Name: studying normal tissue radiation effects using extracellular matrix hydrogels
Uploaded: 2019-07-24T13:00:00
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Die Autoren danken Dr. Laura L. Bronsart für die Bereitstellung der GFP- und Luziferase-4T1-Zellen, Dr. Edward L. LaGory für Beratung zu 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol Färbung, Dr. Craig L. Duvall für IVIS und Lyophilisatoris verwenden, und Dr. Scott A. Guelcher für Rheometer benutzen. Diese Forschung wurde durch nIH-#R00CA201304 finanziell unterstützt.

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit institutionellen Richtlinien und Protokollen durchgeführt, die vom Vanderbilt University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt wurden.
1. Vorbereitung und Ex-vivo-Bestrahlung von MFPs
<ol><li>Opfern Sie athymische Nu/Nu-Mäuse (8–10 Wochen) mit CO2-Erstickung, gefolgt von zervikaler Dislokation.</li>
	<li>Reinigen Sie die Haut mit 70% Ethanol.</li>
	<li>Sammeln Sie Brustfettpolster (MFPs) von geopferten Mäusen mit vor...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+cancer.">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2018.">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li><li>Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Promote+Circulating+Tumor+Cell-Mediated+Local+Recurrence+Following+Radiation+Therapy+in+Immunosuppressed+Patients.">Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients.</a> Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).</li><li>Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+after+radiation+therapy:+Review+of+the+literature.">Wound healing after radiation therapy: Review of the literature.</a> Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).</li><li>Beachley, V. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+matrix+arrays+for+high+throughput+screening+and+systems+analysis+of+cell+function.">Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function.</a> Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+metastases+obtained+by+culturing+colorectal+cancer+cells+on+tissue-specific+decellularized+scaffolds.">Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).</li><li>Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+naturally+derived+lung+extracellular+matrix+hydrogel.">Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).</li><li>Bonvillain, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Nonhuman+Primate+Model+of+Lung+Regeneration:+Detergent-Mediated+Decellularization+and+Initial+In+Vitro+Recellularization+with+Mesenchymal+Stem+Cells.">A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).</li><li>Brown, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Three+Methods+for+the+Derivation+of+a+Biologic+Scaffold+Composed+of+Adipose+Tissue+Extracellular+Matrix.">Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).</li><li>Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+Hydrogels+from+Pulmonary+Extracellular+Matrix+for+3D+Cell+Culture.">Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).</li><li>Massensini, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration-dependent+rheological+properties+of+ECM+hydrogel+for+intracerebral+delivery+to+a+stroke+cavity.">Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity.</a> Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).</li><li>Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+5+1+facilitates+cancer+cell+invasion+through+enhanced+contractile+forces.">Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces.</a> Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).</li><li>Ahmadzadeh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+two-way+feedback+between+contractility+and+matrix+realignment+reveals+a+nonlinear+mode+of+cancer+cell+invasion.">Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).</li></ol>

Diese Methode der Hydrogelbildung ist weitgehend abhängig von der Menge des Ausgangsgewebes. Murine MFPs sind klein, und der Dezellularisierungsprozess führt zu einer signifikanten Verringerung des Materials (Tabelle 1). Der Prozess kann mit mehr MFPs wiederholt werden, um die Endausbeute zu erhöhen. Das Fräsen ist ein weiterer wichtiger Schritt, der zu Materialverlust führen kann. Andere haben Erfolg mit einer kryogenen Mühle gezeigt, aber dieses Protokoll basiert auf Fräsen über einen Handmört...

