Name: studying oxidative stress caused by the mitis group streptococci in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-03-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Agradecemos al Dr. Bing-Yan Wang, Dr. Gena Tribble (la Universidad de Texas, escuela de Odontología), Dr. Richard Lamont (Universidad de Louisville, Facultad de Odontología) y Dr. Samuel Shelburne (MD Anderson Cancer Center) laboratorio y cepas clínicas de los estreptococos del grupo mitis. También agradecemos a Dr. Keith Blackwell (Departamento de genética, escuela de medicina de Harvard) para las cepas de C. elegans . Finalmente, agradecemos a su laboratorio (la Universidad de Texas, escuela de medicina de McGovern) y Dr. Danielle Garsin para proporcionar reactivos y cepas de gusano para realizar el estudio. Algunas cepas de gusano fueron proporcionados por la CGC, que es financiada por los NIH oficina de programas de infraestructura de investigación (P40 OD010440).

1. preparación de tus placas de Agar (Extracto de levadura de Todd-Hewitt)
<ol><li>Para 1 L de media, agregue 30 g de polvo de Todd-Hewitt, 2 g de extracto de levadura y 20 g de agar a un matraz de Erlenmeyer de 2 L. Agregar 970 mL de agua desionizada para el contenido del matraz e incluir una barra de agitación. Autoclave de los medios de comunicación a una temperatura de 121 ° C y presión de 15 lb/pulgada2 por 30 min. Después de eso, establecer los medios de comunicación en una placa de agitación y...

