Name: studying normal tissue radiation effects using extracellular matrix hydrogels
Uploaded: 2019-07-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels at JoVE.com

המחברים מודים לד ר לאורה ל. ברוסארט על מתן התאים הגFP והלוציפריאז-4T1, ד ר אדוארד ל. לייורי לקבלת ייעוץ ב-1-([4-(Xylyzo) "אזו" -2-נפתלי כתמים, ד ר קרייג ל. דובאל עבור איביס וליטוליזר שימוש, וד ר סקוט א. גוכר לראומטר השתמש. מחקר זה היה נתמך כספית על ידי מלגת NIHR00CA201304.

לימודי בעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ולפרוטוקולים המוסדיים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת ואנדרבילט.
1. הכנה והקרנה vivo ex של MFPs
<ol><li>הקריבו עכברים Nu/Nu (8 – 10 שבועות) באמצעות שיתוף2 חנק ואחריו פריקה צוואר הרחם.</li>
	<li>לנקות את העור באמצעות 70% אתנ...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+cancer.">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2018.">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li><li>Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregional+recurrence+after+breast+cancer+surgery:+a+systematic+review+by+receptor+phenotype.">Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).</li><li>Miller, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+treatment+and+survivorship+statistics,+2016.">Cancer treatment and survivorship statistics, 2016.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).</li><li>Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Circulating+Breast+Cancer+Cells+Is+Stimulated+by+Radiotherapy.">Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy.</a> Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).</li><li>Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Promote+Circulating+Tumor+Cell-Mediated+Local+Recurrence+Following+Radiation+Therapy+in+Immunosuppressed+Patients.">Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients.</a> Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).</li><li>Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+after+radiation+therapy:+Review+of+the+literature.">Wound healing after radiation therapy: Review of the literature.</a> Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).</li><li>Beachley, V. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+matrix+arrays+for+high+throughput+screening+and+systems+analysis+of+cell+function.">Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function.</a> Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+metastases+obtained+by+culturing+colorectal+cancer+cells+on+tissue-specific+decellularized+scaffolds.">Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).</li><li>Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+hydrogels+from+decellularized+tissues:+Structure+and+function.">Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function.</a> Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).</li><li>Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+and+ECM-like+materials+&#8212;+Biomaterials+for+applications+in+regenerative+medicine+and+cancer+therapy.">ECM and ECM-like materials &#8212; Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).</li><li>Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+hydrogel+scaffold+from+decellularized+human+lipoaspirate.">Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate.</a> Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).</li><li>Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+derived+myocardial+matrix+as+an+injectable+scaffold+for+cardiac+tissue+engineering.">Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering.</a> Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).</li><li>Pouliot, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+naturally+derived+lung+extracellular+matrix+hydrogel.">Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).</li><li>Bonvillain, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Nonhuman+Primate+Model+of+Lung+Regeneration:+Detergent-Mediated+Decellularization+and+Initial+In+Vitro+Recellularization+with+Mesenchymal+Stem+Cells.">A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).</li><li>Brown, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Three+Methods+for+the+Derivation+of+a+Biologic+Scaffold+Composed+of+Adipose+Tissue+Extracellular+Matrix.">Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).</li><li>Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+Hydrogels+from+Pulmonary+Extracellular+Matrix+for+3D+Cell+Culture.">Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).</li><li>Massensini, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration-dependent+rheological+properties+of+ECM+hydrogel+for+intracerebral+delivery+to+a+stroke+cavity.">Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity.</a> Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).</li><li>Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+5+1+facilitates+cancer+cell+invasion+through+enhanced+contractile+forces.">Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces.</a> Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).</li><li>Ahmadzadeh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+two-way+feedback+between+contractility+and+matrix+realignment+reveals+a+nonlinear+mode+of+cancer+cell+invasion.">Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).</li></ol>

שיטה זו של יצירת הידרוג'ל תלויה במידה רבה בכמות של הרקמה ההתחלתית. מוריין MFPs הם קטנים, והתהליך הdecellularization מביא לירידה משמעותית בחומר (שולחן 1). התהליך יכול לחזור עם יותר MFPs כדי להגדיל את התשואה הסופית. כרסום הוא צעד חשוב נוסף שעלול לגרום לאובדן החומר. אחרים הראו הצלחה עם טחנת קריוגני...

