Name: studying normal tissue radiation effects using extracellular matrix hydrogels
Uploaded: 2019-07-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. Laura L. Bronsart for at levere GFP-og luciferase-4T1 celler, Dr. Edward L. LaGory for rådgivning om 1-([4-(Xylylazo) xylyl] AZO) -2-naphthol farvning, Dr. Craig L. Duvall for IVIS og lyophilizer brug, og Dr. Scott A. Guelcher for rheometer Bruge. Denne forskning blev finansielt støttet af NIH Grant #R00CA201304.

Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer og protokoller godkendt af Vanderbilt University institutionel Animal Care og brug udvalg.
1. klargøring og ex vivo-bestråling af MFP'er
<ol><li>Offer athymic nu/nu mus (8 – 10 uger) ved hjælp af CO2 kvælning efterfulgt af livmoderhals dislokation.</li>
	<li>Rengør huden med 70% ethanol.</li>
	<li>Saml bryst fat Pads (MFP'er) fra ofrede mus ved hjælp af præ-steriliseret saks og pincet i et 15 m...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+cancer.">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2018.">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li><li>Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregional+recurrence+after+breast+cancer+surgery:+a+systematic+review+by+receptor+phenotype.">Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).</li><li>Miller, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+treatment+and+survivorship+statistics,+2016.">Cancer treatment and survivorship statistics, 2016.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).</li><li>Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Circulating+Breast+Cancer+Cells+Is+Stimulated+by+Radiotherapy.">Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy.</a> Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).</li><li>Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Promote+Circulating+Tumor+Cell-Mediated+Local+Recurrence+Following+Radiation+Therapy+in+Immunosuppressed+Patients.">Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients.</a> Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).</li><li>Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+after+radiation+therapy:+Review+of+the+literature.">Wound healing after radiation therapy: Review of the literature.</a> Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).</li><li>Beachley, V. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+matrix+arrays+for+high+throughput+screening+and+systems+analysis+of+cell+function.">Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function.</a> Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+metastases+obtained+by+culturing+colorectal+cancer+cells+on+tissue-specific+decellularized+scaffolds.">Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).</li><li>Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+hydrogels+from+decellularized+tissues:+Structure+and+function.">Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function.</a> Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).</li><li>Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+and+ECM-like+materials+&#8212;+Biomaterials+for+applications+in+regenerative+medicine+and+cancer+therapy.">ECM and ECM-like materials &#8212; Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).</li><li>Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+hydrogel+scaffold+from+decellularized+human+lipoaspirate.">Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate.</a> Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).</li><li>Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+derived+myocardial+matrix+as+an+injectable+scaffold+for+cardiac+tissue+engineering.">Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering.</a> Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).</li><li>Pouliot, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+naturally+derived+lung+extracellular+matrix+hydrogel.">Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).</li><li>Bonvillain, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Nonhuman+Primate+Model+of+Lung+Regeneration:+Detergent-Mediated+Decellularization+and+Initial+In+Vitro+Recellularization+with+Mesenchymal+Stem+Cells.">A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).</li><li>Brown, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Three+Methods+for+the+Derivation+of+a+Biologic+Scaffold+Composed+of+Adipose+Tissue+Extracellular+Matrix.">Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).</li><li>Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+Hydrogels+from+Pulmonary+Extracellular+Matrix+for+3D+Cell+Culture.">Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).</li><li>Massensini, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration-dependent+rheological+properties+of+ECM+hydrogel+for+intracerebral+delivery+to+a+stroke+cavity.">Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity.</a> Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).</li><li>Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+5+1+facilitates+cancer+cell+invasion+through+enhanced+contractile+forces.">Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces.</a> Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).</li><li>Ahmadzadeh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+two-way+feedback+between+contractility+and+matrix+realignment+reveals+a+nonlinear+mode+of+cancer+cell+invasion.">Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).</li></ol>

Denne metode til hydrogel dannelse er i høj grad afhængig af mængden af start vævet. Murine MFP'er er små, og den decellularization proces resulterer i en betydelig reduktion af materiale (tabel 1). Processen kan gentages med flere MFP'er for at øge det endelige udbytte. Fræsning er et andet vigtigt skridt, der kan føre til tab af materiale. Andre har vist succes med en Cryogen mølle, men denne protokol er baseret på fræsning via en håndholdt mørtel og elektrisk boremaskine med en Pestle fas...