<ol>
	<li>Human Microbiome Project, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+diversity+of+the+healthy+human+microbiome.">Structure, function and diversity of the healthy human microbiome.</a> Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).</li><li>Mitchell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+mitis:+walking+the+line+between+commensalism+and+pathogenesis.">Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis.</a> Molecular Oral Microbiology. 26 (2), 89-98 (2011).</li><li>Dyson, C., Barnes, R. A., Harrison, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infective+endocarditis:+an+epidemiological+review+of+128+episodes.">Infective endocarditis: an epidemiological review of 128 episodes.</a> Journal of Infection. 38 (2), 87-93 (1999).</li><li>Sahasrabhojane, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-level+assessment+of+the+molecular+basis+of+fluoroquinolone+resistance+among+viridans+group+streptococci+causing+bacteraemia+in+cancer+patients.">Species-level assessment of the molecular basis of fluoroquinolone resistance among viridans group streptococci causing bacteraemia in cancer patients.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 43 (6), 558-562 (2014).</li><li>Shelburne, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+mitis+strains+causing+severe+clinical+disease+in+cancer+patients.">Streptococcus mitis strains causing severe clinical disease in cancer patients.</a> Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 762-771 (2014).</li><li>van der Meer, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution,+antibiotic+susceptibility+and+tolerance+of+bacterial+isolates+in+culture-positive+cases+of+endocarditis+in+The+Netherlands.">Distribution, antibiotic susceptibility and tolerance of bacterial isolates in culture-positive cases of endocarditis in The Netherlands.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 10 (9), 728-734 (1991).</li><li>Han, X. Y., Kamana, M., Rolston, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viridans+streptococci+isolated+by+culture+from+blood+of+cancer+patients:+clinical+and+microbiologic+analysis+of+50+cases.">Viridans streptococci isolated by culture from blood of cancer patients: clinical and microbiologic analysis of 50 cases.</a> Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 160-165 (2006).</li><li>Hoshino, T., Fujiwara, T., Kilian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+phylogenetic+and+phenotypic+analyses+to+identify+nonhemolytic+streptococci+isolated+from+bacteremic+patients.">Use of phylogenetic and phenotypic analyses to identify nonhemolytic streptococci isolated from bacteremic patients.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (12), 6073-6085 (2005).</li><li>Kohno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+complications+in+patients+receiving+autologous+CD34-selected+hematopoietic+stem+cell+transplantation+for+severe+autoimmune+diseases.">Infectious complications in patients receiving autologous CD34-selected hematopoietic stem cell transplantation for severe autoimmune diseases.</a> Transplant Infectious Disease. 11 (4), 318-323 (2009).</li><li>Zhu, L., Kreth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+hydrogen+peroxide+in+environmental+adaptation+of+oral+microbial+communities.">The role of hydrogen peroxide in environmental adaptation of oral microbial communities.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 717843 (2012).</li><li>Okahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+contributes+to+the+epithelial+cell+death+induced+by+the+oral+mitis+group+of+streptococci.">Hydrogen peroxide contributes to the epithelial cell death induced by the oral mitis group of streptococci.</a> PLoS One. 9 (1), 88136 (2014).</li><li>Stinson, M. W., Alder, S., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+and+killing+of+human+endothelial+cells+by+viridans+group+streptococci.">Invasion and killing of human endothelial cells by viridans group streptococci.</a> Infection and Immunity. 71 (5), 2365-2372 (2003).</li><li>Rai, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pneumoniae+secretes+hydrogen+peroxide+leading+to+DNA+damage+and+apoptosis+in+lung+cells.">Streptococcus pneumoniae secretes hydrogen peroxide leading to DNA damage and apoptosis in lung cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (26), 3421-3430 (2015).</li><li>Braun, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumococcal+pneumolysin+and+H(2)O(2)+mediate+brain+cell+apoptosis+during+meningitis.">Pneumococcal pneumolysin and H(2)O(2) mediate brain cell apoptosis during meningitis.