Name: studying normal tissue radiation effects using extracellular matrix hydrogels
Uploaded: 2019-07-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels at JoVE.com

De auteurs bedanken Dr. Laura L. bronsart voor het leveren van de GFP-en Luciferase-4t1 cellen, Dr. Edward l. lagory voor advies over 1-([4-(xylylazo) xylyl] azo) -2-naphthol kleuring, Dr. Craig L. Duvall voor ivis en lyofilisator gebruik, en Dr. Scott A. guelcher voor rheometer Gebruiken. Dit onderzoek werd financieel gesteund door NIH Grant #R00CA201304.

Dierstudies werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en protocollen die zijn goedgekeurd door het Comité voor institutionele dierenverzorging en-gebruik van de Vanderbilt University.
1. bereiding en ex vivo bestraling van Mfp's
<ol><li>Offer athymische nu/nu muizen (8 – 10 weken) met behulp van co2 verstikking gevolgd door cervicale dislocatie.</li>
	<li>Reinig de huid met 70% ethanol.</li>
	<li>Verzamel borst Fat pads (mfp's) van het opgeofferde m...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+cancer.">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2018.">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li><li>Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregional+recurrence+after+breast+cancer+surgery:+a+systematic+review+by+receptor+phenotype.">Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).</li><li>Miller, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+treatment+and+survivorship+statistics,+2016.">Cancer treatment and survivorship statistics, 2016.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).</li><li>Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Circulating+Breast+Cancer+Cells+Is+Stimulated+by+Radiotherapy.">Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy.</a> Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).</li><li>Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Promote+Circulating+Tumor+Cell-Mediated+Local+Recurrence+Following+Radiation+Therapy+in+Immunosuppressed+Patients.">Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients.</a> Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).</li><li>Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+after+radiation+therapy:+Review+of+the+literature.">Wound healing after radiation therapy: Review of the literature.</a> Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).</li><li>Beachley, V. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+matrix+arrays+for+high+throughput+screening+and+systems+analysis+of+cell+function.">Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function.</a> Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+metastases+obtained+by+culturing+colorectal+cancer+cells+on+tissue-specific+decellularized+scaffolds.">Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).</li><li>Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+hydrogels+from+decellularized+tissues:+Structure+and+function.">Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function.</a> Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).</li><li>Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+and+ECM-like+materials+&#8212;+Biomaterials+for+applications+in+regenerative+medicine+and+cancer+therapy.">ECM and ECM-like materials &#8212; Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).</li><li>Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+hydrogel+scaffold+from+decellularized+human+lipoaspirate.">Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate.</a> Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).</li><li>Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+derived+myocardial+matrix+as+an+injectable+scaffold+for+cardiac+tissue+engineering.">Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering.</a> Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).</li><li>Pouliot, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+naturally+derived+lung+extracellular+matrix+hydrogel.">Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).</li><li>Bonvillain, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Nonhuman+Primate+Model+of+Lung+Regeneration:+Detergent-Mediated+Decellularization+and+Initial+In+Vitro+Recellularization+with+Mesenchymal+Stem+Cells.">A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).</li><li>Brown, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Three+Methods+for+the+Derivation+of+a+Biologic+Scaffold+Composed+of+Adipose+Tissue+Extracellular+Matrix.">Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).</li><li>Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+Hydrogels+from+Pulmonary+Extracellular+Matrix+for+3D+Cell+Culture.">Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).</li><li>Massensini, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration-dependent+rheological+properties+of+ECM+hydrogel+for+intracerebral+delivery+to+a+stroke+cavity.">Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity.</a> Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).</li><li>Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+5+1+facilitates+cancer+cell+invasion+through+enhanced+contractile+forces.">Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces.</a> Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).</li><li>Ahmadzadeh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+two-way+feedback+between+contractility+and+matrix+realignment+reveals+a+nonlinear+mode+of+cancer+cell+invasion.">Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).</li></ol>

Deze methode van hydrogel vorming is grotendeels afhankelijk van de hoeveelheid start weefsel. Murine Mfp's zijn klein en het decellularisatie proces resulteert in een significante reductie van materiaal (tabel 1). Het proces kan worden herhaald met meer Mfp's om de uiteindelijke opbrengst te verhogen. Frezen is een andere belangrijke stap die kan leiden tot verlies van materiaal. Anderen hebben succes getoond met een cryogene molen, maar dit protocol is gebaseerd op frezen via een handheld mortel en ele...

