Name: studying oxidative stress caused by the mitis group streptococci in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-03-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Biz Dr Bing-Yan Wang, Dr Gena Tribble (University of Texas, diş hekimliği Okulu), teşekkür Dr Richard Lamont (Louisville Üniversitesi, diş hekimliği Okulu) ve Dr. Samuel laboratuar ve klinik suşları sağlamak için Shelburne (MD Anderson Kanser Merkezi) mitis grubu Streptokok. Ayrıca Dr. Keith Blackwell (genetik bölümü, Harvard Tıp Okulu) C. elegans suşları için teşekkür ediyoruz. Son olarak, biz Dr Danielle Garsin ve onun lab (University of Texas, McGovern Tıp Fakültesi) reaktifler ve solucan suşları çalışma yapmak için verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bazı solucan suşları NIH ofisi araştırma altyapı programları (P40 OD010440) tarafından finanse edilen CGC tarafından temin edilmiştir.

1. senin (Todd-Hewitt Maya ekstresi) Ağar kaplamalar hazırlanması
<ol><li>Medya 1 L için 30 g Todd-Hewitt tozu, 2 g, Maya özü ve agar bir 2 L Erlenmeyer şişesi için 20 g ekleyin. Şişeye içeriği için 970 mL deiyonize su ekleyin ve bir heyecan bar bulunmaktadır. Otoklav medya 121 ° C sıcaklık ve basınç için 30 dk 15 lb/inç2 . Bundan sonra bir heyecan tabağa ortam küme ve nazik karıştırma ile soğutma için izin.</li>
	<li>Medya laminar akış altında uygun ölçekli steril Petri yem...