</a> Journal of Clinical Investigation. 109 (2), 19-27 (2002).</li><li>Naji, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activation+of+the+oxidative+stress+response+transcription+factor+SKN-1+in+Caenorhabditis+elegans+by+mitis+group+streptococci.">The activation of the oxidative stress response transcription factor SKN-1 in Caenorhabditis elegans by mitis group streptococci.</a> PLoS One. 13 (8), 0202233 (2018).</li><li>Bolm, M., Jansen, W. T., Schnabel, R., Chhatwal, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide-mediated+killing+of+Caenorhabditis+elegans:+a+common+feature+of+different+streptococcal+species.">Hydrogen peroxide-mediated killing of Caenorhabditis elegans: a common feature of different streptococcal species.</a> Infection and Immunity. 72 (2), 1192-1194 (2004).</li><li>Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+worm+has+turned--microbial+virulence+modeled+in+Caenorhabditis+elegans.">The worm has turned--microbial virulence modeled in Caenorhabditis elegans.</a> Trends in Microbiology. 13 (3), 119-127 (2005).</li><li>Irazoqui, J. E., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=99th+Dahlem+conference+on+infection,+inflammation+and+chronic+inflammatory+disorders:+Caenorhabditis+elegans+as+a+model+to+study+tissues+involved+in+host+immunity+and+microbial+pathogenesis.">99th Dahlem conference on infection, inflammation and chronic inflammatory disorders: Caenorhabditis elegans as a model to study tissues involved in host immunity and microbial pathogenesis.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 160 (1), 48-57 (2010).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+and+Aging+in+Caenorhabditis+elegans:+Causal+or+Casual+Relationship.">Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 13 (12), 1911-1953 (2010).</li><li>Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+C.+elegans+for+aging+research.">Using C. elegans for aging research.</a> Invertebrate Reproduction &amp; Development. 59, 59-63 (2015).</li><li>Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKN-1/Nrf,+stress+responses,+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 88, 290-301 (2015).</li><li>Irazoqui, J. E., Urbach, J. M., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+host+innate+defence:+insights+from+Caenorhabditis+elegans+and+primitive+invertebrates.">Evolution of host innate defence: insights from Caenorhabditis elegans and primitive invertebrates.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (1), 47-58 (2010).</li><li>Park, S. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+as+mediated+by+SKN-1.">Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1.</a> Aging Cell. 8 (3), 258-269 (2009).</li><li>An, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Caenorhabditis+elegans+oxidative+stress+defense+protein+SKN-1+by+glycogen+synthase+kinase-3.">Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).</li><li>An, J. H., Blackwell, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKN-1+links+C.+elegans+mesendodermal+specification+to+a+conserved+oxidative+stress+response.">SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response.</a> Genes &amp; Development. 17 (15), 1882-1893 (2003).</li><li>Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+of+hydrogen+peroxide+produced+by+Enterococcus+faecium.">Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium.</a> Infection and Immunity. 72 (8), 4512-4520 (2004).</li><li>Pincus, Z., Mazer, T. C., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+as+a+measure+of+senescence+in+C.+elegans:+look+to+red,+not+blue+or+green.">Autofluorescence as a measure of senescence in C. elegans: look to red, not blue or green.</a> Aging (Albany NY). 8 (5), 889-898 (2016).</li><li>Teuscher, A. C., Ewald, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+Autofluorescence+to+Assess+GFP+Expression+During+Normal+Physiology+and+Aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Overcoming Autofluorescence to Assess GFP Expression During Normal Physiology and Aging in Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 8 (14), (2018).</li></ol>

Los métodos descritos pueden ser utilizados para otras bacterias patógenas tales como Enterococcus faecium, que también produce H2O2 en anaerobios o microaerofílicos condiciones26. Por lo general, para más patógenos, lleva varios días a semanas para completar el análisis de supervivencia. Sin embargo, debido a la robusta producción de H2O2 por miembros del grupo mitis, estos ensayos podrían completarse dentro de 5-6 h en las condicione...