Kræft er karakteriseret ved overskydende spredning af celler, der kan unddrage apoptose og også metastaserer til fjerntliggende steder1. Brystkræft er en af de mest almindeligt forekommende former blandt kvinder i USA, med en anslået 266.000 nye tilfælde og 40.000 dødsfald i 20182. En særlig aggressiv og svær at behandle subtype er tredobbelt negativ brystkræft (TNBC), som mangler østrogen receptor (ER), progesteron receptor (PR), og human epidermal vækstfaktor (HER2). Strålebehandling er almindeligt anvendt i brystkræft at eliminere resterende tumorceller efter lumpectomy, men over 13% af TNBC patienter stadig oplever gentagelse på den primære tumor site3.
Det er kendt, at strålebehandling er effektiv til at afbøde metastase og gentagelse, fordi kombinationen af lumpektomi og stråling resulterer i samme langsigtede overlevelse som mastektomi4. Men, det er for nylig blevet påvist, at strålebehandling er forbundet med lokal gentagelse til den primære tumor site i immunkompromitterede indstillinger5,6. Også, det er velkendt, at stråling ændrer den ekstracellulære matrix (ECM) af normale væv ved inducerende fibrose7. Derfor er det vigtigt at forstå den rolle, stråling-induceret ECM ændringer i dikterer tumor celle adfærd.
Decellularized væv har været anvendt som in vitro-modeller til at studere sygdom8,9. Disse decellularized væv bevare ECM sammensætning og rekapitulate komplekset in vivo ECM. Denne decellularized væv ECM kan yderligere behandles og fordøjet til at danne rekonstituerede ECM silicagelrogeler, der kan bruges til at studere cellevækst og funktion10,11. For eksempel, injicerbare silicagelrogeler afledt af decellularized humant lipoaspirat og fra myokardievæv tjente som ikke-invasive metoder til vævsteknik, og en hydrogel afledt af svin lungevævet blev udnyttet som en in vitro metode til testning mesenchymal stamcelle fastgørelse og levedygtighed12,13,14. Virkningen af normale vævs stråling skader på ECM egenskaber, dog, er ikke blevet undersøgt.
Hydrogels afledt af ECM har det største potentiale for in vitro-undersøgelse af in vivo fænomener. Flere andre materialer er blevet undersøgt, herunder kollagen, fibrin, og matrigel, men det er vanskeligt at syntetisk rekapitulere sammensætningen af ECM13. En fordel ved at bruge ECM-afledte silicagelrogeler er, at ECM indeholder de nødvendige proteiner og vækstfaktorer for en bestemt væv14,15. Bestråling af normalt væv under lumpektomi forårsager betydelige ændringer i ECM, og ECM-afledte silicagelrogeler kan bruges til at studere denne effekt in vitro. Denne metode kan føre til mere komplekse og mere præcise in vitro-modeller af sygdom.
I denne undersøgelse, vi udsat murine bryst fat Pads (MFP'er) til stråling ex vivo. Mfp''erne var decellularized og lavet til præ-gel opløsning. Hydrogels blev dannet med indlejrede 4T1 celler, en murine TNBC cellelinje. De rheologiske egenskaber af hydrogel materialet blev undersøgt, og tumor celle dynamik blev evalueret inden for hydrogels. Hydrogels fremstillet af bestrålede MFP'er forbedret tumor celle spredning. Fremtidige undersøgelser vil indarbejde andre celletyper til at studere celle-celle interaktioner i forbindelse med kræft recidiv efter behandling.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>19387</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AR 2000ex Rheometer</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>10D4335</td>
			<td>rheometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcein acetoxymethyl (calcein AM)</td>
			<td>Molecular Probes, Inc.</td>
			<td>C1430</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin Firefly, potassium salt</td>
			<td>Biosynth Chemistry &#38; Biology</td>
			<td>L-8820</td>
			<td>(S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant for Histology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>06522-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin-Y with Phloxine</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>71304</td>
			<td>eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium homodimer</td>
			<td>Molecular Probes, Inc.</td>
			<td>E1169</td>
			<td>ethidium homodimer-1 (EthD-1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td>cryostat embedding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>aqueous based mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeZone 4.5</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7751020</td>
			<td>lyophilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td>blue fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td>bioluminescence imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Science Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td></td>
			<td>delicate task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1130-500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O0625-25G</td>
			<td>1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPS Diagnostics CryoGrinder</td>
			<td>OPS Diagnostics, LLC</td>
			<td>CG-08-02</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Quality Biological, Inc.</td>
			<td>119-069-151</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6887-5G</td>
			<td>pepsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peracetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77240-100ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab176757</td>
			<td>phalloidin conjugate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W294004-1KG-K</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>7301L</td>
			<td>bluing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>7211</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate, 98%</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>JK559522</td>
			<td>deoxycholic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5016</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper, Grade 4</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-110</td>
			<td>grade 4 qualitative filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5-4</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying normal tissue radiation effects using extracellular matrix hydrogels