Kanker wordt gekenmerkt door overmatige proliferatie van cellen die apoptosis kunnen omzeilen en ook metastaseren naar verre sites1. Borstkanker is een van de meest voorkomende vormen onder vrouwtjes in de VS, met naar schatting 266.000 nieuwe gevallen en 40.000 sterfgevallen in 20182. Een bijzonder agressief en moeilijk te behandelen subtype is drievoudige negatieve borstkanker (TNBC), die geen oestrogeen receptor (ER), progesteron receptor (PR) en humane epidermale groeifactor (HER2) mist. Radiotherapie wordt vaak gebruikt bij borstkanker om residuele tumorcellen na lumpectomie te elimineren, maar meer dan 13% van de TNBC-patiënten ervaart nog steeds een recidief bij de primaire tumor locatie3.
Het is bekend dat radiotherapie effectief is in het verzachten van metastase en herhaling, omdat de combinatie van lumpectomie en straling in dezelfde lange termijn Overleving resulteert als mastectomie4. Echter, het is onlangs aangetoond dat bestraling wordt geassocieerd met lokale herhaling van de primaire tumor site in immuungecompromitteerde instellingen5,6. Ook is het bekend dat straling de extracellulaire matrix (ECM) van normaal weefsel verandert door fibrose7te induceren. Daarom is het belangrijk om te begrijpen van de rol van straling-geïnduceerde ECM veranderingen in het diceren van tumor Celgedrag.
Decellularized weefsels zijn gebruikt als in vitro modellen om de ziekte te bestuderen8,9. Deze decellularized weefsels behouden ECM-samenstelling en recapituleren het complex in vivo ECM. Deze decellularized weefsel-ECM kan verder worden verwerkt en verteerd om gereconstitueerde ECM-hydrogels te vormen die kunnen worden gebruikt om celgroei en functie10,11te bestuderen. Bijvoorbeeld, injecteerbare hydrogels afgeleid van decellularized humaan lipoaspiraat en van myocard weefsel diende als niet-invasieve methoden van weefsel engineering, en een hydrogel afgeleid van varkens longweefsel werd gebruikt als een in vitro testmethode mesenchymale stamcel bevestiging en levensvatbaarheid12,13,14. Het effect van normale beschadiging van de weefsel straling op de ECM-eigenschappen is echter niet onderzocht.
Hydrogels afgeleid van ECM hebben het grootste potentieel voor in vitro onderzoek naar in vivo verschijnselen. Er zijn verschillende andere materialen bestudeerd, waaronder collageen, fibrin en matrigel, maar het is moeilijk om de samenstelling van de ECM13synthetisch te recapituleren. Een voordeel van het gebruik van ecu-afgeleide hydrogels is dat de ECM de nodige eiwitten en groeifactoren voor een bepaald weefsel14,15bevat. Bestraling van normaal weefsel tijdens lumpectomie veroorzaakt significante veranderingen in de ECM, en de ECM-afgeleide hydrogels kunnen worden gebruikt om dit effect in vitro te bestuderen. Deze methode kan leiden tot meer complexe en nauwkeurigere in vitro modellen van ziekte.
In deze studie hebben we Murine borst Fat pads (mfp's) blootgesteld aan straling ex vivo. De Mfp's waren decellularized en gemaakt in pre-gel oplossing. Hydrogels werden gevormd met ingesloten 4T1 cellen, een Murine TNBC cellijn. De Rheologische eigenschappen van het hydrogel materiaal werden onderzocht en de tumor celdynamiek werd geëvalueerd binnen de hydrogels. Hydrogels vervaardigd van bestraalde Mfp's verbeterde tumor celproliferatie. Toekomstige studies zullen omvatten andere celtypen om celcelinteracties te bestuderen in de context van herhaling van kanker na therapie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>19387</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AR 2000ex Rheometer</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>10D4335</td>
			<td>rheometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcein acetoxymethyl (calcein AM)</td>
			<td>Molecular Probes, Inc.</td>
			<td>C1430</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin Firefly, potassium salt</td>
			<td>Biosynth Chemistry &#38; Biology</td>
			<td>L-8820</td>
			<td>(S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant for Histology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>06522-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin-Y with Phloxine</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>71304</td>
			<td>eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium homodimer</td>
			<td>Molecular Probes, Inc.</td>
			<td>E1169</td>
			<td>ethidium homodimer-1 (EthD-1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td>cryostat embedding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>aqueous based mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeZone 4.5</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7751020</td>
			<td>lyophilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td>blue fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td>bioluminescence imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Science Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td></td>
			<td>delicate task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1130-500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O0625-25G</td>
			<td>1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPS Diagnostics CryoGrinder</td>
			<td>OPS Diagnostics, LLC</td>
			<td>CG-08-02</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Quality Biological, Inc.</td>
			<td>119-069-151</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6887-5G</td>
			<td>pepsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peracetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77240-100ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab176757</td>
			<td>phalloidin conjugate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W294004-1KG-K</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>7301L</td>
			<td>bluing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>7211</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate, 98%</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>JK559522</td>
			<td>deoxycholic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5016</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper, Grade 4</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-110</td>
			<td>grade 4 qualitative filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5-4</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying normal tissue radiation effects using extracellular matrix hydrogels

