. Описанные здесь протокол для определения выживание этих червей в ответ H2O2 производится по этой группе патогенов. В кодировке гена skn-1 для окислительного стресса ответ транскрипционный фактор, показано, что эта модель имеет важное значение для идентификации узла генов, которые необходимы против стрептококковой инфекции. Кроме того показано, что активации реакции окислительного стресса могут контролироваться в присутствии этих патогенов с помощью штамм червь трансгенных репортер, в котором SKN-1 сливается с зеленого флуоресцентного белка (ГПУП). Эти анализы обеспечивают добавлена возможность для изучения оксидативного стресса ответ H2O2 экзогенно получаемых биологический источник в отличие от реактивнооксигенных видов (ров) источников.

Члены mitis группы S. mitis, S. oralis и S. gordonii быстро убили червей, в отличие от Streptococcus mutans, S. salivarius и непатогенные E. coli ОР50 (рисA). Медиана выживаемости для S. mitis, S. oralis и S. gordonii составила 300 мин, 300 мин и 345 мин, соотв...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Нематоды Caenorhabditis elegans является прекрасной моделью для рассечения хост возбудитель взаимодействий. Описанные здесь — это протокол для заразить червь с членами mitis стрептококки группы и определения активации окислительного стресса ответ против H2O2 подготовленные этой группой организмов.

Изучения оксидативного стресса, вызванного стрептококки группы Mitis в Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