Stråling er en terapi for patienter med tredobbelt negativ brystkræft. Virkningen af stråling på den ekstracellulære matrix (ECM) af sundt brystvæv og dets rolle i lokal gentagelse på den primære tumor site er ukendt. Her præsenterer vi en metode til decellularization, lyofilisering, og fabrikation af ECM silicagelrogeler afledt af murine bryst fedt puder. Resultaterne er præsenteret på effektiviteten af decellularization proces, og rheologiske parametre blev vurderet. Gfp-og luciferase-mærkede brystkræft celler indkapslet i silicagelrogeler viste en stigning i spredningen i bestrålede silicagelrogeler. Endelig, phalloidin konjugat farvning blev anvendt til at visualisere cytoskelet organisation af indkapslede tumorceller. Vores mål er at præsentere en metode til opdigte silicagelrogeler til in vitro-undersøgelse, der efterligner in vivo brystvæv miljø og dets reaktion på stråling for at studere tumor celle adfærd.

MFP'er blev decellulariseret efter bestråling ved hjælp af den procedure, der er vist i figur 1a. MFP'er præ-decellularization (figur 1b) og post-Decellularization (figur 1c) er vist. Decellularisering blev bekræftet ved hjælp af hematoxylinlegemer og eosin (H & E) farvning, og 1-([4-(Xylylazo) xylyl] AZO) -2-naphthol farvning blev anvendt til at evaluere lipid indhold (figur 2). De rheologiske egenskaber ved ECM-sil...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels at JoVE.com

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Studere normale vævs stråling effekter ved hjælp af ekstracellulære matrix Hydrogels

Denne protokol præsenterer en metode til decellularisering og efterfølgende hydrogel dannelse af murine bryst fedt puder efter ex vivo bestråling.