Straling is een therapie voor patiënten met drievoudige negatieve borstkanker. Het effect van straling op de extracellulaire matrix (ECM) van gezonde borstweefsel en haar rol in lokale herhaling op de primaire tumor site zijn onbekend. Hier presenteren we een methode voor de decellularisatie, lyofilisatie en fabricage van ECM-hydrogels die zijn afgeleid van Murine-vetpads. Resultaten worden gepresenteerd over de effectiviteit van het decellularisatie proces, en reologische parameters werden beoordeeld. GFP-en Luciferase-gelabelde borstkankercellen die in de hydrogels zijn ingekapseld, toonden een toename van proliferatie in bestraalde hydrogels. Tot slot, phalloidin geconjugeerde kleuring werd gebruikt om cytoskelet organisatie van ingekapselde tumorcellen te visualiseren. Ons doel is om een methode voor het vervaardigen van hydrogels voor in vitro onderzoek dat nabootsen van de in vivo borstweefsel omgeving en haar reactie op straling te presenteren om tumor cel gedrag te bestuderen.

Mfp's werden na bestraling met behulp van de in Figuur 1agetoonde procedure decellularized. MFPs pre-decellularisatie (Figuur 1b) en post-decellularisatie (figuur 1c) worden weergegeven. Decellularisatie werd bevestigd met behulp van hematoxyline en eosine (H & E) kleuring, en 1-([4-(Xylylazo) xylyl] azo) -2-naftol-kleuring werd gebruikt om het vetgehalte te evalueren (Figuur 2). De Rheologische eigenschappen van de ECM-h...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels at JoVE.com

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Het bestuderen van normale weefsel straling effecten met behulp van extracellulaire matrix hydrogels

Dit protocol presenteert een methode voor decellularisatie en daaropvolgende hydrogel vorming van muriene borst vetpads na ex vivo bestraling.