<ol>
	<li>Human Microbiome Project, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+diversity+of+the+healthy+human+microbiome.">Structure, function and diversity of the healthy human microbiome.</a> Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).</li><li>Mitchell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+mitis:+walking+the+line+between+commensalism+and+pathogenesis.">Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis.</a> Molecular Oral Microbiology. 26 (2), 89-98 (2011).</li><li>Dyson, C., Barnes, R. A., Harrison, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infective+endocarditis:+an+epidemiological+review+of+128+episodes.">Infective endocarditis: an epidemiological review of 128 episodes.</a> Journal of Infection. 38 (2), 87-93 (1999).</li><li>Sahasrabhojane, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-level+assessment+of+the+molecular+basis+of+fluoroquinolone+resistance+among+viridans+group+streptococci+causing+bacteraemia+in+cancer+patients.">Species-level assessment of the molecular basis of fluoroquinolone resistance among viridans group streptococci causing bacteraemia in cancer patients.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 43 (6), 558-562 (2014).</li><li>Shelburne, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+mitis+strains+causing+severe+clinical+disease+in+cancer+patients.">Streptococcus mitis strains causing severe clinical disease in cancer patients.</a> Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 762-771 (2014).</li><li>van der Meer, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution,+antibiotic+susceptibility+and+tolerance+of+bacterial+isolates+in+culture-positive+cases+of+endocarditis+in+The+Netherlands.">Distribution, antibiotic susceptibility and tolerance of bacterial isolates in culture-positive cases of endocarditis in The Netherlands.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 10 (9), 728-734 (1991).</li><li>Han, X. Y., Kamana, M., Rolston, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viridans+streptococci+isolated+by+culture+from+blood+of+cancer+patients:+clinical+and+microbiologic+analysis+of+50+cases.">Viridans streptococci isolated by culture from blood of cancer patients: clinical and microbiologic analysis of 50 cases.</a> Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 160-165 (2006).</li><li>Hoshino, T., Fujiwara, T., Kilian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+phylogenetic+and+phenotypic+analyses+to+identify+nonhemolytic+streptococci+isolated+from+bacteremic+patients.">Use of phylogenetic and phenotypic analyses to identify nonhemolytic streptococci isolated from bacteremic patients.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (12), 6073-6085 (2005).</li><li>Kohno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+complications+in+patients+receiving+autologous+CD34-selected+hematopoietic+stem+cell+transplantation+for+severe+autoimmune+diseases.">Infectious complications in patients receiving autologous CD34-selected hematopoietic stem cell transplantation for severe autoimmune diseases.</a> Transplant Infectious Disease. 11 (4), 318-323 (2009).</li><li>Zhu, L., Kreth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+hydrogen+peroxide+in+environmental+adaptation+of+oral+microbial+communities.">The role of hydrogen peroxide in environmental adaptation of oral microbial communities.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 717843 (2012).</li><li>Okahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+contributes+to+the+epithelial+cell+death+induced+by+the+oral+mitis+group+of+streptococci.">Hydrogen peroxide contributes to the epithelial cell death induced by the oral mitis group of streptococci.</a> PLoS One. 9 (1), 88136 (2014).</li><li>Stinson, M. W., Alder, S., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+and+killing+of+human+endothelial+cells+by+viridans+group+streptococci.">Invasion and killing of human endothelial cells by viridans group streptococci.</a> Infection and Immunity. 71 (5), 2365-2372 (2003).</li><li>Rai, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pneumoniae+secretes+hydrogen+peroxide+leading+to+DNA+damage+and+apoptosis+in+lung+cells.">Streptococcus pneumoniae secretes hydrogen peroxide leading to DNA damage and apoptosis in lung cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (26), 3421-3430 (2015).