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Denne protokol viser, at stråling påvirker ekstracellulære matrix egenskaber af fedtvæv i murine bryst fedt pad. Tilsætning af stråling i en decellularisering model er ikke blevet gjort før. Denne teknik bruger flere vasketrin, der hver tjener et unikt kemisk formål i decellularization processen.Specificitet af denne teknik giver mulighed for blidere kemiske vaske, for bedre at bevare vævsegenskaber. Brystkræft tilbagefald opstår efter behandling, især i tredobbelt negative tilfælde. Evaluering af, hvordan bestrålede ekstracellulære matrix ændrer tumorcelle adfærd vil føre til vigtige opdagelser om recidiv mekanismer.Efter bestråling af prøver overføres det bestrålede MFP'er og komplette RPMI-medier til et biosikkerhedsskab ved hjælp af en cæsiumkilde. Fyld seks centimeter eller 10 centimeter retter med nok medier til at nedsænke MFP's. Inkubere ved 37 grader Celsius, med 5% kuldioxid, i to dage.Først skal du placere MFP's i seks centimeter retter med fem milliliter Trypsin-EDTA opløsning. Spray og tør opvasken med 70% ethanol og inkuberes ved 37 grader Celsius i en time. Brug 0,7 milliliterssier til at vaske MFP'erne med deioniseret vand ved at hælde vand over vævet tre gange.Brug vices til manuelt at massere vævet i mellem vasker. Dernæst kort tørre vævet på en delikat opgave tørre og veje det. Det tørrede væv i et for-autoklaveret bægerglas, der indeholder en passende rørebjælke, og dæk vævene med 60 milliliter 3%t-octylphenoxypolyethoxyethanol pr. gram væv.Rør rundt i en time ved stuetemperatur. Smid derefter bægerens indhold i en si. Skyl bægerglasset med deioniseret vand og hæld det på vævet.Gentag denne skylning proces to gange mere, og sørg for at bruge kraftvæcesner til manuelt massere vævet i mellem skylninger. Efter dette, kort tørre vævet på en delikat opgave tørre og veje. Væv og rørestængerne sættes tilbage i de samme bægerglas og dækkes med 60 milliliter 4%deoxycholic syre pr. gram væv.Rør ved stuetemperatur i en time. Dernæst dump bægerens indhold i en maskestæn, skyl bægerglasset med deioniseret vand og hæld det på vævet. Gentag denne skylning proces to gange mere, og sørg for at bruge kraftvæcesner til manuelt massere vævet i mellem skylninger.Tør kort det skyllede væv på en delikat opgave tørre og veje det. Placer det tørrede væv i samme bægerglas, sammen med frisk deioniseret vand, suppleret med 1% penicillin-streptomycin. Dæk bægeret stramt med paraffin film og lad ved 4 grader Celsius natten over.Den næste dag dræne bægerglasindholdet i en si, kort tørre vævet på en delikat opgave tørre og veje det. Derefter placere MFP's i samme bæger med en passende størrelse røre bar. Vævet dækkes med 60 milliliter en opløsning, der indeholder 4 %ethanol og 0,1 % peredikesyre pr. gram væv.Rør ved stuetemperatur i to timer. Smid bægerens indhold i en 0,7 millimeter si. Brug vicess til manuelt at massere vævet og placere indholdet tilbage i bægeret.Vævet vaskes ved at dække det med 60 milliliter 1X PBS pr. gram væv. Rør ved stuetemperatur i 15 minutter. Gentag hele denne vaskeproces en gang til.Dernæst dumper bægerens indhold i en 0,7 millimeter si. Brug af spån, masser vævet manuelt og læg indholdet tilbage i bægeret. Vask vævet ved at dække det med 60 milliliter deioniseret vand pr gram væv.Rør ved stuetemperatur i 15 minutter. Gentag hele denne vaskeproces en gang til. Tør kort det vaskede væv på en delikat opgave tørre og veje det.Dump væv og indhold i en si og bruge krafterne til manuelt at massere vævet. Indholdet sættes tilbage i bægeret og dække væv med 60 milliliter 100% n-propanol pr. gram væv. Rør ved stuetemperatur i en time.Tør derefter kortvarigt vævet på en delikat opgave tørre og veje det. Dump væv og indhold i en 0,7 millimeter si og bruge kraftkker til manuelt at massere vævet. Indholdet sættes tilbage i bægerglasset og vaskes ved at dække det med 60 milliliter deioniseret vand pr. gram væv.Rør ved stuetemperatur i 15 minutter. Gentag denne vaskeproces tre gange. Efter dette, kort tørre vævet på en delikat opgave tørre og veje det.Overfør vævet til et mærket 15 milliliter rør og fryse ved negative 80 grader Celsius natten over. Først fylde en lavvandet beholder med flydende nitrogen. Fjern prøverne fra fryseren og veje hver frysetørret MFP.Placer en prøve i mørtel, skal du bruge en kryogen handske til at holde mørtel i flydende nitrogen. Brug derefter en støder, der er fastgjort til en håndholdt boremaskine, til at fræse prøven. Fræs i et minuts intervaller for at kontrollere udviklingen og fjern den behandskede hånd fra det flydende nitrogen.Gentag denne fræsningsproces for alle prøver, og sørg for at sprøjte og tørre mørtel og støder med ethanol mellem hver prøve. De