Name: studying normal tissue radiation effects using extracellular matrix hydrogels
Uploaded: 2019-07-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels at JoVE.com

ويشكر المؤلفون الدكتورة لورا ل. برونسارت على توفير خلايا GFP- وluciferase-4T1، والدكتور إدوارد ل. لاغوري للحصول على المشورة بشأن 1---(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol تلطيخ، والدكتور كريغ ل. دوفال لIVIS واستخدام الليوفيليس، والدكتور سكوت أ. غيلشر لrheometer استخدام. وقد حظي هذا البحث بدعم مالي من #R00CA201304 منحة المعهد الوطني للصحة.

وأجريت دراسات حيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية والبروتوكولات المؤسسية التي وافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة فاندربيلت.
1- إعداد الملوثات المتعددة الجنسيات وتشعيعها من الجسم الحي
<ol><li>التضحية بالفئران Nu/Nu (8-10 أسابيع) باستخدام الاختناق ثاني أ...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+cancer.">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2018.">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li><li>Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregional+recurrence+after+breast+cancer+surgery:+a+systematic+review+by+receptor+phenotype.">Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).</li><li>Miller, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+treatment+and+survivorship+statistics,+2016.">Cancer treatment and survivorship statistics, 2016.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).</li><li>Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Circulating+Breast+Cancer+Cells+Is+Stimulated+by+Radiotherapy.">Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy.</a> Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).</li><li>Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Promote+Circulating+Tumor+Cell-Mediated+Local+Recurrence+Following+Radiation+Therapy+in+Immunosuppressed+Patients.">Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients.</a> Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).</li><li>Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+after+radiation+therapy:+Review+of+the+literature.">Wound healing after radiation therapy: Review of the literature.</a> Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).</li><li>Beachley, V. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+matrix+arrays+for+high+throughput+screening+and+systems+analysis+of+cell+function.">Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function.</a> Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+metastases+obtained+by+culturing+colorectal+cancer+cells+on+tissue-specific+decellularized+scaffolds.">Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).</li><li>Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+hydrogels+from+decellularized+tissues:+Structure+and+function.">Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function.</a> Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).</li><li>Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+and+ECM-like+materials+&#8212;+Biomaterials+for+applications+in+regenerative+medicine+and+cancer+therapy.">ECM and ECM-like materials &#8212; Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).</li><li>Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+hydrogel+scaffold+from+decellularized+human+lipoaspirate.">Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate.</a> Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).</li><li>Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+derived+myocardial+matrix+as+an+injectable+scaffold+for+cardiac+tissue+engineering.">Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering.</a> Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).</li><li>Pouliot, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+naturally+derived+lung+extracellular+matrix+hydrogel.">Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).</li><li>Bonvillain, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Nonhuman+Primate+Model+of+Lung+Regeneration:+Detergent-Mediated+Decellularization+and+Initial+In+Vitro+Recellularization+with+Mesenchymal+Stem+Cells.">A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).</li><li>Brown, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Three+Methods+for+the+Derivation+of+a+Biologic+Scaffold+Composed+of+Adipose+Tissue+Extracellular+Matrix.">Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).</li><li>Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+Hydrogels+from+Pulmonary+Extracellular+Matrix+for+3D+Cell+Culture.">Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).</li><li>Massensini, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration-dependent+rheological+properties+of+ECM+hydrogel+for+intracerebral+delivery+to+a+stroke+cavity.">Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity.</a> Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).</li><li>Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+5+1+facilitates+cancer+cell+invasion+through+enhanced+contractile+forces.">Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces.</a> Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).</li><li>Ahmadzadeh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+two-way+feedback+between+contractility+and+matrix+realignment+reveals+a+nonlinear+mode+of+cancer+cell+invasion.">Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).</li></ol>

هذه الطريقة لتشكيل هيدروجيل تعتمد إلى حد كبير على كمية الأنسجة البداية. الملوثات المتوسطة المتوسطة Murine صغيرة، وعملية إزالة الخلايا يؤديإلى انخفاض كبير في المواد (الجدول 1). ويمكن تكرار هذه العملية مع المزيد من الملوثات الصغرى لزيادة الغلة النهائية. الطحن هو خطوة هامة أخرى قد تؤدي...