</li><li>Braun, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumococcal+pneumolysin+and+H(2)O(2)+mediate+brain+cell+apoptosis+during+meningitis.">Pneumococcal pneumolysin and H(2)O(2) mediate brain cell apoptosis during meningitis.</a> Journal of Clinical Investigation. 109 (2), 19-27 (2002).</li><li>Naji, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activation+of+the+oxidative+stress+response+transcription+factor+SKN-1+in+Caenorhabditis+elegans+by+mitis+group+streptococci.">The activation of the oxidative stress response transcription factor SKN-1 in Caenorhabditis elegans by mitis group streptococci.</a> PLoS One. 13 (8), 0202233 (2018).</li><li>Bolm, M., Jansen, W. T., Schnabel, R., Chhatwal, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide-mediated+killing+of+Caenorhabditis+elegans:+a+common+feature+of+different+streptococcal+species.">Hydrogen peroxide-mediated killing of Caenorhabditis elegans: a common feature of different streptococcal species.</a> Infection and Immunity. 72 (2), 1192-1194 (2004).</li><li>Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+worm+has+turned--microbial+virulence+modeled+in+Caenorhabditis+elegans.">The worm has turned--microbial virulence modeled in Caenorhabditis elegans.</a> Trends in Microbiology. 13 (3), 119-127 (2005).</li><li>Irazoqui, J. E., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=99th+Dahlem+conference+on+infection,+inflammation+and+chronic+inflammatory+disorders:+Caenorhabditis+elegans+as+a+model+to+study+tissues+involved+in+host+immunity+and+microbial+pathogenesis.">99th Dahlem conference on infection, inflammation and chronic inflammatory disorders: Caenorhabditis elegans as a model to study tissues involved in host immunity and microbial pathogenesis.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 160 (1), 48-57 (2010).</li><li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+and+Aging+in+Caenorhabditis+elegans:+Causal+or+Casual+Relationship.">Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 13 (12), 1911-1953 (2010).</li><li>Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+C.+elegans+for+aging+research.">Using C. elegans for aging research.</a> Invertebrate Reproduction &amp; Development. 59, 59-63 (2015).</li><li>Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKN-1/Nrf,+stress+responses,+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 88, 290-301 (2015).</li><li>Irazoqui, J. E., Urbach, J. M., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+host+innate+defence:+insights+from+Caenorhabditis+elegans+and+primitive+invertebrates.">Evolution of host innate defence: insights from Caenorhabditis elegans and primitive invertebrates.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (1), 47-58 (2010).</li><li>Park, S. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+as+mediated+by+SKN-1.">Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1.</a> Aging Cell. 8 (3), 258-269 (2009).</li><li>An, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Caenorhabditis+elegans+oxidative+stress+defense+protein+SKN-1+by+glycogen+synthase+kinase-3.">Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).</li><li>An, J. H., Blackwell, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKN-1+links+C.+elegans+mesendodermal+specification+to+a+conserved+oxidative+stress+response.">SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response.</a> Genes &amp; Development. 17 (15), 1882-1893 (2003).</li><li>Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+of+hydrogen+peroxide+produced+by+Enterococcus+faecium.">Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium.</a> Infection and Immunity. 72 (8), 4512-4520 (2004).</li><li>Pincus, Z., Mazer, T. C., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+as+a+measure+of+senescence+in+C.+elegans:+look+to+red,+not+blue+or+green.">Autofluorescence as a measure of senescence in C. elegans: look to red, not blue or green.</a> Aging (Albany NY). 8 (5), 889-898 (2016).</li><li>Teuscher, A. C., Ewald, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+Autofluorescence+to+Assess+GFP+Expression+During+Normal+Physiology+and+Aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Overcoming Autofluorescence to Assess GFP Expression During Normal Physiology and Aging in Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 8 (14), (2018).</li></ol>