В этом протоколе мы демонстрируем, как использовать бесплатный метод жизни c. elegans, чтобы прояснить патогенность, вызванную перекисью водорода, вырабатываемой через стрептококки Mitis Group. Основным преимуществом этого метода является то, что мы можем изучать патогенность и активацию стрессовых реакций в черве, используя устойчивый биологический источник реактивных видов кислорода в отличие от химических источников Для одного литра средств массовой информации добавить 30 г порошка Тодд Хьюитт, 2 г дрожжевого экстракта и 20 г агера до 2 литровой колбы Эрлин Майер.Добавьте 970 мл деионизированной воды в содержимое колбы и положите в бар для перемешивания. Используйте алюминиевую фольгу, чтобы покрыть отверстие. Автоклав средств массовой информации в колбе при температуре 121 градусов по Цельсию и давление 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 30 минут.После этого установите колбу на тарелку для перемешивания, чтобы остыть с нежным перемешиванием. Под ламинарный капюшон, залить средства массовой информации в соответствующих размеров, стерильные блюда Петри. Дайте средствам массовой информации высохнуть в течение 2 часов.После этого хранить пластины при 4 градусах по Цельсию на срок до 1 месяца. Перед приготовлением стрептококков Mitis Group разогреть агарные пластины THY в инкубаторе до 37 градусов по Цельсию. После этого используйте стерильную петлю, чтобы выть желаемые штаммы стрептикоччи на местах.Затем положить пластины в банку свечи и инкубировать банку при 37 градусов по Цельсию на ночь в течение примерно 18 часов, чтобы обеспечить микроэрофильной среде. На следующий день снимите пластины со свечи и используйте стерильную петлю, чтобы выбрать изолированные колонии. Привить 15 мл стерильных конических трубок, содержащих 2 мл бульона THY.Закройте крышки плотно и инкубировать трубки при 37 градусах по Цельсию в статических условиях. Предварительно теплые пластины THY в инкубаторе до 37 градусов по Цельсию добавляют 50 микролитров раствора, содержащего 1000 единиц каталазы на пластине THY. Используйте стерильный распространитель для распространения раствора каталазы и дайте пластинам высохнуть на капоте ламинарного потока в течение 30 минут.Чтобы посеять пластины с штаммами стрептококка, используйте пипетку, чтобы добавить 80 микролитров ночных выращенных культур к пластине и использовать стерильный распространитель для распространения бактерий полностью по всей поверхности агара. Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию в свече банку на ночь. В качестве контроля, на двух ngM пластин, добавить 80 микролитров ночь выросли культуры E.coli OP-50 для посева.Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию в одночасье. На следующий день снимите пластины со свечи и дайте пластинам остыть до комнатной температуры. Используя стерильный червь забрать, передачи 30 L4 личинок из NGM кормления пластин стрептококк семенами THY пластин.Инкубировать пластины при 25 градусах по Цельсию. Под рассеченным микроскопом подсчитайте количество живых и мертвых личинок L4 на каждой пластине в несколько точек времени. Используйте стерильный червь выбрать мягко подталкивать червей и определить, если они мертвы или живы.Первоначально, оценка червей, как мертвые или жить каждые 30 минут. Когда черви быстро начинают умирать, оценка их с интервалом в 15 минут. Анализ займет от 5 до 6 часов.После этого повторите эксперимент еще два раза. Чтобы подготовить агарозную площадку, придерживайтесь лабтепа вдоль двух стеклянных горок. Это позволит определить толщину агарозы колодки.Поместите чистую стеклянную горку между двумя лентой слайдов. Растворите агарозу в деионизированной воде, чтобы сделать 2 процента веса и нагреть раствор в микроволновой печи. Используйте пипетку, чтобы разместить 100 микролитров расплавленной агары на центре чистой горки.Немедленно поместите еще один чистый стеклянный слайд на верхней части расплавленной агарозы и осторожно нажмите вниз, чтобы сделать площадку. Разрешить агарозы затвердеть и впоследствии удалить верхний слайд. Площадка агароза готова к использованию.Предварительно теплые пластины THY до 37 градусов по Цельсию. Семя пластин с штаммами стрептококка, как это было сделано ранее в анализе выживаемости. Семя 3 NGM пластин с E-coli OP-50 в качестве контроля и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в одночасье.На следующий день охлади тарелки до комнатной температуры. Используйте буфер M9W для мытья личинок L4 из NGM или NGM РНК кормления пластин в 15 мл конических труб. Спин трубки при 450 раз г, в течение одной минуты в центрифуге.Декант супернатант и добавить 10 мл M9W к каждой трубке. Повторите центробежный шаг еще три раза. Повторно приостанавливать червей в 250 микролитров M9W и место три 5 микролитров капли червя подвески на чистую крышку чашки Петри.Под рассеченным микроскопом оцените количество червей на микролитер. Используя пипетку, добавьте около 100 личинок L4 к каждому thy streptococcus seededus и NGM E.coli посеянным пластинам. Используйте три пластины на штамм бактерий.Инкубировать пластины в течение 2 до 3 часов при 25 градусах по Цельсию. После этого снимите пластины с инкубатора. Вымойте их с M9W и собирать червей в 15 мл конических труб.Вымойте червей в три раза, как это было сделано ранее в центробежной шаг. Удалите большую часть M9W путем устремления. И добавить 500 микролитров M9W, содержащих 2 миллимолярный азид натрия или тетрамизол гидрохлорид червя гранулы для анестезии.Инкубировать трубку с червя гранулы при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем уроните 15 микролитров подвески червя на подготовленную агорозную площадку. Под флуоресцентным микроскопом визуализируете локализацию skn-1 с использованием фильтров Fitzy и Dappy.Изображение червей в 10 раз и 20 раз больше. Оценка червей на основе трех уровней локализации;низкая локализация, где не наблюдается ядерной локализации, средняя локализация, с SKN 1 BCGFP в передней или задней части червя, и высокая локализация, где ядерная локализация skn-1 BCGFP наблюдается во всех кишечных клетках. В этом эксперименте члены группы Mitis быстро убили червей, в отличие от S.mutans, S.salivarius и непатогенных E.coli OP-50.Когда каталаза была дополнена THY ager, убийство червей было отменено. Смерть червей не наблюдалась на штамме мутантов дельта spxB по сравнению с штаммами дикого типа и комплиментами. Эти данные свидетельствуют о том, что перекись водорода, производимая Mitis Group, является посредником в убийстве червей.Значительное снижение выживаемости червей нокдауна skn-1 наблюдалось по сравнению с векторным контролем обработанных червей. Аналогичный фенотип убийства наблюдался с штаммом мутантов skn-1 и червями дикого типа N2. Это показывает, что skn-1 влияет на выживание червей на Mitis Group.Локализация skn-1 BCGFP наблюдалась у червей, подвергшихся воздействию штаммов N-комплиментов дикого типа, а не в ответ на штамм мутантов Delta spxB s cordonae. После того, как компоненты карты P38 киназы пути были сбиты, снижение локализации skn-1 BCGFP и нокдаун обработанных червей, по отношению к вектору контроля обработанных червей, было отмечено. С помощью стрептококков c.elegans системы, влияние перекиси водорода на эндоплазмический вертикулярный стресс, митохондриальные повреждения, митохогии, и тофогия могут быть дополнительно изучены. Более того, механизмы, с помощью которых перекись водорода действует как фактор вирилесценции, чтобы вызвать иммунные реакции, нарушая основные процессы клетки могут быть определены.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Комплексная оценка зародышевой линии химической токсичности Использование нематоды<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Пространственный и временной анализ активного ERK в<em&gt; C. Элеганс</em&gt; Половые

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Иммобилизация Caenorhabditis elegans для анализа внутриклеточного транспорта в нейроны

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Применение РНК-интерференции и тепло шок индуцированной выражение фактор транскрипции для перепрограммирования клетки семенозачатка нейронов в C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Оценка лизосомальных подщелачивание в кишечнике Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Вычислительный анализ микрофлорой Caenorhabditis elegans для изучения распределения ядер, белки и Цитоскелет

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Визуализация узлов и Notochordal пластины в Gastrulating эмбрионов мыши, используя растровая электронная микроскопия и вся гора иммунофлуоресценции

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

A Mini-Invasive Internal Fixation Technique for Studying Immobilization-Induced Knee Flexion Contracture in Rats

Мини-инвазивных внутренней фиксации Техника для изучения иммобилизации индуцированной колено Flexion Контрактура у крыс

Joint contracture, resulting from a prolonged joint immobilization, is a common complication in orthopedics. Currently, utilizing an internal fixation to ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Изотропная световая микроскопия и автоматизированный анализ линии клеток для каталога Caenorhabditis elegans Embryogenesis с подклеточным разрешением

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Измерение сперматозоидов Руководство и подвижность в Caenorhabditis elegans Гермафродит репродуктивного тракта

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...