يتميز السرطان بالانتشار الزائد للخلايا التي يمكن أن تهرب من المبرمج وأيضا تنتشر إلى مواقع بعيدة1. سرطان الثدي هو واحد من الأشكال الأكثر شيوعا بين الإناث في الولايات المتحدة، مع ما يقدر ب266،000 حالة جديدة و 40،000 حالة وفاة في عام 20182. وهناك عدوانية بشكل خاص وصعبة لعلاج النوع الفرعي هو سرطان الثدي السلبي الثلاثي (TNBC)، الذي يفتقر إلى مستقبلات الإستروجين (ER)، مستقبلات البروجسترون (PR)، وعامل نمو البشرة البشرية (HER2). يستخدم العلاج الإشعاعي عادة في سرطان الثدي للقضاء على الخلايا السرطانية المتبقية بعد استئصال الورم، ولكن أكثر من 13٪ من مرضى TNBC لا تزال تواجه تكرار في موقع الورم الأولي3.
ومن المعروف أن العلاج الإشعاعي فعال في التخفيف من الانبثاث والتكرار لأن الجمع بين استئصال الورم والإشعاع يؤدي إلى نفس البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل مثل استئصال الثدي4. ومع ذلك، فقد ثبت مؤخرا أن العلاج الإشعاعي يرتبط مع تكرار المحلية إلى موقع الورم الأولي في إعدادات المناعة5،6. أيضا، فمن المعروف جيدا أن الإشعاع يغير المصفوفة خارج الخلية (ECM) من الأنسجة الطبيعية عن طريق تحفيز التليف7. لذلك، من المهم فهم دور التغيرات التي يسببها الإشعاع ECM في إملاء سلوك الخلايا السرطانية.
وقد استخدمت الأنسجة منزوعة الخلايا كما في نماذج المختبر لدراسة المرض8،9. هذه الأنسجة منزوعة الخلايا الحفاظ على تكوين ECM وتلخيص المجمع في الجسم الحي ECM. هذه الأنسجة منزوعة الخلايا ECM يمكن معالجتها وهضمها لتشكيل هيدروجيلات ECM المعاد تشكيلها التي يمكن استخدامها لدراسة نمو الخلايا والوظيفة10،11. على سبيل المثال، تم استخدام هيدروجيل اتّممكن مشتق ة من يبأال بشري منزوع الخلايا ومن أنسجة عضلة القلب كأساليب غير غازية لهندسة الأنسجة، كما تم استخدام هيدروجيل مشتق من أنسجة الرئة البورسينية كطريقة اختبار في المختبر [mesenchymal] [سستم سلّ] ملحق وجدوى12,13,14. ومع ذلك، لم يتم التحقيق في تأثير الضرر الإشعاعي للأنسجة الطبيعية على خصائص ECM.
هيدروجيلات مشتقة من ECM لديها أكبر الإمكانات للدراسة في المختبر من الظواهر في الجسم الحي. وقد درست العديد من المواد الأخرى، بما في ذلك الكولاجين، الفيبرين، وmatrigel، ولكن من الصعب تلخيص تركيبة ECM13صناعيا. ميزة استخدام هيدروجيلات مشتقة من ECM هو أن ECM يحتوي على البروتينات اللازمة وعوامل النمو لأنسجة معينة14،15. يؤدي تشعيع الأنسجة الطبيعية أثناء استئصال الورم إلى تغييرات كبيرة في إدارة المحتوى في المؤسسة، ويمكن استخدام المواد المائية المشتقة من ECM لدراسة هذا التأثير في المختبر. هذا الأسلوب يمكن أن يؤدي إلى نماذج أكثر تعقيدا وأكثر دقة في المختبر من المرض.
في هذه الدراسة، أخضعنا منصات الدهون الثديية المورين (MFPs) للإشعاع السابق في الجسم الحي. تم إزالة الخلايا من الـ MFPs وتحويلها إلى حل ما قبل الجل. تم تشكيل هيدروجيلز مع الخلايا 4T1 جزءا لا يتجزأ، خط خلية Murine TNBC. تم فحص الخصائص الريولوجية لمادة هيدروجيل، وتم تقييم ديناميات الخلايا السرطانية داخل هيدروجيلز. هيدروجيلز ملفقة من الملوثات المتعددة الجنسيات المشعة تعزيز انتشار الخلايا السرطانية. وستتضمن الدراسات المستقبلية أنواع خلايا أخرى لدراسة تفاعلات الخلايا الخلوية في سياق تكرار السرطان بعد العلاج.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>19387</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AR 2000ex Rheometer</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>10D4335</td>
			<td>rheometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcein acetoxymethyl (calcein AM)</td>
			<td>Molecular Probes, Inc.</td>
			<td>C1430</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin Firefly, potassium salt</td>
			<td>Biosynth Chemistry &#38; Biology</td>
			<td>L-8820</td>
			<td>(S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant for Histology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>06522-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin-Y with Phloxine</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>71304</td>
			<td>eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium homodimer</td>
			<td>Molecular Probes, Inc.</td>
			<td>E1169</td>
			<td>ethidium homodimer-1 (EthD-1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td>cryostat embedding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>aqueous based mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeZone 4.5</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7751020</td>
			<td>lyophilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td>blue fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td>bioluminescence imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Science Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td></td>
			<td>delicate task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1130-500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O0625-25G</td>
			<td>1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPS Diagnostics CryoGrinder</td>
			<td>OPS Diagnostics, LLC</td>
			<td>CG-08-02</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Quality Biological, Inc.</td>
			<td>119-069-151</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6887-5G</td>
			<td>pepsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peracetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77240-100ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab176757</td>
			<td>phalloidin conjugate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W294004-1KG-K</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>7301L</td>
			<td>bluing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>7211</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate, 98%</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>JK559522</td>
			<td>deoxycholic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5016</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper, Grade 4</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-110</td>
			<td>grade 4 qualitative filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5-4</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying normal tissue radiation effects using extracellular matrix hydrogels