Açıklanan yöntemleri de üreten anaerobik altında yetiştirilen H2O2 Enterococcus faeciumgibi diğer Patojen bakteriler için kullanılabilir ya da mikroaerofilik koşulları26. Genellikle, en patojenik organizmalar için bu hafta için hayatta kalma deneyleri tamamlamak için birkaç gün sürer. Ancak, H2O2 mitis grubunun üyeleri tarafından sağlam üretim nedeniyle, bu deneyleri içinde 5-6 h açıklanan koşullar altında tamamlanamad...

Mitis grubu streptokok oropharyngeal boşluğu1insan commensals vardır. Ancak, bu organizmaların bu niş kaçış ve invazif hastalıkları2çeşitli neden. Bu mikroorganizmalar tarafından neden olduğu enfeksiyonlar bakteriyemi, endokardit ve orbital sellülit2,3,4,5,6içerir. Ayrıca, kan dolaşımına enfeksiyonlar olarak sorumlu ajanlar ortaya çıkıyor içinde immün, Nötropenik ve kemoterapi5,7,8,9 uğramıştır kanserli hastalarda .
Mekanizmaları temel mitis grup Patogenez olduğunu belirsiz, çünkü birkaç virülans faktörleri tespit edilmiştir. Mitis grup oral mikrobiyal topluluklar10içinde önemli bir rol oynamaya göstermiştir H2O2, üretmek için bilinir. Daha yakın zamanlarda, çeşitli çalışmalarda H2O2 için rol epitel hücre ölüm11,12indükler bir Sitotoksin olarak çizer. Bu gruba ait S. pnömoni, DNA hasarı ve alveoler hücreleri13' te apoptosis indükler H2O2 yüksek düzeyde üretmek için kanıtlanmıştır. Bir akut pnömoni hayvan modeli kullanarak, aynı araştırma H2O2 bakteri tarafından üretimi virülans avantaj confers göstermek. Pnömokok menenjit çalışmaları da bu patojen kaynaklı H2O2 sinerjik nöronal hücre ölüm14tetiklemek için pneumolysin ile hareket göstermiştir. Bu gözlemler açıkça kurmak için onların patojen bakteri bu grubu tarafından üretilen bu H2O2 önemlidir.
İlginçtir, bu da grubunun üyeleri mitis S. mitis ve oralis S. neden H2O215,16üretimi yoluyla nematodunun C. elegans ölümü gösterilmiştir. Bu evrimleşmiş Yuvarlak solucanlar birçok biyolojik süreçlerin çalışmaya basit, genetik olarak uysal model olarak kullanılmıştır. Daha yakın zamanlarda, solucan ana bilgisayar-patojen etkileşimleri17,18eğitim için bir model olarak ortaya çıkmıştır. Ayrıca, çeşitli çalışmalarda oksidatif stres bu organizma19,20,21kullanarak okuyan önemini çizer. Onun kısa hayat döngüsü, yetenek RNAi tarafından ilgi devirme genler ve yeşil flüoresan protein (GFP) kullanımı-gen ekspresyonu izlemek için yuvarlak gazetecilere bir çekici model sistemi yapmak öznitelikleri bazılarıdır. Daha da önemlisi, oksidatif stres ve solucan doğuştan gelen bağışıklık düzenleyen yolları memeliler20,22ile son derece korunmuş.
Bu protokol için o C. elegans streptokok kaynaklı H2O2tarafından neden patojenitesi aydınlatmak için nasıl kullanılacağı gösterilmiştir. Değiştirilmiş hayatta kalma tahlil gösterilir ve mitis grubunun üyeleridir solucanlar hızla öldürmek mümkün yoluyla üretim H2O2. Reaktif oksijen türleri sürekli biyolojik kaynağı mitis grubunun üyeleri kullanarak (ROS), aksine solucanlar oksidatif stres neden kimyasal kaynaklardan sağlanır. Ayrıca, bakteri H2O2 (çeşitli engelleri geçmek zorunda diğer kaynaklarına göre) bağırsak hücrelere doğrudan hedef hangi sağlar hızla, solucanlar kolonize edebiliyoruz. Tahlil ya 1) tarafından belirlenmesi skn-1 mutant suşu veya 2) tarafından aşağı RNAi solucanlar N2 vahşi-türü göreli ve vektör kontrol tedavi solucanlar kullanma skn-1 eleştiri hayatta kalma doğrulanır. SKN-1 C. elegans23,24,25oksidatif stres yanıtında düzenleyen bir önemli transkripsiyon faktörü var. Hayatta kalma deneyleri ek olarak, bir SESN-1B/C::GFP transgenik muhabir ifade bir solucan yük mitis grupla aktivasyonu oksidatif stres yanıt yolu ile H2O2 üretim izlemek için kullanılır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:845px;" width="845">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Media and chemicals</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Bacto peptone&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0118-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Bacto Todd Hewitt Broth</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0492-17-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD BBL Sheep Blood, Defibrinated&#160;&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B11947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Difco Agar&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0145-17-0</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">BD Difco LB