Estreptococos del grupo mitis son humanos comensales de la cavidad bucofaríngea1. Sin embargo, estos organismos pueden escapar de este lugar y causar una variedad de enfermedades invasivas2. Las infecciones causadas por estos microorganismos incluyen bacteriemia, endocarditis y celulitis orbitaria2,3,4,5,6. Por otra parte, ellos surgen como agentes de infecciones del torrente sanguíneo en neutropénicos, inmunodeprimidos y pacientes con cáncer que han sufrido quimioterapia5,7,8,9 .
Los mecanismos de patogénesis de grupo mitis subyacente es ocultar, porque se han identificado algunos factores de virulencia. El grupo mitis se conoce para producir H2O2, que ha demostrado que juegan un papel importante en las comunidades microbianas orales10. Más recientemente, varios estudios han puesto de manifiesto una función de H2O2 como una citotoxina que induce muerte de células epiteliales11,12. Neumonía por S. que pertenece a este grupo, se ha demostrado para producir altos niveles de H2O2 que induce daño en el ADN y la apoptosis en células alveolares13. Utilizando un modelo animal de neumonía aguda, los mismos investigadores demostraron que la producción de H2O2 por las bacterias confiere una ventaja de virulencia. Estudios sobre la meningitis neumocócica también han demostrado que derivados del patógeno H2O2 actúa sinérgicamente con inmunoprotectores para accionar la célula neuronal muerte14. Estas observaciones establecen claramente que H2O2 producido por este grupo de bacterias es importante para su patogenicidad.
Curiosamente, también ha sido demostrado que miembros de la mitis grupo S. mitis y S. oralis causa muerte de los nematodos C. elegans mediante la producción de H2O215,16. Este nematodo de vida libre se ha utilizado como un modelo simple, genéticamente manejable para el estudio de muchos procesos biológicos. Más recientemente, el gusano ha emergido como un modelo para el estudio de17,de las interacciones huésped-patógeno18. Además, varios estudios han puesto de relieve la importancia de estudiar el estrés oxidativo mediante este organismo19,20,21. Su ciclo de vida corto, capacidad de precipitación genes de interés por ARNi y el uso de la proteína verde fluorescente (GFP)-Reporteros fundidos para monitorizar la expresión génica son algunos de los atributos que lo convierten en un sistema modelo atractivo. Más importante aún, las vías que regulan el estrés oxidativo y la inmunidad innata en el gusano están muy conservadas con mamíferos20,22.
En este protocolo, se demuestra cómo utilizar C. elegans para dilucidar la patogenicidad causada por estreptococos derivados H2O2. Se muestra un análisis de supervivencia modificado, y los miembros del grupo mitis son capaces de matar los gusanos rápidamente a través de la producción de H2O2. Con miembros del grupo mitis, una fuente biológica sostenida de especies reactivas del oxígeno (ROS) cuenta, a diferencia de fuentes químicas que inducen estrés oxidativo en los gusanos. Además, las bacterias son capaces de colonizar rápidamente, los gusanos que permite H2O2 a dirigirse directamente a las células intestinales (en comparación con otras fuentes que tienen que cruzar varias barreras). El ensayo es validado o 1) por determinación de la supervivencia de la cepa mutante de skn-1 o 2) por derribar skn-1 utilizando RNAi en gusanos en relación con el N2 de tipo salvaje y vector control tratado gusanos. SKN-1 es un factor de transcripción importante que regula la respuesta al estrés oxidativo en C. elegans23,24,25. Además de análisis de supervivencia, una cepa de gusano expresando un reportero transgénico SKN-1B/C::GFP se utiliza para controlar la activación de la estrés oxidativo respuesta a través de la producción de H2O2 por el grupo mitis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:845px;" width="845">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Media and chemicals</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Bacto peptone&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0118-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Bacto Todd Hewitt Broth</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0492-17-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD BBL Sheep Blood, Defibrinated&#160;&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B11947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Difco Agar&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0145-17-0</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Difco LB Broth</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0446-17-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blood agar (TSA with Sheep Blood)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R01200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Carbenicillin</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP26481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Catalase&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C1345-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ICN10138201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">IPTG</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MP21021012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Nystatin</td>
			<td style="width:179px;">Acros organics</td>
			<td style="width:119px;">AC455500050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium chloride&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SS266-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">8.25% Sodium Hypochlorite</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Streptomycin Sulfate&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP910-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Tetracyclin</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">87128-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">(&#8722;)-Tetramisole hydrochloride</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L9756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1422-500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Consumables&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-565-269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 x 10 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">No. 1.5&#160; 18 mm X 18 mm Cover Slips</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-541A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-544-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Software&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Prism</td>
			<td style="width:179px;">Graphpad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Bacterial Strains</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. oralis ATCC 35037</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. mitis ATCC 49456</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. gordonii DL1 Challis&#160;&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">E. coli OP50</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">E. coli HT115</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Worm Strains</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Strain</td>
			<td style="width:179px;">Genotype</td>
			<td style="width:119px;">Transgene</td>
			<td>Source</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">N2</td>
			<td style="width:179px;">C. elegans wild isolate</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">EU1</td>
			<td style="width:179px;">skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">LD002</td>
			<td style="width:179px;">IdIs1</td>
			<td style="width:119px;">SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)</td>
			<td>Keith Blackwell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying oxidative stress caused by the mitis group streptococci in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), un nematodo de vida libre, se ha convertido en un atractivo modelo para el estudio de las interacciones huésped-patógeno. El protocolo presentado utiliza este modelo para determinar la patogenicidad causada por los estreptococos del grupo mitis a través de la producción de H2O2. Los estreptococos del grupo mitis son una amenaza emergente que causan muchas enfermedades en humanos tales como bacteremia, endocarditis y celulitis orbitaria. Se describe aquí es un protocolo para determinar la supervivencia de estos gusanos en respuesta a H2O2 producido por este grupo de patógenos. Usando la codificación de skn-1 gen para un factor de transcripción de respuesta de estrés oxidativo, se muestra que este modelo es importante para la identificación de genes de host que están esenciales contra la infección estreptocócica. Además, está demostrado que la activación de la respuesta de estrés oxidativo se puede supervisar en presencia de estos patógenos utilizando una cepa de gusano reportero transgénicos, en la que SKN-1 está fusionada a la proteína verde fluorescente (GFP). Estos ensayos ofrecen la oportunidad de estudiar la respuesta de estrés oxidativo a H2O2 derivado de una fuente biológica como contraposición a exógeno agregado fuentes de oxígeno reactivo (ROS) las especies.