الإشعاع هو علاج للمرضى الذين يعانون من سرطان الثدي السلبي الثلاثي. تأثير الإشعاع على المصفوفة خارج الخلية (ECM) من أنسجة الثدي السليمة ودورها في تكرار المحلية في موقع الورم الرئيسي غير معروف. هنا نقدم طريقة لإزالة الخلايا، التحلل، وتصنيع هيدروجيلات ECM المستمدة من منصات الدهون الثديية المورين. وتُعرض النتائج المتعلقة بفعالية عملية إزالة الخلايا، وجرى تقييم بارامترات الريولوجية. أظهرت خلايا سرطان الثدي التي تحمل اسم GFP وluciferase والمغلفة في الهيدروجيلات زيادة في الانتشار في المواد المائية المشععة. وأخيرا، تم استخدام تلطيخ المترافق phalloidin لتصور تنظيم الهيكل الخلوي للخلايا السرطانية المغلفة. هدفنا هو تقديم طريقة لتلفيق هيدروجيلات للدراسة في المختبر التي تحاكي في بيئة أنسجة الثدي في الجسم الحي واستجابتها للإشعاع من أجل دراسة سلوك الخلايا السرطانية.

تم إزالة الخلايا من الـ MFPs بعد التشعيع باستخدام الإجراء الموضح في الشكل 1A. وتظهر الملوثات الصغرى قبل إزالة الخلايا (الشكل1B)وما بعد إزالة الخلايا (الشكل1C). تم تأكيد إزالة الخلايا باستخدام هيماتوكسيلين ويوسين (H & E) تلطيخ، و 1-([Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol تلط?...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels at JoVE.com

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

دراسة آثار إشعاع الأنسجة الطبيعية باستخدام هيدروجيلات مصفوفة خارج الخلية

يقدم هذا البروتوكول طريقة لإزالة الخلايا وتشكيل هيدروجيل لاحق من منصات الدهون الثديية المورين بعد التشعيع خارج الجسم الحي.