Broth</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DF0446-17-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blood agar (TSA with Sheep Blood)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R01200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Carbenicillin</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP26481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Catalase&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C1345-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ICN10138201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">IPTG</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MP21021012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Nystatin</td>
			<td style="width:179px;">Acros organics</td>
			<td style="width:119px;">AC455500050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium chloride&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SS266-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">8.25% Sodium Hypochlorite</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Streptomycin Sulfate&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP910-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Tetracyclin</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">87128-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">(&#8722;)-Tetramisole hydrochloride</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L9756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1422-500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Consumables&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-565-269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 x 10 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">No. 1.5&#160; 18 mm X 18 mm Cover Slips</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-541A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-544-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Software&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Prism</td>
			<td style="width:179px;">Graphpad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Bacterial Strains</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. oralis ATCC 35037</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. mitis ATCC 49456</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">S. gordonii DL1 Challis&#160;&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">E. coli OP50</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">E. coli HT115</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Worm Strains</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">Strain</td>
			<td style="width:179px;">Genotype</td>
			<td style="width:119px;">Transgene</td>
			<td>Source</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">N2</td>
			<td style="width:179px;">C. elegans wild isolate</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">EU1</td>
			<td style="width:179px;">skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:381px;">LD002</td>
			<td style="width:179px;">IdIs1</td>
			<td style="width:119px;">SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)</td>
			<td>Keith Blackwell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying oxidative stress caused by the mitis group streptococci in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), yaşayan bir yuvarlak solucanlar, ana bilgisayar-patojen etkileşimleri eğitim için çekici bir model ortaya çıkmıştır. Sunulan Protokolü mitis grubu streptokok H2O2üretim yoluyla neden patojenitesi belirlemek için bu modeli kullanır. Mitis grubu streptokok bakteriyemi, endokardit ve orbital sellülit gibi birçok insan hastalığa neden ortaya çıkan bir tehdit vardır. Burada açıklanan bu solucanların H2O2 yanıt olarak yaşama belirlemek için bir protokol patojenler bu grup tarafından üretilmektedir. Gen skn-1 bir oksidatif stres yanıt transkripsiyon faktörü için kodlamayı kullanarak, bu model Streptokok enfeksiyonu karşı gerekli olan ana bilgisayar genlerin tanımlamak için önemlidir gösterilir. Ayrıca, etkinleştirme oksidatif stres yanıtının SKN-1 yeşil flüoresan protein (GFP) eritilmiş olan bir transgenik muhabir solucan yük kullanarak bu patojenler huzurunda izlenebilir gösterilir. Bu deneyleri fırsat oksidatif stres tepkisi H2O2 exogenously olarak biyolojik bir kaynak tarafından elde edilen çalışma Reaktif oksijen türleri (ROS) kaynakları ek sağlamak.