Grupo de miembros de la mitis S. mitis, S. oralis y S. gordonii rápidamente mataron a los gusanos, a diferencia de S. mutans, S. salivarius y no patógenas e. coli OP50 (figura 3A). La mediana de la supervivencia de S. mitisy S. oralis, S. gordonii era 300 min y 300 min min 345, respectivamente. Para determinar si el asesinato fue mediado por H2O...

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Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

El nematodo Caenorhabditis elegans es un excelente modelo para disecar interacciones huésped-patógeno. Se describe aquí es un protocolo para infectar el gusano con los miembros de los estreptococos del grupo mitis y determinar la activación de la respuesta de estrés oxidativo contra H2O2 producido por este grupo de organismos.

Estudiar el estrés oxidativo causado por los estreptococos del grupo Mitis en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

En este protocolo demostramos cómo utilizar un método de vida libre c. elegans para dilucidar la patoxíxito causada por peróxido de hidrógeno producido a través de estreptococos del Grupo Mitis. La principal ventaja de esta técnica es que podemos estudiar la patogenicidad y la activación de las respuestas al estrés en el gusano mediante el uso de una fuente biológica sostenible de especies reactivas de oxígeno en comparación con las fuentes químicas Para un litro de medios añadir 30g de polvo Todd Hewitt, 2g de extracto de levadura y 20g de ager a un matraz Erlin Myer de 2 litros.Añadir 970ml de agua desionizada al contenido del matraz y poner en una barra de agitación. Utilice papel de aluminio para cubrir la abertura. Autoclave el medio en el matraz a una temperatura de 121 grados Celsius y presión de 15 libras por pulgada cuadrada durante 30 minutos.A continuación, ajuste el matraz en una placa de agitación para que se enfríe con una agitación suave. Bajo una capucha laminar, vierta los medios en platos Petri estériles y de tamaño adecuado. Deje que el soporte se seque durante 2 horas.A partir de entonces guarde las placas a 4 grados centígrados durante un máximo de 1 mes. Antes de la preparación de los estreptococos del Grupo Mitis, caliente las placas de agar THY en una incubadora a 37 grados centígrados. Después de que utilice un bucle estéril para rayar las cepas deseadas de estrepticocci en los lugares.A continuación, coloque las placas en un frasco de velas e incubar el frasco a 37 grados centígrados durante unas 18 horas para proporcionar un ambiente microerofílico. Al día siguiente, retire las placas del frasco de velas y use un bucle estéril para recoger colonias aisladas. Inocular tubos cónicos estériles de 15 ml que contengan 2 ml de caldo THY.Cierre las tapas apretadas e incubar los tubos a 37 grados centígrados en condiciones estáticas. Precaliente thy placas en una incubadora a 37 grados Celsius añadir 50 microlitros de solución que contienen 1000 unidades de catalasa en la placa THY. Utilice un esparcidor estéril para esparcir la solución de catalasa y dejar que las placas se sequen en la campana de flujo laminar durante 30 minutos.Para sembrar las placas con las cepas de estreptococo, utilice una pipeta para agregar 80 microlitros de cultivos cultivados durante la noche a la placa y utilice un esparcidor estéril para esparcir las bacterias por completo a través de la superficie del agar. Incubar las placas a 37 grados centígrados en un frasco de velas durante la noche. Como control, en dos placas NGM, agregue 80 microlitros de cultivos cultivados durante la noche de E.coli OP-50 para la siembra.Incubar las placas a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, retire las placas del frasco de velas y deje que las placas se enfríen a temperatura ambiente. Usando un pico de gusano estéril, transfiera 30 larvas L4 de las placas de alimentación NGM a las placas THY sembradas de estreptococo.Incubar las placas a 25 grados centígrados. Bajo un microscopio de disección, cuente el número de larvas L4 vivas y muertas en cada placa en varios puntos de tiempo. Utilice el pico de gusano estéril para prod suavemente los gusanos y determinar si están vivos o muertos.Inicialmente, anota los gusanos como muertos o vive cada 30 minutos. Cuando los gusanos comiencen a morir rápidamente, puntúelos a intervalos de 15 minutos. El ensayo tardará de 5 a 6 horas en completarse.Después de eso, repita el experimento dos veces más. Para preparar la almohadilla de agarosa, pegue labtape a lo largo de dos toboganes de vidrio. Esto determinará el grosor de las almohadillas de agarosa.Coloque una corredera de vidrio limpia entre las dos diapositivas grabadas. Disolver la agarosa en agua desionizada para hacer 2 por ciento de volumen de peso y calentar la solución en un microondas. Utilice una pipeta para colocar 100 microlitros de agarosa fundida en el centro de la corredera limpia.Coloque inmediatamente otro portaobjetos de vidrio limpio en la parte superior de la agarosa fundida y presione suavemente hacia abajo para hacer una almohadilla. Permita que la agarosa se solidifique y posteriormente retire la corredera superior. La almohadilla de agarosa está lista para su uso.Precalece las placas THY a 37 grados centígrados. Siembra las placas con cepas de estreptococo como se hacía anteriormente en los ensayos de supervivencia. Semilla 3 placas NGM con E-coli OP-50 como control e incubación a 37 grados centígrados durante la noche.Al día siguiente, enfríe las placas a