סרטן מאופיין התפשטות עודפת של תאים שיכולים להתחמק אפופטוזיס וגם גרורות לאתרים מרוחקים1. סרטן השד היא אחת הצורות הנפוצות ביותר בקרב הנקבות בארה ב, עם מוערך 266,000 מקרים חדשים ו 40,000 מקרי מוות ב 20182. אגרסיבי במיוחד וקשה לטיפול סוג המשנה הוא סרטן שד שלילי משולשת (TNBC), אשר חסר קולטן אסטרוגן (ER), קולטן פרוגסטרון (PR), ואת גורם הצמיחה באפידרמיס האנושית (HER2). טיפול בהקרנות משמש בדרך כלל בסרטן השד כדי למנוע תאים סרטניים שיורית בעקבות כריתת גוש, אבל מעל 13% מהחולים TNBC עדיין לחוות הישנות באתר הגידול העיקרי3.
ידוע כי טיפול בהקרנות יעיל ב גרורות והישנות משום שילוב של כריתת הגוש ותוצאות הקרינה באותה הישרדות לטווח ארוך כמו כריתת שד4. עם זאת, הוא הוכח לאחרונה כי הטיפול בקרינה קשורה הישנות מקומית לאתר הגידול העיקרי בהגדרות החיסונית5,6. כמו כן, ידוע כי הקרינה משנה את מטריצה החילוץ (ECM) של רקמות נורמליות על ידי גרימת פיברוזיס7. לכן, חשוב להבין את התפקיד של שינויי קרינה ECM המושרה בכתיב התנהגות תא הגידול.
Decellularized רקמות שימשו מודלים מבחנה ללמוד מחלה8,9. הרקמות הdecellularized האלה שומרות על הלחנה של ECM ומכואיאת הקומפלקס בvivo ECM. זה decellularized רקמת ecm יכול להיות נוסף מעובד מתעכל לטופס מחודשת ידרו ecm הידרוג שיכול לשמש כדי ללמוד צמיחת תאים פונקציה10,11. לדוגמה, הידרוג זריקות המופק decellularized ליפוף האדם ומרקמת שריר הלב שימש שיטות שאינן פולשני של הנדסת רקמות, ו הידרוג'ל נגזר רקמת ריאות חזירי היה מנוצל כשיטת מחוץ גופית של בדיקות תא גזע של mesenchymal המצורף והכדאיות12,13,14. ההשפעה של נזק לקרינה נורמלית רקמות על מאפייני ECM, עם זאת, לא נחקרו.
הידרולים הנגזרים מ-ECM יש את הפוטנציאל הגדול ביותר לחקר מבחנה בתופעות vivo. כמה חומרים אחרים נחקרו, כולל קולגן, פיברומין, ו מטריצות, אבל קשה לעשות בצורה מלאכותית את הרכב של ECM13. יתרון של שימוש ב-ecm הידרוג נגזר הוא כי ecm מכיל את החלבונים הדרושים וגורמי גדילה עבור רקמה מסוימת14,15. הקרנה של רקמה נורמלית במהלך כריתת הגוש גורמת לשינויים משמעותיים ב-ECM, וניתן להשתמש בהידרוג הנגזר של ECM כדי ללמוד את האפקט הזה באופן מתורבת. שיטה זו יכולה להוביל ליותר מורכב ומדויק יותר במודלים של מחלות חוץ-גופית.
במחקר זה, אנו חשופים שומן החלב מורטין רפידות (MFPs) כדי קרינה ex vivo. MFPs היו decellularized והפכו לפתרון טרום ג'ל. הידרולים הוקמה עם תאים 4T1 מוטבע, קו תא מוראן TNBC. התכונות הרטיאוולוגיות של חומר ההידרוג'ל נבדקו, והדינמיקה של תאי הגידול הוערכו בתוך ההידרוג'לים. הידרולים המציא התפשטות MFPs לקרינה משופרת תא הגידול. מחקרים עתידיים לשלב סוגי תאים אחרים כדי ללמוד אינטראקציות תא תאים בהקשר של הישנות סרטן בעקבות הטיפול.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>19387</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AR 2000ex Rheometer</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>10D4335</td>
			<td>rheometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcein acetoxymethyl (calcein AM)</td>
			<td>Molecular Probes, Inc.</td>
			<td>C1430</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin Firefly, potassium salt</td>
			<td>Biosynth Chemistry &#38; Biology</td>
			<td>L-8820</td>
			<td>(S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant for Histology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>06522-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin-Y with Phloxine</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>71304</td>
			<td>eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium homodimer</td>
			<td>Molecular Probes, Inc.</td>
			<td>E1169</td>
			<td>ethidium homodimer-1 (EthD-1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td>cryostat embedding medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>aqueous based mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeZone 4.5</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7751020</td>
			<td>lyophilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td>blue fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td>bioluminescence imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Science Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td></td>
			<td>delicate task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1130-500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O0625-25G</td>
			<td>1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPS Diagnostics CryoGrinder</td>
			<td>OPS Diagnostics, LLC</td>
			<td>CG-08-02</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>Quality Biological, Inc.</td>
			<td>119-069-151</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6887-5G</td>
			<td>pepsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peracetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77240-100ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab176757</td>
			<td>phalloidin conjugate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W294004-1KG-K</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>7301L</td>
			<td>bluing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>7211</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate, 98%</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>JK559522</td>
			<td>deoxycholic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5016</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper, Grade 4</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-110</td>
			<td>grade 4 qualitative filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5-4</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying normal tissue radiation effects using extracellular matrix hydrogels