Krebs ist gekennzeichnet durch übermäßige Proliferation von Zellen, die Apoptose umgehen und auch metastasieren zu entfernten Stellen1. Brustkrebs ist eine der häufigsten Formen bei Frauen in den USA, mit schätzungsweise 266.000 neuen Fällen und 40.000 Todesfällen im Jahr 20182. Ein besonders aggressiver und schwer zu behandelnder Subtyp ist dreifach negativer Brustkrebs (TNBC), dem es an Östrogenrezeptor (ER), Progesteronrezeptor (PR) und menschlichem epidermalen Wachstumsfaktor (HER2) mangelt. Strahlentherapie wird häufig bei Brustkrebs verwendet, um Resttumorzellen nach Derlumpektomie zu beseitigen, aber über 13% der TNBC-Patienten erleben immer noch ein Rezidiv an der primären Tumorstelle3.
Es ist bekannt, dass die Strahlentherapie wirksam bei der Milderung von Metastasen und Rezidiven ist, da die Kombination von Lumpektomie und Strahlung zu demselben langfristigen Überleben führt wie Mastektomie4. Jedoch, Es hat sich vor kurzem gezeigt, dass Strahlenbehandlung mit lokalen Rezidiv an der primären Tumorstelle in immungeschwächten Einstellungen5,6verbunden ist. Es ist auch bekannt, dass Strahlung die extrazelluläre Matrix (ECM) des normalen Gewebes verändert, indem sie Fibrose induziert7. Daher ist es wichtig, die Rolle von strahlungsinduzierten ECM-Änderungen bei der Diktat des Tumorzellverhaltens zu verstehen.
Dezellularisierte Gewebe wurden als In-vitro-Modelle zur Untersuchung der Krankheit8,9verwendet. Diese dezellularisierten Gewebe bewahren die ECM-Zusammensetzung und rekapitulieren den Komplex in vivo ECM. Dieses dezellularisierte Gewebe ECM kann weiterverarbeitet und verdaut werden, um rekonstituierte ECM-Hydrogele zu bilden, die verwendet werden können, um Zellwachstum und Funktion10,11zu untersuchen. Zum Beispiel dienten injizierbare Hydrogele, die aus dezellularisiertem humanem Lipoaspirat und aus Myokardgewebe gewonnen wurden, als nicht-invasive Methoden der Gewebetechnik, und ein Hydrogel aus Schweinelungengewebe wurde als In-vitro-Testmethode verwendet. mesenchymale Stammzellanhaftung und Lebensfähigkeit12,13,14. Die Auswirkungen normaler Gewebestrahlungsschäden auf die ECM-Eigenschaften wurden jedoch nicht untersucht.
Hydrogele aus dem ECM haben das größte Potenzial für In-vitro-Studien von In-vivo-Phänomenen. Mehrere andere Materialien wurden untersucht, einschließlich Kollagen, Fibrin und Matrigel, aber es ist schwierig, die Zusammensetzung des ECM13synthetisch zu rekapitulieren. Ein Vorteil der Verwendung von ECM-abgeleiteten Hydrogelen ist, dass das ECM die notwendigen Proteine und Wachstumsfaktoren für ein bestimmtes Gewebe enthält14,15. Die Bestrahlung von normalem Gewebe während der Lumpektomie bewirkt signifikante Veränderungen am ECM, und ECM-abgeleitete Hydrogele können verwendet werden, um diesen Effekt in vitro zu untersuchen. Diese Methode könnte zu komplexeren und genaueren In-vitro-Krankheitsmodellen führen.
In dieser Studie haben wir murine Brustfettpolster (MFPs) der Strahlung ex vivo ausgesetzt. Die MFPs wurden dezellularisiert und zu einer Vor-Gel-Lösung hergestellt. Hydrogele wurden mit eingebetteten 4T1-Zellen gebildet, einer murinen TNBC-Zelllinie. Die rheologischen Eigenschaften des Hydrogelmaterials wurden untersucht und die Tumorzelldynamik innerhalb der Hydrogele untersucht. Hydrogele, die aus bestrahlten MFPs hergestellt werden, verbesserten die Tumorzellproliferation. Zukünftige Studien werden andere Zelltypen einbeziehen, um Zell-Zell-Wechselwirkungen im Zusammenhang mit dem Krebsrezidiv nach der Therapie zu untersuchen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>19387</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AR 2000ex Rheometer</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>10D4335</td>
			<td>rheometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcein acetoxymethyl (calcein AM)</td>
			<td>Molecular Probes, Inc.</td>
			<td>C1430</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin Firefly, potassium salt</td>
			<td>Biosynth Chemistry &#38; Biology</td>
			<td>L-8820</td>
			<td>(S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant for Histology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>06522-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin-Y with Phloxine</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>71304</td>
			<td>eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium homodimer</td>
			<td>Molecular Probes, Inc.</td>
			<td>E1169</td>
			<td>ethidium homodimer-1 (EthD-1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td>cryostat embedding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>aqueous based mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeZone 4.5</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7751020</td>
			<td>lyophilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td>blue fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td>bioluminescence imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Science Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td></td>
			<td>delicate task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1130-500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O0625-25G</td>
			<td>1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPS Diagnostics CryoGrinder</td>
			<td>OPS Diagnostics, LLC</td>
			<td>CG-08-02</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Quality Biological, Inc.</td>
			<td>119-069-151</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6887-5G</td>
			<td>pepsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peracetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77240-100ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab176757</td>
			<td>phalloidin conjugate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W294004-1KG-K</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>7301L</td>
			<td>bluing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>7211</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate, 98%</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>JK559522</td>
			<td>deoxycholic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5016</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper, Grade 4</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-110</td>
			<td>grade 4 qualitative filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5-4</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying normal tissue radiation effects using extracellular matrix hydrogels