S. mitisgrubunun üyeleri mitis, S. Oraliş ve S. gordonii hızla solucanlar, S. mutans çoğunlukla, S. salivarius, ve patojenik olmayan E. coli öldürdü OP50 (şekil 3A). S. mitis, S. Oraliş ve S. gordonii için medyan sağkalım 300 dk, 300 dk ve 345 min, sırasıyla yapıldı. Öldürme H2O2tarafından aracılı eğer belirlemek için...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Yuvarlak solucanlar Caenorhabditis elegans ana bilgisayar-patojen etkileşimleri incelemek için mükemmel bir modeldir. Burada açıklanan solucan mitis grubu streptokok üyeleri ile enfekte ve oksidatif stres tepkisi bu grup organizmalar tarafından üretilen H2O2 karşı aktivasyonu belirlemek için bir iletişim kuralıdır.

Oksidatif stres nedeniyle Mitis grubu streptokok Caenorhabditis elegans içinde eğitim

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Bu protokolde, Mitis Grubu streptokokları ile üretilen hidrojen peroksitin neden olduğu patojeniteyi açıklamak için c. elegans'ın serbest yaşam yönteminin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Bu tekniğin ana avantajı biz patojenite ve reaktif oksijen türlerinin sürdürülebilir bir biyolojik kaynak kullanarak solucan stres yanıtlarının aktivasyon çalışabilirsiniz kimyasal kaynaklaryerine bir litre medya todd Hewitt tozu 30g eklemek için, maya özü 2g ve 2 litre lik Erlin Myer şişesi ne ager 20g.Şişenin içeriğine 970ml deiyonize su ekleyin ve bir karıştırma çubuğuna koyun. Açıklığı kapatmak için alüminyum folyo kullanın. Otoklav 121 santigrat derece sıcaklıkta şişede medya ve 30 dakika boyunca inç kare başına 15 pound basınç.Daha sonra hafif karıştırma ile soğuması için bir karıştırma plakası üzerinde şişe ayarlayın. Bir laminar başlık altında, uygun büyüklükte, steril Petri yemekleri içine medya dökün. Ortamın 2 saat kurumasını bekleyin.Daha sonra plakaları 4 santigrat derecede 1 aya kadar saklayın. Mitis Group streptokokları hazırlanmadan önce THY agar plakalarını 37 santigrat dereceye kadar kuvözde ısıtın. Bundan sonra yerlerde strepticocci istenilen suşları dışarı çizgi steril bir döngü kullanın.Sonra bir mum kavanozuna plakaları koyun ve mikroerofilik bir ortam sağlamak için yaklaşık 18 saat boyunca bir gecede 37 derece santigrat kavanoz kuluçka. Ertesi gün, mum kavanozundan plakaları çıkarın ve izole kolonileri almak için steril bir döngü kullanın. 2 ml THY suyu içeren 15 ml steril konik tüplerin aşıla.Kapakları sıkıca kapatın ve statik koşullar altında tüpleri 37 derecede kuluçkaya yatırın. 37 dereceye kadar bir kuluçka makinesinde önceden ısınmış THY plakaları, THY plakasına 1000 ünite katalaz içeren 50 mikrolitre çözelti ekler. Katalaz çözeltisini yaymak için steril bir dağıtıcı kullanın ve plakaların laminar akış kaputunda 30 dakika kurumasını bekleyin.Streptokok suşları ile plaka tohum için, plaka ya da tamamen agar yüzeyinde bakteri yaymak için steril bir yayıcı kullanmak için plaka bir gecede yetiştirilen kültürlerin 80 mikrolitre eklemek için bir pipet kullanın. Tabakları bir gecede mum kavanozuna 37 derecede kuluçkaya yatırın. Bir kontrol olarak, iki NGM plakaları üzerinde, tohumlama için E.coli OP-50 gecede yetiştirilen kültürlerin 80 mikrolitre ekleyin.Plakaları bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, mum kavanozundaki tabakları çıkarın ve tabakların oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Steril solucan toplama kullanarak, NGM besleme plakalarından streptokok tohumlu THY plakalarına 30 L4 larva aktarın.Plakaları 25 derecede kuluçkaya yatırın. Bir diseksiyon mikroskop altında, birkaç zaman noktalarında her plaka üzerinde canlı ve ölü L4 larvasayısını saymak. Solucanları nazikçe dürtmek ve ölü ya da canlı olup olmadığını belirlemek için steril solucan almak kullanın.Başlangıçta, ölü olarak solucanlar puan veya her 30 dakikada bir canlı. Solucanlar hızla ölmeye başladığında, onları 15 dakikalık aralıklarla puanlayın. Tsanın tamamlanması 5 ila 6 saat sürer.Bundan sonra, denemeyi iki kez daha tekrarlayın. Agarose ped hazırlamak için, iki cam slaytlar boyunca uzunlamasına labtape sopa. Bu agarose pedleri kalınlığını belirleyecektir.Bantlanmış iki slayt arasına temiz bir cam slayt yerleştirin. 2 ağırlık hacmi yüzde yapmak ve bir mikrodalga çözelti ısı deiyonize suda agarose çözünür. Temiz kaydırağın ortasına 100 mikrolitre erimiş agarose yerleştirmek için bir pipet kullanın.Hemen erimiş agarose üstüne başka bir temiz cam slayt yerleştirin ve yavaşça bir yastık yapmak için aşağı basın. Agarose'un katılaştırılmasına ve daha sonra üst teki slaydı kaldırmasına izin verin. Agarose ped kullanıma hazırdır.37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılatan THY plakaları. Hayatta kalma tahlillerinde daha önce yapıldığı gibi bir streptokok suşları ile tohum plakaları. Kontrol ve bir gecede 37 derece santigrat inkübat olarak E-coli OP-50 ile Tohum 3 NGM plakaları.Ertesi gün tabakları oda sıcaklığına kadar soğutun. 