קרינה היא טיפול עבור חולים עם סרטן שד שלילי משולשת. ההשפעה של הקרינה על מטריצה החילוץ (ECM) של רקמת השד בריא תפקידה בהישנות המקומי באתר הגידול העיקרי אינם ידועים. כאן אנו מציגים שיטה לdecellularization, ליטוטיזציה ולייצור של הידרוג ECM הנגזרים מרפידות שומן החלב של מורלין. תוצאות מוצגות על האפקטיביות של התהליך decellularization, ופרמטרים rheological העריכו. GFP-ו לוציפראז-התווית תאים סרטן השד כדוריות בהידרוג הפגינו גידול התפשטות של הידרוג הוקרן. לבסוף, phalloidin כתמים המשלים היה מועסק להמחיש את הארגון השלד של תאים סרטניים כימוס. המטרה שלנו היא להציג שיטה עבור בדיית הידרולים עבור מחקר מתורבת המחקים את הסביבה רקמת השד vivo התגובה שלה קרינה על מנת ללמוד התנהגות תא הגידול.

MFPs היו decellularized בעקבות הקרנה באמצעות ההליך המוצג באיור 1A. MFPs pre-decellularization (איור 1B) ו-post-Decellularization (איור 1b) מוצגים. Decellularization אושרה באמצעות המטאוקסילין ו-אאוזין (H & E) כתמים, ו-1-([4-(Xylylazo) "אזו" -2-נפתלי מכתים שימש להערכת תוכן השומנים (איור 2). תכונו...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels at JoVE.com

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

לימוד השפעות קרינת העור נורמלי באמצעות מטריקס הידרותאי הידרו

פרוטוקול זה מציג שיטה לdecellularization והיווצרות הידרוג'ל עוקבות אחר הקרנה של שומן החלב של מורלין לאחר ההקרנה vivo ex.