Strahlende Strahlung ist eine Therapie für Patienten mit dreifach negativem Brustkrebs. Die Wirkung der Strahlung auf die extrazelluläre Matrix (ECM) von gesundem Brustgewebe und ihre Rolle bei der lokalen Rezidivanz an der primären Tumorstelle sind unbekannt. Hier stellen wir eine Methode zur Dezellularisierung, Lyophilisierung und Herstellung von ECM-Hydrogelen aus murinen Brustfettpolstern vor. Die Ergebnisse werden über die Wirksamkeit des Dezellularisierungsprozesses vorgestellt und rheologische Parameter bewertet. GFP- und luziferase-markierte Brustkrebszellen, die in den Hydrogelen verkapselt sind, zeigten eine Zunahme der Proliferation in bestrahlten Hydrogelen. Schließlich wurde Phalloidin-Konjugatfärbung eingesetzt, um die Zytoskelett-Organisation von verkapselten Tumorzellen zu visualisieren. Unser Ziel ist es, eine Methode zur Herstellung von Hydrogelen für In-vitro-Studien zu präsentieren, die die in vivo Brustgewebeumgebung und ihre Reaktion auf Strahlung imitieren, um das Verhalten von Tumorzellen zu untersuchen.

MFPs wurden nach beeimtisiert erwerden, indem das in Abbildung 1Adargestellte Verfahren verwendet wurde. Gezeigt werden MFPs vor der Dezellularisierung (Abbildung 1B) und die Post-Dezellularisierung (Abbildung 1C). Die Dezellularisierung wurde mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung bestätigt, und 1-([4-(Xylyl)xylyl]azo)-2-naphthol Färbung wurde verwendet, um den Lipidgehalt zu bewerten (Abbildung 2). Die rheologisc...

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Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Untersuchung normaler Gewebestrahlungseffekte mit extrazellulären Matrixhydrogelen

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Dezellularisierung und anschließenden Hydrogelbildung von murinen Brustfettpolstern nach ex vivo Bestrahlung dar.