temperatura ambiente. Utilice Tampón M9W para lavar larvas L4 de placas de alimentación NGM o NGM RNAi en tubos cónicos de 15 ml. Gire los tubos a 450 veces g, durante un minuto en una centrífuga.Decantar el sobrenadante y añadir 10 ml de M9W a cada tubo. Repita el paso centrífugo tres veces más. Vuelva a suspender los gusanos en 250 microlitros de M9W y coloque tres gotas de 5 microlitros de la suspensión del gusano en una tapa limpia de la placa Petri.Bajo un microscopio de disección, estime el número de gusanos por microlitro. Con una pipeta, agregue aproximadamente 100 larvas L4 a cada sembrado de estreptococo THY y placas de semillas NGM E.coli. Use tres placas por cepa de bacterias.Incubar las placas durante 2 a 3 horas a 25 grados centígrados. A continuación, retire las placas de la incubadora. Lávelos con M9W y recoja los gusanos en tubos cónicos de 15 ml.Lavar los gusanos tres veces como se hizo anteriormente en el paso centrífugo. Retire la mayor parte del M9W por aspiración. Y añadir 500 microlitros de M9W que contengan 2 alacidios sódicos mili evolucionadores o clorhidrato de tetramisole al pellet de gusano para la anestesia.Incubar el tubo con pellets de gusano a temperatura ambiente durante 15 minutos. Luego, suelte 15 microlitros de la suspensión del gusano en una almohadilla de agorose preparada. Bajo un microscopio fluorescente, visualice la localización de skn-1 utilizando filtros Fitzy y Dappy.Imagen de gusanos a 10 veces y 20 veces aumentos. Puntuar los gusanos en función de tres niveles de localización;baja localización, donde no se observa ninguna localización nuclear, localización media, con SKN 1 BCGFP en el anterior o posterior del gusano, y alta localización, donde se observa la localización nuclear de skn-1 BCGFP en todas las células intestinales. En este experimento, los miembros del Grupo Mitis mataron rápidamente a los gusanos, a diferencia de S.mutans, S.salivarius y E.coli OP-50 no patógenos.Cuando la catalasa se complementó con THY ager, el asesinato de los gusanos fue abolido. No se observó la muerte de los gusanos en la cepa mutante delta spxB en comparación con las cepas de tipo salvaje y de cortesía. Estos datos sugieren que el peróxido de hidrógeno producido por el Grupo Mitis media la muerte de los gusanos.Se observó una disminución significativa en la supervivencia de los gusanos knockdown skn-1 en comparación con los gusanos tratados con control vectorial. Se observó un fenotipo de matanza similar con la cepa mutante skn-1 y los gusanos de tipo salvaje N2. Esto demuestra que el skn-1 influye en la supervivencia de los gusanos en el Grupo Mitis.Se observó la localización de skn-1 BCGFP en gusanos expuestos a las cepas de tipo salvaje N-compliment y no en respuesta a la cepa mutante Delta spxB de la S cordonae. Después de que los componentes de la vía de la quinasa del mapa P38 fueron derribados, se observó una menor localización de skn-1 BCGFP y gusanos tratados con derribo, en relación con los gusanos tratados con control vectorial. Mediante el uso de los estreptococos c.sistema de elegans, los efectos del peróxido de hidrógeno en el estrés verticular endoplasmático, daño mitocondrial, mitofogia, y tophogy se pueden estudiar más a fondo. Además, se pueden identificar mecanismos por los cuales el peróxido de hidrógeno actúa como un factor de virilidad para obtener respuestas inmunitarias al interrumpir los procesos centrales de la célula.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Evaluación completa de la línea germinal Química de toxicidad de los nematodos<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Análisis espacial y temporal de ERK en el Activo<em&gt; C. elegans</em&gt; línea germinal

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Inmovilización de Caenorhabditis elegans para analizar el transporte intracelular en las neuronas

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Aplicación de RNAi y expresión del Factor de transcripción inducida por choque térmico para reprogramar las células de germen para las neuronas en C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Evaluación de alcalinización Lysosomal en el intestino de vivir Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Análisis computacional de lo elegans de Caenorhabditis del Germline para estudiar la distribución de núcleos, proteínas y citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualización de la placa notocordal en embriones de ratón Gastrulating con microscopía electrónica e inmunofluorescencia de Monte todo y nodo

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

A Mini-Invasive Internal Fixation Technique for Studying Immobilization-Induced Knee Flexion Contracture in Rats

Una técnica de fijación interna miniinvasiva para el estudio de la contractura de flexión de rodilla inducida por inmovilización en ratas

Joint contracture, resulting from a prolonged joint immobilization, is a common complication in orthopedics. Currently, utilizing an internal fixation to ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Microscopía de lámina de luz isotrópica y análisis de linaje celular automatizado para catalogar Caenorhabditis elegans embriogénesis con resolución subcelular

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Medición de la orientación y la motilidad del esperma dentro del tracto reproductivo de la Caenorhabditis elegans hermafrodita

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...