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

פרוטוקול זה מראה כי קרינה משפיעה על תכונות מטריצה חוץ תאית של רקמת שומן כרית שומן מומרי מורין. תוספת הקרינה במודל דקלולריזציה לא נעשתה בעבר. טכניקה זו משתמשת במספר שלבי כביסה שכל אחד מהם משרת מטרה כימית ייחודית בתהליך ההדקולריזציה.הספציפיות של טכניקה זו מאפשרת שטיפות כימיות עדינות יותר, כדי לשמר טוב יותר את תכונות הרקמה. הישנות סרטן השד מתרחשת לאחר הטיפול, במיוחד במקרים שליליים משולשים. הערכת האופן שבו המטריצה החוץ-תאית המוקרנת משנה את התנהגות תאי הגידול תוביל לתגליות חשובות על מנגנוני הישנות.לאחר הקרנה של דגימות, באמצעות מקור צסיום, להעביר את MFP מוקרן של להשלים את התקשורת RPMI לתוך ארון biosafety. מלאו 6 ס"מ או 10 ס"מ במנות עם מספיק מדיה כדי להטביע את ה-MFP. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, עם 5% פחמן דו חמצני, במשך יומיים.ראשית, מניחים את ה-MFP במנות של שישה סנטימטרים עם חמישה מיליליטר של פתרון טריפסין-EDTA. מרססים ומנגבים את הכלים ב-70% אתנול ודגירה ב-37 מעלות במשך שעה. השתמש מסננים 0.7 מיליליטר לשטוף את MFP של עם מים deionized, על ידי שפיכת מים על הרקמה שלוש פעמים.השתמש מטליות לעסות באופן ידני את הרקמה בין שטיפות. לאחר מכן, לייבש בקצרה את הרקמה על לנגב משימה עדינה ולשקול אותו. מניחים את הרקמות המיובשת בסקילר טרום-אוטולאבי, המכיל בר ערבוב בגודל מתאים ומכסים את הרקמות ב-60 מיליליטר של 3%t-octylphenoxypolyoxyethanol לגרם של רקמה.מערבבים במשך שעה בטמפרטורת החדר. ואז לזרוק את תכולתו של המקה לתוך מסננת. לשטוף את המק עם מים deionized ויוצקים את זה על הרקמות.חזור על תהליך שטיפה זה פעמיים נוספות, הקפד להשתמש במדפים לעסות ידנית את הרקמה בין שטיפות. לאחר מכן, לייבש בקצרה את הרקמה על לנגב משימה עדינה ולשקול. מניחים את הרקמות ואת הסורגים מערבבים בחזרה לתוך אותם מקורים לכסות אותם עם 60 מיליליטר של 4% חומצה deoxycholic לכל גרם של רקמה.מערבבים בטמפרטורת החדר במשך שעה. לאחר מכן, לזרוק את תכולת הבקבוק לתוך מסננת רשת, לשטוף את המקם עם מים deionized ויוצקים את זה על הרקמות. חזור על תהליך שטיפה זה פעמיים נוספות, הקפד להשתמש במדפים לעסות ידנית את הרקמה בין שטיפות.ייבשו בקצרה את הרקמה הרכה על מגבון משימה עדין ושקלו אותה. מניחים את הרקמות היבשות באותה מקור, יחד עם מים טריים deionized, בתוספת 1% פניצילין-סטרפטומיצין. מכסים את הפקע בחוזקה עם סרט פרפין ומשאירים ב 4 מעלות צלזיוס לילה.למחרת לנקז את תכולת התוך המקור לתוך מסננת, לייבש בקצרה את הרקמה על לנגב משימה עדינה ולשקול אותו. לאחר מכן, מניחים את ה-MFP באותו מקור עם בר ערבוב בגודל מתאים. מכסים את הרקמה עם 60 מיליליטר של פתרון המכיל 4%אתנול ו 0.1% חומצה peracetic לגרם של רקמה.מערבבים בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. השלך את תכולת הקוסם לתוך מסננת 0.7 מילימטר. השתמש מלקחיים כדי לעסות באופן ידני את הרקמה ולמקם את התוכן בחזרה לתוך התוך המק.לשטוף את הרקמה על ידי כיסוי זה עם 60 מיליליטר של 1X PBS לגרם של רקמה. מערבבים בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. חזור על כל תהליך הכביסה הזה עוד פעם אחת.לאחר מכן, השלך את תכולת הקוסם לתוך מסננת 0.7 מילימטר. באמצעות מלקחיים, לעסות באופן ידני את הרקמה ולמקם את התוכן בחזרה לתוך המק. לשטוף את הרקמה על ידי כיסוי זה עם 60 מיליליטר של מים deionized לכל גרם של רקמה.מערבבים בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. חזור על כל תהליך הכביסה הזה עוד פעם אחת. לייבש בקצרה את הרקמה שטף על לנגב משימה עדינה ולשקול אותו.לזרוק את הרקמה ואת התוכן לתוך מסננת ולהשתמש מדפים לעסות באופן ידני את הרקמה. מניחים את התוכן בחזרה לתוך הקנים ולכסות את הרקמות עם 60 מיליליטר של 100% n-propanol לגרם של רקמה. מערבבים בטמפרטורת החדר במשך שעה.