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Dieses Protokoll zeigt, dass Strahlung die extrazellulären Matrixeigenschaften des Fettgewebes im murinen Brustfettpad beeinflusst. Die Zugabe von Strahlung in einem Dezellularisierungsmodell wurde bisher nicht durchgeführt. Diese Technik verwendet mehrere Waschschritte, die jeweils einem einzigartigen chemischen Zweck im Dezellularisierungsprozess dienen.Die Spezifität dieser Technik ermöglicht sanftere chemische Spülungen, um die Gewebeeigenschaften besser zu erhalten. Brustkrebs-Rückfall tritt nach der Therapie auf, vor allem in dreifach negativen Fällen. Die Bewertung, wie die bestrahlte extrazelluläre Matrix das Verhalten von Tumorzellen verändert, führt zu wichtigen Entdeckungen über Rezidivmechanismen.Nach der Bestrahlung von Proben, mit einer Cäsiumquelle, übertragen Sie die bestrahlten MFP und komplette RPMI-Medien in einen Biosicherheitsschrank. Füllen Sie sechs Zentimeter oder 10 Zentimeter Geschirr mit genügend Medien, um die MFP zu versenken. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius, mit 5% Kohlendioxid, für zwei Tage.Platzieren Sie zunächst die MFP es in sechs Zentimeter großen Gerichten mit fünf Millilitern Trypsin-EDTA-Lösung. Die Teller mit 70% Ethanol besprühen und abwischen und eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius brüten. Verwenden Sie 0,7 Milliliter-Siebe, um die MFP mit entionisiertem Wasser zu waschen, indem Sie dreimal Wasser über das Gewebe gießen.Verwenden Sie Zangen, um das Gewebe zwischen den Wärten manuell zu massieren. Als nächstes trocknen Sie das Gewebe bei einem empfindlichen Aufgabentuch kurz und wiegen. Legen Sie das getrocknete Gewebe in einen vorautoklavierten Becher, der einen entsprechend großen Rührstab enthält, und bedecken Sie das Gewebe mit 60 Millilitern 3%t-Octylphenoxypolyethethanol pro Gramm Gewebe.Eine Stunde bei Raumtemperatur umrühren. Dann den Inhalt des Bechers in ein Sieb werfen. Spülen Sie den Becher mit entionisiertem Wasser und gießen Sie es auf das Gewebe.Wiederholen Sie diesen Spülvorgang zwei weitere Male, stellen Sie sicher, dass Zangen verwenden, um das Gewebe zwischen den Spülungen manuell zu massieren. Danach das Gewebe bei einem empfindlichen Aufgabentuch kurz trocknen und wiegen. Legen Sie die Gewebe und die Rührstäbe wieder in die gleichen Becher und bedecken Sie sie mit 60 Millilitern 4%Desoxycholsäure pro Gramm Gewebe.Eine Stunde bei Raumtemperatur umrühren. Als nächstes den Inhalt des Bechers in ein Netzsieb werfen, den Becher mit entionisiertem Wasser abspülen und auf das Gewebe gießen. Wiederholen Sie diesen Spülvorgang zwei weitere Male, stellen Sie sicher, dass Zangen verwenden, um das Gewebe zwischen den Spülungen manuell zu massieren.Das spülende Gewebe auf einem empfindlichen Aufgabentuch kurz trocknen und abwischen. Legen Sie die getrockneten Gewebe in das gleiche Becherglas, zusammen mit frischem deionisiertem Wasser, ergänzt mit 1%Penicillin-Streptomycin. Den Becher fest mit Paraffinfolie bedecken und bei 4 Grad Celsius über Nacht verlassen.Am nächsten Tag den Becherinhalt in ein Sieb abtropfen lassen, das Gewebe bei einem empfindlichen Aufgabentuch kurz trocknen und wiegen. Legen Sie dann die MFP es in den gleichen Becher mit einer entsprechenden Größe Rührstange. Bedecken Sie das Gewebe mit 60 Millilitern einer Lösung, die 4% Ethanol und 0,1% Peressigsäure pro Gramm Gewebe enthält.Bei Raumtemperatur zwei Stunden rühren. Den Inhalt des Bechers in ein 0,7-Millimeter-Sieb zu werfen. Verwenden Sie Zangen, um das Gewebe manuell zu massieren und den Inhalt wieder in den Becher zu legen.Waschen Sie das Gewebe, indem Sie es mit 60 Millilitern 1X PBS pro Gramm Gewebe bedecken. 15 Minuten bei Raumtemperatur umrühren. Wiederholen Sie diesen gesamten Waschvorgang noch einmal.Als nächstes entsorgen Sie den Inhalt des Bechers in ein 0,7-Millimeter-Sieb. Mit Zangen das Gewebe manuell massieren und den Inhalt wieder in den Becher legen. Waschen Sie das Gewebe, indem Sie es mit 60 Milliliter entionisiertem Wasser pro Gramm Gewebe bedecken.15 Minuten bei Raumtemperatur umrühren. Wiederholen Sie diesen gesamten Waschvorgang noch einmal. Das gewaschene Gewebe auf einem empfindlichen Aufgabentuch kurz trocknen und wiegen.Dump das Gewebe und den Inhalt in ein Sieb und verwenden Zange, um das Gewebe manuell zu massieren. Legen Sie den Inhalt wieder in den Becher und decken Sie das Gewebe mit 60 Millilitern 100%n-Propanol pro Gramm Gewebe ab. Eine Stunde bei Raumtemperatur umrühren.Dann trocknen Sie das Gewebe auf einem empfindlichen Aufgabentuch kurz und wiegen Sie es. Dump das Gewebe und den Inhalt in ein 0,7-Millimeter-Sieb und verwenden Zange, um das Gewebe manuell zu massieren. Legen Sie den Inhalt wieder in das Becherglas und waschen Sie das Gewebe, indem Sie es mit 60 Milliliter entionisiertem Wasser pro Gramm Gewebe bedecken.15 Minuten bei Raumtemperatur umrühren. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang dreimal. Danach das Gewebe bei einer heiklen Aufgabe kurz trocknen und abwischen.Übertragen Sie das Gewebe in eine beschriftete 15-Milliliter-Röhre und frieren Sie bei negativen 80 Grad Celsius über Nacht ein. Füllen Sie zunächst einen flachen Behälter mit flüssigem Stickstoff. Entfernen Sie die Proben aus dem Gefrierschrank und wiegen Sie jedes lyophilisierte MFP.Legen Sie eine Probe in den Mörtel, verwenden Sie einen kryogenen Handschuh, um den Mörtel im flüssigen Stickstoff zu halten. Verwenden Sie dann einen Stößel, der an einem Handbohrer befestigt ist, um die Probe zu fräsen. Fräsen Sie in einem Minutentakt, um den Fortschritt zu überprüfen und die handgeliebte Hand aus dem flüssigen Stickstoff zu entfernen.Wiederholen Sie diesen Fräsvorgang für alle Proben, und achten Sie darauf, den Mörtel und den Stößel mit Ethanol zwischen jeder Probe zu sprühen und abzuwischen. Bewahren Sie die pulverförmigen Proben in 15 Milliliter-Rohren bei minus 80 Grad Celsius auf, bis sie einsatzbereit sind. Zunächst die Proben aus dem Gefrierschrank nehmen und bei Raumtemperatur auftauen.Während die Proben auftauen, mischen Sie Pepsin in Salzsäure, um eine Pepsin-HCL-Lösung zu bilden. Als nächstes Probenpulver und die Pepsin-HCL-Lösung in ein 15-Milliliter-Rohr geben, einen kleinen Rührstab hinzufügen und 48 Stunden rühren. Danach die Rohre für fünf Minuten auf Eis legen.Fügen Sie jeder Probe 10X PBS hinzu, sodass die endgültige Lösung eine Konzentration von 1X PBS aufweist. Fügen Sie dann 10% Volumen/Volumen, 0,1 molches Natriumhydroxid zu jeder Lösung hinzu, um pH 7,4 zu erreichen, wobei pH-Papier verwendet wird, um jede Lösung einzeln zu testen. Mit einer pH 7,4-Gel-Lösung setzen Sie das pelletierte GFP und die mit 4T1-Zellen gekennzeichnete Luziferase auf eine Konzentration von entweder 500, 000 oder 1 000 000 Zellen pro Milliliter Gellösung aus.Fügen Sie 16 Mikroliter Gelzelllösung zu jedem Brunnen einer 16-Well-Kammerrutsche hinzu und brüten bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Danach fügen Sie 100 Mikroliter komplette RPMI-Medien zu jedem Brunnen hinzu. Weiter bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden inkubieren.Verwenden Sie dann ein Fluoreszenzmikroskop, um die Zellen bei einer Anregungswellenlänge von 519 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 618 Nanometern zu beobachten. In dieser Studie werden normale Gewebestrahlungseffekte mit extrazellulären Matrixhydrogelen untersucht. Hämatoxylin und Eosin Färbung wird verwendet, um die Dezellularisierung zu bestätigen, durch den Verlust von Kernen und anderen Spuren von DNA.Während Oil Red O Färbung verwendet wird, um den Lipidgehalt zu bewerten und die Retention einer Dipasitmorphologie zu bestätigen. Die rheologischen Eigenschaften der ECM-Hydrogele werden bei 37 Grad Celsius bewertet. Der Speichermodul ist höher als der Verlustmodul für alle Bedingungen, was eine stabile Hydrogelbildung zeigt.GFP und Luziferase mit der Bezeichnung 4T1-Mammakarzinomzellen werden dann in den Hydrogelen verkapselt. Die Zellproliferation wird 48 Stunden nach der Verkapselung durch Fluoreszenzmikroskopie, durch Beleuchtungsmessung und Lebensfähigkeitsfärbung untersucht. Bestrahlte Hydrogele zeigen einen zunehmenden Trend bei der Tumorzellproliferation.Phalloidin-Konjugat wird verwendet, um F-Actin in den gekapselten Zellen zu visualisieren. Denken Sie daran, den Mörtel zu kühlen, bevor Sie das Gewebe in der Mühle platzieren, ein warmer Mörtel kann zu unvollständigem Fräsen führen. Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit n-Propanal und Pepsin, nur öffnen n-propanal und andere dezellularisationäre Mittel unter einer chemischen Haube.Wiegen Sie das Pepsin nach Möglichkeit unter einer chemischen Haube, da die Gefahr des Einatmens besteht. ECM-Zusammensetzungsänderungen nach Bestrahlung und Dezellularisierung können mittels Massenspektrometrie und Raman-Spektroskopie ausgewertet werden. Darüber hinaus kann die Faserstruktur der ECM-Hydrogele durch Rasterelektronenmikroskopie analysiert werden.Diese Methode hat das Potenzial, erweitert zu werden, um die Auswirkungen von Strahlung auf nicht nur Tumorzellen, sondern auch Immunzellen, sowie Gewebe, die Strahlenschäden erleben, als Ergebnis der Therapie zu untersuchen. Diese Dezellularisierungstechnik wird es den Forschern ermöglichen, die extrazellulären Matrixeigenschaften des Gewebes nach der Strahlung zu bewerten, was bei den meisten Krebsarten eine wichtige Behandlungsoption ist.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