pulveriserede prøver opbevares i 15 milliliterrør ved negative 80 grader Celsius, indtil de er klar til brug. Til at begynde, fjerne prøverne fra fryseren og tø ved stuetemperatur.Mens prøverne er optøning, bland pepsin i saltsyre til at danne en Pepsin-HCL opløsning. Dernæst tilsættes prøve pulver og Pepsin-HCL opløsning til en 15 milliliter rør, tilsæt en lille røre bar og rør i 48 timer. Derefter anbringes rørene på is i fem minutter.Der tilsættes 10X PBS til hver prøve, således at den endelige opløsning har en koncentration på 1X PBS. Derefter tilsættes 10% volumen / volumen, 0,1 molar natriumhydroxid til hver opløsning, for at nå pH 7,4, ved hjælp af pH-papir til at teste hver opløsning individuelt. Ved hjælp af en pH 7.4 gelopløsning opsaltrede den pelleterede GFP og luciferase mærket 4T1 celler til en koncentration på enten 500, 000 eller 1, 000, 000 celler pr. milliliter gelopløsning.Tilføj 16 mikroliter gelcelleopløsning til hver brønd af en 16-brønd kammer dias og inkubere ved 37 grader Celsius i 30 minutter. Efter dette, tilføje 100 mikroliter af komplette RPMI medier til hver brønd. Fortsæt med at inkubere ved 37 grader Celsius i 48 timer.Brug derefter et fluorescensmikroskop til at observere cellerne ved en excitation bølgelængde på 519 nanometer og en emission bølgelængde på 618 nanometer. I denne undersøgelse, normal væv stråling virkninger er undersøgt, ved hjælp af ekstracellulære matrix hydrogels. Hæmatoxylin og eosin farvning bruges til at bekræfte decellularisering, gennem tab af kerner og andre spor af DNA.Mens Oil Red O farvning bruges til at evaluere lipid indhold og bekræfte fastholdelsen af en dipasite morfologi. ECM-hydrogels reologiske egenskaber vurderes ved 37 grader Celsius. Opbevaring modulus er højere end tabet modulus for alle forhold, viser stabil hydrogel dannelse.GFP og luciferase mærket 4T1 mammary karcinom celler er derefter indkapslet i hydrogels. Cellespredning undersøges ved fluorescensmikroskopi ved lysstofmålinger og levedygtighedsfarvning, 48 timer efter indkapsling. Bestrålede hydrogels viser en stigende tendens i tumor celleprolifererende.Phalloidin konjugat bruges til at visualisere F-Actin i de indkapslede celler. Husk at afkøle mørtel, før du placerer vævet inde i møllen, en varm mørtel kan føre til ufuldstændig fræsning. Vær forsigtig ved håndtering n-propanal og pepsin, kun åbne n-propanal og andre decellularizationary agenter under en kemisk hætte.Hvis det er muligt, veje pepsin under en kemisk hætte, da der er fare for indånding. Ændringer i ECM-sammensætningen efter bestråling og decellularisering kan evalueres ved hjælp af massespektrometri og Ramanspektroskopi. Desuden kan fiberstrukturen af ECM hydrogels analyseres ved at scanne elektronmikroskopi.Denne metode har potentiale til at blive udvidet til at undersøge virkningerne af stråling på, ikke kun tumorceller, men også immunceller, samt væv, der oplever strålingsskader, som følge af terapi. Denne decellularization teknik vil give forskerne mulighed for at vurdere de ekstracellulære matrix egenskaber af vævet efter stråling, som er en vigtig behandlingsmulighed i de fleste kræftformer.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

Analysere kommunikationen mellem monocytter og primær brystkræftceller i en ekstracellulære Matrix ekstrakt (ECME)-baseret tre-dimensionelle System

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

PET og Mr guidede bestråling af en glioblastom rotte Model ved hjælp af en mikro-irradiator

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

Imaging tilgange til vurderinger af toksikologiske oxidativt Stress ved hjælp af genetisk kodet Fluorogenic sensorer

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabrikation af tungen ekstracellulære Matrix og rekonstituering af tungen planocellulært karcinom In Vitro

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Udvinding af ekstracellulære vesikler fra hele væv

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Tre-dimensionelle knogle ekstracellulære Matrix Model for osteosarkom

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Celle cyklus-specifik måling af γH2AX og apoptose efter genotoksisk stress ved flow cytometri

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Karakterisering af virkningerne af Migrastatiske hæmmere på 3D tumor Spheroid invasion af høj opløsning Konfokal mikroskopi

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studere Triple Negative Breast Cancer Brug Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Undersøgelse af virkningerne af tumor-Udskillede paracrine Ligands på makrofag aktivering ved hjælp af co-kultur med permeable membran støtter

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...