לאחר מכן, לייבש בקצרה את הרקמה על לנגב משימה עדינה ולשקול אותו. לזרוק את הרקמה ואת התוכן לתוך מסננת 0.7 מילימטר ולהשתמש מטלות לעסות את הרקמה באופן ידני. מניחים את התוכן בחזרה לתוך המקור ולשטוף את הרקמה על ידי כיסוי זה עם 60 מיליליטר של מים deionized לגרם של רקמה.מערבבים בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. חזור על תהליך שטיפה זה שלוש פעמים. לאחר מכן, לייבש בקצרה את הרקמה על לנגב משימה עדינה ולשקול אותו.מעבירים את הרקמה לצינור 15 מיליליטר מסומנים ומקפיאים ב-80 מעלות צלזיוס שליליות במהלך הלילה. ראשית, למלא מיכל רדוד עם חנקן נוזלי. מוציאים את הדגימות מהמקפיא ומשקללים כל MFP ליופילי.מניחים דגימה אחת במכתש, משתמשים בכפפה קריוגנית כדי להחזיק את המרגמה בחנקן הנוזלי. לאחר מכן, השתמש עלה, מחובר מקדחה ידנית, כדי לטחן את המדגם. טחנה במרווחים של דקה אחת כדי לבדוק את ההתקדמות ולהסיר את היד הכפפות מהחנקן הנוזלי.חזור על תהליך כרסום זה עבור כל הדגימות, הקפד לרסס ולנגב את המרגמה ועלי עם אתנול בין כל מדגם. לאחסן את דגימות אבקת 15 צינורות מיליליטר ב 80 מעלות צלזיוס שלילי עד מוכן לשימוש. כדי להתחיל, להסיר את הדגימות מהמקפיא ולהפשיר בטמפרטורת החדר.בזמן שהדגימות מפשירות, מערבבים פפסין לחומצה הידרוכלורית כדי ליצור פתרון פפסין-HCL. לאחר מכן, הוסיפו אבקת דגימה ופתרון פפסין-HCL לצינור של 15 מיליליטר, הוסיפו בר ערבוב קטן ומערבבים במשך 48 שעות. לאחר מכן, מניחים את הצינורות על קרח במשך חמש דקות.הוסף PBS 10X לכל מדגם, כך הפתרון הסופי יש ריכוז של PBS 1X. לאחר מכן, להוסיף 10% נפח / נפח, 0.1 נתרן הידרוקסידי טוחן לכל פתרון, כדי להגיע pH 7.4, באמצעות נייר pH כדי לבדוק כל פתרון בנפרד. באמצעות פתרון ג'ל pH 7.4, להשתמש מחדש GFP גלולה ו luciferase שכותרתו 4T1 תאים לריכוז של 500, 000 או 1, 000, 000 תאים למיליליטר של פתרון ג'ל.הוסיפו 16 מיקרוליטרים של תוסף תא ג'ל לכל באר של מגלשת תאים של 16 בארות ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטרים של מדיית RPMI מלאה לכל באר. ממשיכים להתהגר ב-37 מעלות במשך 48 שעות.לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להתבונן בתאים באורך גל של 519 ננומטר ואורך גל פליטה של 618 ננומטר. במחקר זה, אפקטים קרינת רקמות נורמלית נחקרים, באמצעות הידרוג'ל מטריצה חוץ תאית. המטוקסילין וכתמי אאוסין משמשים לאישור דקלולריזציה, באמצעות אובדן גרעינים ועקבות אחרות של DNA.בעוד כתמי שמן אדום O משמש כדי להעריך את תוכן השומנים ולאשר את השמירה של מורפולוגיה דיפאסיט. המאפיינים הריאולוגיים של הידרוג'ל ECM מוערכים ב 37 מעלות צלזיוס. מודולוס האחסון גבוה יותר ממודולוס ההפסד לכל התנאים, ומדגים היווצרות הידרוג'ל יציבה.GFP ו לוציפראז שכותרתו 4T1 תאי קרצינומה קמע לאחר מכן אנקפסולציה הידרוג'לים. התפשטות התא נבדקת על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, על ידי מדידות illuminescence וכתמי כדאיות, 48 שעות לאחר אנקפסולציה. הידרוג'ל מוקרן להראות מגמה גוברת התפשטות תאים סרטניים.פלואידין תולה משמש כדי לדמיין F-Actin בתאים אנקפסולציה. זכור לקרר את המרגמה לפני הצבת הרקמה בתוך הטחנה, מרגמה חמה עלולה להוביל כרסום שלם. נקוט זהירות בעת טיפול n-propanal ופפסין, רק n-propanal פתוח וסוכנים decellularizationary אחרים תחת מכסה המנוע כימי.במידת האפשר, לשקול את הפפסין מתחת למכסה המנוע הכימי, כפי שקיים סכנה של שאיפה. שינויי הרכב ECM לאחר הקרנה ודקלולריזציה ניתן להעריך באמצעות ספקטרומטריית מסה ספקטרוסקופיה אמן. בנוסף, ניתן לנתח את מבנה הסיבים של הידרוג'לים ECM על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים.שיטה זו יש פוטנציאל להיות מורחב כדי לבחון את ההשפעות של קרינה על, לא רק תאים סרטניים אלא גם תאים חיסוניים, כמו גם רקמות לחוות נזק לקרינה, כתוצאה של טיפול. טכניקת דקלולריזציה זו תאפשר לחוקרים להעריך את תכונות המטריצה החוץ תאית של הרקמה בעקבות קרינה, שהיא אפשרות טיפול חשובה ברוב סוגי הסרטן.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