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

هذا البروتوكول يبين أن الإشعاع يؤثر على خصائص المصفوفة خارج الخلية من الأنسجة الدهنية في لوحة الدهون الثدي murine. إضافة الإشعاع في نموذج إزالة الخلايا لم يتم من قبل. تستخدم هذه التقنية عدة خطوات غسيل تخدم كل منها غرضًا كيميائيًا فريدًا في عملية إزالة الخلايا.خصوصية هذه التقنية يسمح لغسلات الكيميائية ألطف، للحفاظ على خصائص الأنسجة بشكل أفضل. يحدث الانتكاس سرطان الثدي بعد العلاج، وخاصة في الحالات السلبية الثلاثية. تقييم كيفية المصفوفة خارج الخلية المشعة يغير سلوك الخلايا السرطانية سيؤدي إلى اكتشافات هامة حول آليات تكرار.بعد العينات تشعيع، وذلك باستخدام مصدر سيزيوم، ونقل MFP المشعع وكامل وسائل الإعلام RPMI إلى خزانة السلامة الحيوية. ملء ستة سنتيمترات أو 10 أطباق سنتيمتر مع وسائل الإعلام ما يكفي لغمر MFP. احتضان في 37 درجة مئوية، مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون، لمدة يومين.أولاً، ضع MFP في أطباق ستة سنتيمترات مع خمسة ملليلتر من محلول تريبسين-EDTA. رش ومسح الأطباق مع 70٪ الإيثانول واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. استخدام 0.7 ملليلتر مصافي لغسل MFP مع المياه ديوند، عن طريق صب الماء على الأنسجة ثلاث مرات.استخدام ملقط لتدليك يدويا الأنسجة بين يغسل. المقبل، وتجفيف الأنسجة لفترة وجيزة على مهمة حساسة مسح ووزنها. ضع الأنسجة المجففة في بوبر ما قبل الأوتكفايد، يحتوي على شريط تحريك مناسب الحجم وغطى الأنسجة بـ 60 ملليلتر من 3٪ t-octylphenoxypolyethoxyethanol لكل غرام من الأنسجة.يُحرّك المزيج لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم افرغ محتويات القارص في مصفاة شطف beaker بالماء الأيونية وصب هذا على الأنسجة.كرر هذه العملية الشطف مرتين أكثر، مع التأكد من استخدام ملقط لتدليك يدويا الأنسجة بين يشطف. بعد ذلك، جفف لفترة وجيزة الأنسجة على مهمة حساسة مسح ووزنها. ضع الأنسجة وقضبان التحريك مرة أخرى إلى نفس الأكواب واغطيها بـ 60 ملليلتر من حمض الديوكسيكوليك بنسبة 4٪ لكل غرام من الأنسجة.يُحرّك المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، تفريغ محتويات القارب في مصفاة شبكة ، وشطف beaker بالماء الأيونية وصب هذا على الأنسجة. كرر هذه العملية الشطف مرتين أكثر، مع التأكد من استخدام ملقط لتدليك يدويا الأنسجة بين يشطف.تجفيف لفترة وجيزة الأنسجة المشطفة على مهمة حساسة مسح ووزنها. ضع الأنسجة المجففة في نفس القارق ، إلى جانب المياه الطازجة ذات الأيونات ، مع 1٪ من البنسلين -الستربتوميسين. تغطية beaker بإحكام مع فيلم البارافين وترك في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.في اليوم التالي استنزاف محتويات القارق في مصفاة، وتجفيف الأنسجة لفترة وجيزة على مهمة حساسة مسح ووزنها. ثم، ضع MFP في نفس القارب مع شريط التحريك المناسب الحجم. تغطية الأنسجة مع 60 ملليلتر من محلول يحتوي على 4٪ الإيثانول و 0.1٪ حمض peracetic لكل غرام من الأنسجة.يُحرّك المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. تخلص محتويات القارص في مصفاة 0.7 ملليمتر. استخدام ملقط لتدليك يدويا الأنسجة ووضع محتويات مرة أخرى في beaker.اغسل الأنسجة عن طريق تغطيتها بـ 60 ملليلتر من 1X PBS لكل غرام من الأنسجة. يُحرّك المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدّة 15 دقيقة. كرر عملية الغسيل هذه مرة أخرى.بعد ذلك، تخلص محتويات القارص في مصفاة 0.7 ملليمتر. باستخدام ملقط، تدليك يدويا الأنسجة ووضع محتويات مرة أخرى في القارق. اغسل الأنسجة عن طريق تغطيتها بـ 60 ملليلتر من الماء المأون لكل غرام من الأنسجة.يُحرّك المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدّة 15 دقيقة. كرر عملية الغسيل هذه مرة أخرى. تجفيف لفترة وجيزة الأنسجة المغسولة على مهمة حساسة مسح ووزنها.تفريغ الأنسجة والمحتويات في مصفاة واستخدام ملقط لتدليك يدويا الأنسجة. ضع محتويات مرة أخرى في القارض وتغطية الأنسجة مع 60 ملليلتر من 100٪ ن-بروبانول لكل غرام من الأنسجة. يُحرّك المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.