15 ml konik tüpler içine NGM veya NGM RNAi besleme plakaları L4 larvayıkamak için M9W tampon kullanın. Tüpleri 450 kez g'de döndürün, bir dakika lığına santrifüjde.Supernatant decant ve her tüp için M9W 10 ml ekleyin. Santrifüj basamanı üç kez daha tekrarlayın. Solucanları 250 mikrolitre M9W'da yeniden askıya alın ve solucan süspansiyonunun üç 5 mikrolitre damlasını temiz bir Petri kabının kapağına yerleştirin.Bir diseksiyon mikroskobu altında, mikrolitre başına solucan sayısını tahmin edin. Bir pipet kullanarak, her THY streptokok tohumu ve NGM E.coli tohumlu plakalar yaklaşık 100 L4 larva ekleyin. Bakteri suşu başına üç tabak kullanın.Plakaları 2-3 saat 25 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, kuvözden plakaları çıkarın. M9W ile yıkayın ve 15ml konik tüpler solucanlar toplamak.Solucanları santrifüj adımda daha önce yaptığı gibi üç kez yıkayın. Aspirasyon ile M9W'nin çoğunu çıkarın. Ve anestezi için solucan pelet ine 2 milimolar sodyum azit veya tetramisole hidroklorür içeren 500 mikrolitre M9W ekleyin.15 dakika boyunca oda sıcaklığında solucan pelet leri ile tüp kuluçka. Daha sonra, hazır bir agorose ped üzerine solucan süspansiyon 15 mikrolitre bırakın. Floresan mikroskop altında, Fitzy ve Dappy filtreleri kullanan skn-1'in lokalizasyonunu görselleştirin.Görüntü solucanları 10 kat ve 20 kat büyütme. Solucanları üç yerelleştirme düzeyine göre puankazanın;nükleer lokalizasyonun gözlenmediği düşük lokalizasyon, orta lokalizasyon, solucanın ön veya arka kısmında SKN 1 BCGFP ve tüm bağırsak hücrelerinde skn-1 BCGFP'nin nükleer lokalizasyonunun gözlendiği yüksek lokalizasyon. Bu deneyde, Mitis Grubu üyeleri hızla, S.mutans, S.salivarius ve patojen olmayan E.coli OP-50 aksine solucanlar öldürdü.Katalaz THY'ye takviye edildiğinde solucanların öldürülmesi kaldırıldı. Solucanların ölümü, delta spxB mutant suşunda yabani tip ve iltifat suşlarına göre gözlenmedi. Bu veriler, Mitis Grubu tarafından üretilen hidrojen peroksitin solucanların öldürülmesine aracılık ettiğini göstermektedir.Skn-1 nakavt solucanlarının hayatta kalmalarında vektör kontrolü tedavi edilen solucanlara göre önemli bir azalma gözlenmiştir. Benzer bir öldürme fenotip skn-1 mutant suşu ve N2 vahşi tip solucanlar ile gözlendi. Bu, SKN-1'in solucanların Mitis Grubu'ndaki hayatta kalmasını etkilediğini göstermektedir.Skn-1 BCGFP lokalizasyonu, S cordonae'nin Delta spxB mutant türüne yanıt olarak değil, yabani tip N-iltifat suşlarına maruz kalan solucanlarda gözlendi. P38 harita kinaz yolunun bileşenleri yıkıldıktan sonra, skn-1 BCGFP'nin lokalizasyonu azaltıldı ve vektör kontrolü tedavi edilen solucanlara göre nakavt işlenmiş solucanlar gözlendi. Streptokok c kullanarak.elegans sistemi, endokrinazmik vertiküler stres hidrojen peroksit etkileri, mitokondriyal hasar, mitopgoli, ve topgogoya daha fazla incelenebilir. Ayrıca, hidrojen peroksit hücrenin çekirdek süreçlerini bozarak bağışıklık yanıtları ortaya çıkarmak için bir erkeksi faktör olarak hareket mekanizmaları tespit edilebilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Nematod kullanma Germline Kimyasal zehirlilik Kapsamlı Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Aktif ERK Mekansal ve Zamansal Analizi<em&gt; C. elegans</em&gt; Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans nöron hücre içi taşıma analiz immobilizasyon

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Uygulama için yeniden programlamak Germ hücreleri için C. elegans nöronlarda RNAi ve transkripsiyon faktörü ifade ısı şok bağlı

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Bağırsak hayatın Caenorhabditis elegans lizozomal Alkalinization değerlendirilmesi

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

A Mini-Invasive Internal Fixation Technique for Studying Immobilization-Induced Knee Flexion Contracture in Rats

Rats Immobilizasyon kaynaklı diz fleksiyon kontraktürü eğitim için mini-Invaziv Iç Fikmasyon tekniği

Joint contracture, resulting from a prolonged joint immobilization, is a common complication in orthopedics. Currently, utilizing an internal fixation to ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

İzotropik hafif levha mikroskobu ve otomatik hücre Lineage analizleri kataloğa Caenorhabditis elegans Embriyogenesis Subcellular çözünürlük ile

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Ölçme sperm rehberlik ve motilite içinde Caenorhabditis elegans hermafrodit üreme yolu

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...