Analyse der Kommunikation zwischen Monozyten und primären Brustkrebs-Zellen in einer extrazellulären Matrix (ECME) extrahieren-basiertes dreidimensionales System

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

Forschung

Krebsforschung

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

PET und MRT geführte Bestrahlung von einem Glioblastom Rattenmodell mit einer Mikro-Moorpackung

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

Imaging-Ansätze zur Bewertung der toxikologischen oxidativen Stress mit genetisch codierte Fluorogenic Sensoren

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Herstellung von Zunge extrazellulären Matrix und Rekonstitution der Zunge Squamous Zelle Krebsgeschwür In-vitro-

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Gewinnung von extrazellulären Vesikel aus ganze Gewebe

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Dreidimensionale extrazelluläre Matrix Knochenmodell für Osteosarkom

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Zellzyklusspezifische Messung von H2AX und Apoptose nach genotoxischem Stress durch Durchflusszytometrie

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Charakterisierung der Auswirkungen von Migrastatischen Inhibitoren auf die 3D-Tumorsphäroid-Invasion durch hochauflösende Konfokalmikroskopie

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studieren von dreifach negativem Brustkrebs mit orthotopischem Brustkrebsmodell

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Untersuchung der Auswirkungen von tumorgeheimen Parakrinliganden auf die Makrophagenaktivierung mit Co-Culture mit permeableMembranen unterstützt

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...