ثم، وتجفيف لفترة وجيزة الأنسجة على مهمة حساسة مسح ووزنها. تفريغ الأنسجة والمحتويات في مصفاة 0.7 ملليمتر واستخدام ملقط لتدليك الأنسجة يدويا. ضع المحتويات مرة أخرى في القارس وغسل الأنسجة عن طريق تغطيتها بـ 60 ملليلتر من الماء الأيوني لكل غرام من الأنسجة.يُحرّك المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدّة 15 دقيقة. كرر عملية الغسيل هذه ثلاث مرات. بعد هذا، وتجفيف لفترة وجيزة الأنسجة على مهمة حساسة مسح ووزنها.نقل الأنسجة إلى أنبوب 15 ملليلتر المسمى وتجميد في السلبية 80 درجة مئوية بين عشية وضحاها. أولاً، املأ حاوية ضحلة بالنيتروجين السائل. إزالة العينات من الفريزر وتزن كل MFP مزيل الهيمية.ضع عينة واحدة في القذيفة، استخدم قفازاً مبرداً ليمسك بهون الهاون في النيتروجين السائل. ثم، استخدام الحشرات، تعلق على حفر باليد، لطحن العينة. طحن في فترات دقيقة واحدة للتحقق من التقدم وإزالة اليد قفاز من النيتروجين السائل.كرر عملية الطحن هذه لجميع العينات، مع التأكد من رش ومسح هاون وحشرات بالإيثانول بين كل عينة. تخزين العينات مسحوق في أنابيب 15 ملليلتر في درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام. للبدء، إزالة العينات من الثلاجة وذوبان في درجة حرارة الغرفة.في حين أن العينات تذوب، ومزيج البيبسين في حمض الهيدروكلوريك لتشكيل حل بيبسيين HCL. بعد ذلك، أضف عينة من مسحوق وحل Pepsin-HCL إلى أنبوب 15 ملليلتر، وأضف شريطًا صغيرًا ويحرك لمدة 48 ساعة. بعد هذا، ضع الأنابيب على الجليد لمدة خمس دقائق.إضافة 10X برنامج تلفزيوني لكل عينة، بحيث يكون الحل النهائي تركيز 1X PBS. ثم أضف 10٪ حجم/حجم، 0.1 هيدروكسيد الصوديوم الولي لكل حل، للوصول إلى 7.4 pH، باستخدام ورق pH لاختبار كل حل على حدة. باستخدام محلول هلام 7.4 درجة الH، resuspend gfp بيليه و luciferase المسمى الخلايا 4T1 إلى تركيز إما 500، 000 أو 1، 000، 000 خلية لكل ملليلتر من محلول هلام.إضافة 16 ميكرولترات من حل الخلايا هلام إلى كل بئر من 16 بئرا شريحة غرفة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، إضافة 100 microliters من وسائل الإعلام دورة ً كاملة لـ RPMI لكل بئر. مواصلة احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.ثم استخدم مجهر الفلوريس لمراقبة الخلايا في الطول الموجي للإثارة من 519 نانومتر وطول موجة انبعاثات من 618 نانومتر. في هذه الدراسة، تتم دراسة الآثار الطبيعية إشعاع الأنسجة، وذلك باستخدام الهيدروجيلات مصفوفة خارج الخلية. يتم استخدام تلطيخ الهماتوسلين واليوسين لتأكيد إزالة الخلايا ، من خلال فقدان النوى وآثار الحمض النووي الأخرى.في حين يتم استخدام تلطيخ O الزيت لتقييم محتوى الدهون وتأكيد الاحتفاظ مورفولوجيا ديباسيت. يتم تقييم الخصائص الريولوجية للهيدروجيل ECM عند 37 درجة مئوية. معامل التخزين أعلى من معامل الخسارة لجميع الظروف، مما يدل على تشكيل هيدروجيل مستقر.ثم يتم تغليف GFP و luciferase المسمى 4T1 خلايا سرطان ماماري في الهيدروجيل. يتم فحص انتشار الخلايا عن طريق المجهر المفلور، عن طريق قياسات الإضاءة وتلطيخ القدرة على البقاء، بعد 48 ساعة من التغليف. تظهر الهيدروجيل المشعة اتجاهًا متزايدًا في انتشار الخلايا السرطانية.Phalloidin conjugate يستخدم لتصور F-Actin في الخلايا المغلفة. تذكر أن تبرد هاون قبل وضع الأنسجة داخل الطاحونة، وقذائف هاون دافئة قد يؤدي إلى الطحن غير مكتملة. توخي الحذر عند التعامل مع ن بروبانال والبيبين، فقط فتح ن بروبانال وغيرها من العوامل ديسيلولارالاريا تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية.إذا كان ذلك ممكنا ، وزن البيبسين تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية ، كما أن هناك خطر من استنشاق. يمكن تقييم تغيرات تكوين ECM بعد التشعيع و إزالة الخلايا باستخدام قياس الطيف الكتلي و Spectroscopy Raman. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تحليل بنية الألياف الهيدروجيل ECM عن طريق المسح المجهري الإلكترون.هذه الطريقة لديها القدرة على التوسع في دراسة آثار الإشعاع على الخلايا السرطانية، وليس فقط ولكن أيضا الخلايا المناعية، فضلا عن الأنسجة التي تعاني من أضرار الإشعاع، نتيجة للعلاج. هذه التقنية إزالة الخلايا سوف تسمح للباحثين لتقييم خصائص المصفوفة خارج الخلية من الأنسجة التالية للإشعاع، وهو خيار علاج مهم في معظم أنواع السرطان.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