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Dit protocol toont aan dat straling extracellulaire matrix eigenschappen van vetweefsel in het murine borstvetpad beïnvloedt. De toevoeging van straling in een decellularisatiemodel is nog niet eerder gedaan. Deze techniek maakt gebruik van verschillende wasstappen die elk een uniek chemisch doel dienen in het decellularisatieproces.Specificiteit van deze techniek zorgt voor zachtere chemische wasbeurten, om de weefseleigenschappen beter te behouden. Borstkanker terugval treedt op na de therapie, vooral in driedubbele negatieve gevallen. Evalueren hoe de bestraalde extracellulaire matrix het gedrag van tumorcellen verandert, zal leiden tot belangrijke ontdekkingen over recidiefmechanismen.Na het bestralen van monsters, met behulp van een cesiumbron, breng je de bestraalde MFP's en complete RPMI-media over in een bioveiligheidskast. Vul 6 centimeter of 10 centimeter schotels met genoeg media om de MFP's onder te dompelen. Incubeer bij 37 graden Celsius, met 5%kooldioxide, gedurende twee dagen.Plaats eerst de MFP's in schotels van zes centimeter met vijf milliliter Trypsin-EDTA oplossing. Spray en veeg de gerechten met 70% ethanol en incubeer op 37 graden Celsius gedurende een uur. Gebruik 0,7 milliliter strainers om de MFP's te wassen met gedeïsized water, door het gieten van water over het weefsel drie keer.Gebruik tangen om het weefsel tussen de wasbeurten handmatig te masseren. Vervolgens, kort droog het weefsel op een delicate taak veeg en weeg het. Leg de gedroogde weefsels in een voorautoclaved bekerglas, met een geschikte formaat roerstaaf en bedek de weefsels met 60 milliliter van 3%t-octylfenoxypolyethoxyethanol per gram weefsel.Roer een uur op kamertemperatuur. Dump dan de inhoud van de beker in een zeef. Spoel het bekerglas met gedeïoniseerd water en giet dit op de weefsels.Herhaal dit spoelproces nog twee keer, zorg ervoor dat tangen gebruiken om het weefsel handmatig te masseren tussen de spoelingen door. Daarna, kort droog het weefsel op een delicate taak af te vegen en te wegen. Plaats de weefsels en de roerrepen terug in dezelfde bekers en bedek ze met 60 milliliter van 4% deoxycholic zuur per gram weefsel.Roer een uur op kamertemperatuur. Dump vervolgens de inhoud van de beker in een mesh-zeef, spoel het bekerglas met gedeïoniseerd water en giet dit op de weefsels. Herhaal dit spoelproces nog twee keer, zorg ervoor dat tangen gebruiken om het weefsel handmatig te masseren tussen de spoelingen door.Droog het gespoelde weefsel kort op een delicate taak af te vegen en te wegen. Plaats de gedroogde weefsels in hetzelfde bekerglas, samen met vers gedeïioneerd water, aangevuld met 1%penicilline-streptomycine. Bedek de beker strak met paraffine film en laat op 4 graden Celsius 's nachts.De volgende dag giet de bekerinhoud in een zeef, droog het weefsel kort op een delicate taak af te vegen en te wegen. Plaats vervolgens de MFP's in hetzelfde bekerglas met een passende formaat roerbalk. Bedek het weefsel met 60 milliliter van een oplossing die 4%ethanol en 0,1% perazijnzuur per gram weefsel bevat.Roer twee uur op kamertemperatuur. Dump de inhoud van de beker in een 0,7 millimeter zeef. Gebruik tangen om het weefsel handmatig te masseren en de inhoud terug in het bekerglas te plaatsen.Was het weefsel door het te bedekken met 60 milliliter 1X PBS per gram weefsel. Roer 15 minuten op kamertemperatuur. Herhaal dit hele wasproces nog een keer.Dump vervolgens de inhoud van de beker in een 0,7 millimeter zeef. Met behulp van tangen, handmatig masseren het weefsel en plaats de inhoud terug in het bekerglas. Was het weefsel door het te bedekken met 60 milliliter gedeïsized water per gram weefsel.Roer 15 minuten op kamertemperatuur. Herhaal dit hele wasproces nog een keer. Droog het gewassen weefsel kort op een delicate taak af te vegen en te wegen.Dump het weefsel en de inhoud in een zeef en gebruik tangen om het weefsel handmatig te masseren. Plaats de inhoud terug in het bekerglas en bedek de weefsels met 60 milliliter van 100%n-propanol per gram weefsel. Roer een uur op kamertemperatuur.Droog vervolgens kort het weefsel op een delicate taak af te vegen en te wegen. Dump het weefsel en de inhoud in een 0,7 millimeter zeef en gebruik tangen om het weefsel handmatig te masseren. Plaats de inhoud terug in het bekerglas en was het weefsel door het te bedekken met 60 milliliter gedeïïstiseerd water per gram weefsel.Roer 15 minuten op kamertemperatuur. Herhaal dit wasproces drie keer. Daarna, kort droog het weefsel op een delicate taak veeg en weeg het.Breng het weefsel naar een gelabelde 15 milliliter buis en bevriezen bij negatieve 80 graden Celsius 's nachts. Vul eerst een ondiepe container met vloeibare stikstof. Haal de monsters uit de vriezer en weeg elke gelyofiele MFP.Plaats een monster in de mortel, gebruik een cryogene handschoen om de mortel in de vloeibare stikstof te houden. Gebruik vervolgens een stamper, bevestigd aan een handoefening, om het monster te frezen. Maal in een minuut intervallen om de voortgang te controleren en verwijder de gehandschoende hand uit de vloeibare stikstof.Herhaal dit freesproces voor alle monsters, zorg ervoor dat de