ניתוח התקשורת בין ומונוציטים ו תאים סרטניים בשד ראשי במטריצה חוץ-תאית לחלץ (ECME)-מבוסס מערכת תלת מימדי

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

PET ו- MRI מודרך הקרנה של מודל גליובלסטומה עכברים באמצעות מיקרו-בעוצמה

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

הדמיה גישות הערכות של רעילות לחץ חימצוני באמצעות חיישנים Fluorogenic מקודד גנטית

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

ייצור של הלשון מטריצה חוץ-תאית, שיחזור של הלשון קרצינומה של תאים קשקשיים במבחנה

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

מיצוי של שלפוחית חוץ-תאית מרקמות כל

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

עצם תלת-ממדי מטריצה חוץ-תאית מודל אוסטאוסרקומה

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

מחזור התא-מדידה ייחודית של γH2AX ו אפופטוזיס לאחר הלחץ הגנוטוקסיידי זרימה Cyהמטריה

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

אפיון ההשפעות של מעכבי Migrastatic על הפלישה 3D הגידול ספרואיד על ידי מיקרוסקופ Confocal וקד ברזולוציה גבוהה

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

לומדת משולשת סרטן השד שלילי באמצעות אורתובנושא שד סרטן השד מודל

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

לומד את ההשפעות של הקרנף המופרש ליגרין המקרופאג הפעלה באמצעות תרבות שיתוף עם ממברנה חדיר תומך

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...