تحليل الاتصالات بين وحيدات وخلايا سرطان الثدي الأولية في مصفوفة خارج الخلية استخراج (أكمي)-على أساس نظام ثلاثي الأبعاد

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

الحيوانات الأليفة والتصوير بالرنين المغناطيسي يسترشد تشعيع نموذج الفئران جليوبلاستوما استخدام الصغرى--إيرادياتور

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

التصوير النهج لإجراء تقييمات للسمية الأكسدة باستخدام أجهزة استشعار فلوروجينيك ترميز وراثيا

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

تصنيع المصفوفة خارج الخلية اللسان وإعادة تشكيل للسان الخلايا الحرشفية في المختبر

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

استخراج الحويصلات خارج الخلية من الأنسجة كاملة

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

نموذج المصفوفة خارج الخلية العظام ثلاثية الأبعاد ل Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

قياس دورة الخلية محددة من γH2AX والمبرمج بعد الإجهاد السامة الجينية عن طريق قياس التدفق الخلوي

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

توصيف آثار مثبطات Migrastatic على غزو الورم 3D Spheroid من قبل عالية الدقة المجهرية البؤرية

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

دراسة ثلاثية سلبية سرطان الثدي باستخدام نموذج سرطان الثدي Orthotopic

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

دراسة اثار الورم الذي يفرز الأورام الليفية علي تنشيط الضامة باستخدام الثقافة المشتركة مع غشاء نفاذيه يدعم

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...