mortel en stamper met ethanol tussen elk monster spuiten en afvegen. Bewaar de monsters in poedervorm in 15 milliliter buizen op negatieve 80 graden Celsius tot klaar voor gebruik. Verwijder om te beginnen de monsters uit de vriezer en ontdooi bij kamertemperatuur.Terwijl de monsters ontdooien, meng pepsine in zoutzuur om een Pepsine-HCL oplossing te vormen. Voeg vervolgens monsterpoeder en de Pepsin-HCL-oplossing toe aan een buis van 15 milliliter, voeg een kleine roerstaaf toe en roer gedurende 48 uur. Daarna, plaats de buizen op ijs voor vijf minuten.Voeg 10X PBS toe aan elk monster, zodat de uiteindelijke oplossing een concentratie van 1X PBS heeft. Voeg vervolgens 10% volume/volume, 0,1 molaire natriumhydroxide toe aan elke oplossing, om pH 7.4 te bereiken, met pH-papier om elke oplossing afzonderlijk te testen. Met behulp van een pH 7.4 gel oplossing, resuspend de pelleted GFP en luciferase gelabeld 4T1 cellen tot een concentratie van 500, 000 of 1, 000, 000 cellen per milliliter gel oplossing.Voeg 16 microliter gelceloplossing toe aan elke put van een 16-put kamerplaat en broed gedurende 30 minuten uit bij 37 graden Celsius. Voeg hierna 100 microliters van complete RPMI-media toe aan elke put. Blijf 48 uur lang uitbroeden bij 37 graden Celsius.Gebruik vervolgens een fluorescentiemicroscoop om de cellen te observeren op een excitatiegolflengte van 519 nanometer en een emissiegolflengte van 618 nanometer. In deze studie worden normale weefselstralingseffecten bestudeerd, met behulp van extracellulaire matrixhydrogels. Hematoxyline en eosine kleuring wordt gebruikt om decellularisatie te bevestigen, door het verlies van kernen en andere sporen van DNA.Terwijl Oil Red O kleuring wordt gebruikt om lipide inhoud te evalueren en het behoud van een dipasite morfologie te bevestigen. De rheologische eigenschappen van de ECM hydrogels worden beoordeeld op 37 graden Celsius. De opslagmodulus is hoger dan het verlies modulus voor alle omstandigheden, het aantonen van stabiele hydrogel vorming.GFP en luciferase gelabeld 4T1 borstcarcinoom cellen worden vervolgens ingekapseld in de hydrogels. Celproliferatie wordt onderzocht door fluorescentiemicroscopie, door analfaescentiemetingen en levensvatbaarheidsvlekken, 48 uur na inkapseling. Bestraalde hydrogels vertonen een stijgende trend in de verspreiding van tumorcellen.Phalloidin conjugaat wordt gebruikt om F-Actin te visualiseren in de ingekapselde cellen. Vergeet niet om de mortel te koelen voordat u het weefsel in de molen plaatst, een warme mortel kan leiden tot onvolledig frezen. Wees voorzichtig bij het hanteren van n-propanal en pepsine, alleen open n-propanal en andere decellularisatiemiddelen onder een chemische kap.Weeg indien mogelijk de pepsine onder een chemische kap, omdat er gevaar is voor inademing. Veranderingen in de ecm-samenstelling na bestraling en decellularisatie kunnen worden geëvalueerd met behulp van massaspectrometrie en Raman-spectroscopie. Bovendien kan de vezelstructuur van de ECM hydrogels worden geanalyseerd door elektronenmicroscopie te scannen.Deze methode heeft het potentieel om te worden uitgebreid om de effecten van straling op te onderzoeken, niet alleen tumorcellen, maar ook immuuncellen, evenals weefsels die stralingsschade ervaren, als gevolg van therapie. Deze decellularisatie techniek zal onderzoekers in staat stellen om de extracellulaire matrix eigenschappen van het weefsel na straling te evalueren, dat is een belangrijke behandeling optie in de meeste vormen van kanker.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

Analyseren van de communicatie tussen monocyten en primaire borstkankercellen in een extracellulaire Matrix extraheren (ECME)-gebaseerde driedimensionaal systeem

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

PET en MRI geleide bestraling van een Glioblastoma Rat-Model met behulp van een Micro-irradiator

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

Imaging benaderingen van evaluaties van toxicologische oxidatieve Stress met behulp van genetisch-gecodeerde Fluorogenic sensoren

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabricage van tong extracellulaire Matrix en reconstructie van tong plaveiselcelcarcinoom In Vitro

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Winning van extracellulaire blaasjes uit hele weefsel

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Driedimensionale bot extracellulaire Matrix Model voor Osteosarcoom

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Celcyclus-specifieke meting van γH2AX en apoptosis na genotoxische stress door flow Cytometrie

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Karakterisering van de effecten van migraine remmers op de invasie van 3D-tumor Spheroid door confocale microscopie met hoge resolutie

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studeren Triple Negatieve Borstkanker met behulp van Orthotopische Borstkanker Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Het bestuderen van de effecten van door tumor uitgescheiden Paracrine liganden op macrofaag activering met behulp van co-cultuur met permeabel membraan ondersteunt

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...